Analyse van oxidatieve stress in murine intestinale organoïden met behulp van reactieve zuurstof soortgevoelige fluorogene sonde

Deze methode is een waardevol hulpmiddel op het gebied van cellulaire biologie voor het beoordelen van cellulaire ROS-niveaus in levende primaire cellen die in vitro zijn gekweekt als organoïden met behulp van een fluorogene sonde. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat ROS kwalitatief kan worden gevisualiseerd in intacte darmorganoïden door microscopie en kwantitatief geanalyseerd in gedissocieerde cellen door flowcytometrie met behulp van 96-well platen. Deze methode kan worden toegepast op andere organoïde modellen en alternatieve fluorescerende sensoren kunnen worden gebruikt om verschillende cellulaire routes te analyseren.

Voordat dit protocol voor de eerste keer wordt toegepast, moet de experimentator vertrouwd raken met de organoïde cultuur en passaging. Hoewel ons protocol goed is aangepast aan screeningsbenaderingen, moeten beginners beginnen met een paar voorbeelden. Sophie Dulauroy, een ingenieur van het laboratorium, demonstreert de procedure.

Na het offeren van een 8 tot 10 weken oude Lgr5-GFP-muis, verzamel je vijf tot acht centimeter van het jejunum-omvattende gebied tussen de twaalfvingerige darm en het ileum en plaats je het in koude DPBS aangevuld met antibiotica op ijs. Reinig vervolgens het darmgehalte door te spoelen met vijf tot 10 milliliter koude DPBS met antibiotica. Gebruik vervolgens een kogelpuntschaar, open de darm in de lengterichting en breng met een tang het weefsel over in een petrischaal met koude DPBS met antibiotica.

Schud het weefsel in de schaal om het af te spoelen. Pak vervolgens de darm door aspiratie met behulp van een plastic Pasteur-pipet en breng deze over in een buis van 15 milliliter met 10 milliliter koude 10 millimolar EDTA. Keer de buis drie keer om en incubeer deze gedurende 10 minuten op ijs.

Breng na de incubatie het weefsel gedurende twee minuten over in een buis met 10 milliliter DPBS en vortex. Voeg onmiddellijk 10 microliter van de fractie toe in een petrischaaltje en gebruik een microscoop om de kwaliteit van de fractie te beoordelen. Na twee overdrachten in DPBS-bevattende buizen met twee minuten vortexing tussen elke overdracht, incubeer de darm in EDTA op ijs gedurende vijf minuten zoals eerder aangetoond.

Na drie opeenvolgende overdrachten in buizen die DPBS bevatten met drie minuten vortexing tussen elke overdracht, combineert u de beste fracties in een buis van 50 milliliter door de geselecteerde buizen drie keer om te keren en door een celzeef van 70 micron te filteren. Draai vervolgens de crypten, gooi het supernatant weg en verstoor de pellet mechanisch voordat je vijf milliliter koude DMEM F12 toevoegt. Tel het aantal crypten dat aanwezig is in een aliquot van 10 microliter handmatig onder een microscoop.

Draai na het tellen de crypten opnieuw en verwijder voorzichtig het supernatant. Verstoor vervolgens mechanisch de pellet en voeg groeicultuurmedium toe aan de buis om een concentratie van 90 crypten per microliter te verkrijgen. Voeg vervolgens twee volumes onverdunde keldermembraanmatrix of BMM toe om een uiteindelijke concentratie van 30 crypten per microliter te krijgen en pipetteer de suspensie voorzichtig op en neer zonder luchtbellen in de mix te introduceren.

Voor flowcytometrie-analyse mengt plaat 10 microliter van de crypten BMM als een koepel in het midden van elke put van een voorverwarmde ronde bodemplaat met 96 putten. En voor beeldvorming, deponeer 10 microliter van het mengsel als een dunne laag in een voorverwarmde microslide acht-well kamer. Nadat u de BMM vijf minuten bij kamertemperatuur hebt laten stollen, plaatst u de platen in een incubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

Voeg na 15 minuten 250 microliter groeimedium toe aan elke put, zorg ervoor dat u de BMM niet losmaakt en plaats de plaat in de incubator. Om oxidatieve stress te visualiseren door confocale microscopie, voegt u één microliter n-acetylcysteïne-stamoplossing toe in de overeenkomstige putten van de microslide acht-putkamer verguld met organoïden. Voeg na een incubatie van een uur een microliter tert-butylhydroperoxide-stamoplossing toe in de overeenkomstige putten en incubeer nog eens 30 minuten.

Voeg vervolgens één microliter van de 1,25 millimolaire verdunning van de fluorogene sonde per put toe, gevolgd door één microliter van 1,25 milligram per milliliter Hoechst-oplossing. Verwijder na nog eens 30 minuten incubatie het medium zonder de BMM te verstoren en voeg voorzichtig 250 microliter warme DMEM toe zonder fenolrood. Stel de organoïden voor met behulp van een confocale microscoop uitgerust met een thermische kamer en gastoevoer die de fluorogene sonde detecteert.

Stel met behulp van de positieve regeling de laserintensiteit en tijdblootstelling voor het ROS-signaal in en controleer of dit signaal lager is in de negatieve regeling. Scherm vervolgens met behulp van een oculair de dia om de organoïden te identificeren die GFP uitdrukken en pas de laserintensiteit aan. Stel een z-stack van 25 micrometer in en definieer posities om een gestikt beeld van de hele organoïde te verkrijgen om een deel van de organoïden te krijgen dat één laag cellen toont.

Voeg een microliter van de n-acetylcysteïne stockoplossing toe in de negatieve controleputten van de 96-putjes ronde bodemplaat met de organoïden. Voeg na een incubatie van een uur een microliter tert-butylhydroperoxide stockoplossing toe in de overeenkomstige putten en incubeer gedurende 30 minuten. Verwijder vervolgens met een meerkanaalspipet het medium zonder de aangesloten BMM te storen en breng het over op een andere 96-well ronde bodemplaat.

Houd dit bord apart. Voeg vervolgens 100 microliter trypsine toe en pipetteer vijf keer op en neer met behulp van een meerkanaalspipet om de BMM te vernietigen. Dissociëer na een korte incubatie van vijf minuten de organoïden door een tweede keer op en neer te pipetteren.

Draai de plaat en gooi het bovennatuurlijke weg door de plaat om te keren. Voeg het medium dat eerder in een andere 96-putplaat was verzameld, terug in de overeenkomstige putten en resuspend de cellen door vijf keer op en neer te pipetteren. Voeg vervolgens een microliter van de fluorogene sonde toe en incubeer gedurende 30 minuten.

Draai vervolgens de plaat opnieuw en resuspend de cellen met 250 microliter DAPI-oplossing. Breng de monsters over in flowcytometriebuizen en houd de buizen op ijs. Optimaliseer de instellingen voor voorwaartse en zijdelingse verstrooiingsspanningen op onbevlekte besturings- en laserspanningen voor elke fluorofoor met behulp van monostained monsters.

Verzamel vervolgens met behulp van een geschikte gating-strategie minimaal 20.000 evenementen. Representatieve confocale beelden van ROS-kleuring en organoïden toonden aan dat in aanwezigheid van de NAC-remmer alleen het signaal van de dode cellen in het lumen van de organoïde zichtbaar is. In de niet-behandelde organoïde kunnen de basale ROS-niveaus worden gezien, met name in GFP-positieve cellen, wat bewijst dat stamcellen hogere ROS produceren dan gedifferentieerde cellen.

GFP-positieve cellen presenteren een significanter cytoplasmatisch signaal met de inductor in aanwezigheid van de fluorogene sonde, wat aantoont dat ros-niveaus toenemen, vooral in stamcellen na behandeling. Flowcytometrie-analyse van ROS-productie in de intestinale organoïden toont aan dat basale ROS-niveaus afnemen na stimulatie met remmer en toenemen na uitdaging met inductor. Cellen voorbehandeld met remmer en vervolgens gestimuleerd met inductor vertonen lagere niveaus dan die gestimuleerd met inductor alleen.

Een vergelijkbare analyse van stamcellen die als GFP-positief zijn afgesloten, toont een 3,5-voudige afname van het ROS-niveau bij behandeling met remmers en een viervoudige toename bij inductorbehandeling ten opzichte van niet-gestimuleerde cellen. Bij het proberen van deze procedure moeten gebruikers eraan denken om celstress te beperken tijdens organoïde manipulatie en dissociatie. Bovendien moeten positieve en negatieve controles altijd worden opgenomen bij het analyseren van ROS.

Na deze procedure kan de analyse worden aangevuld met immunofluorescentiekleuring op vaste intacte organoïden, celsortering en genexpressieanalyse om aanvullende inzichten te krijgen in ROS-regulatie. Na het bekijken van deze video, moet u weten hoe u muriene intestinale organoïden kunt laten groeien, live beeldvormingsanalyse van intacte organoïden kunt uitvoeren en darmorganen kunt verwerken voor flowcytometrie-analyse.