Veranderingen in bladtransmissie gebruiken om chloroplastbeweging in Arabidopsis thaliana te onderzoeken

Deze methode meet veranderingen in de lichttransmissie van bladeren als een proxy voor chloroplastbeweging die de lichtabsorptie van bladeren in verschillende mate beïnvloedt, afhankelijk van soort, omgeving en mutaties. Dit betaalbare zelfgebouwde apparaat maakt het mogelijk om de dynamische veranderingen in chloroplastbewegingen op een eenvoudige en semi-geautomatiseerde manier te kwantificeren. De gegevens vormen een aanvulling op microscopiestudies.

Het is belangrijk om de instructies nauwgezet op te volgen en het instrument met zorg te behandelen. Sluit om te beginnen het transmissieapparaat aan op een stabiele voedingsbron en druk op de aan/uit-schakelaar van het apparaat om het instrument opnieuw in te stellen. Sluit vervolgens de iPad aan op een stabiele voedingsbron.

Druk op de knop op het startscherm om het scherm te activeren en voer de toegangscode in om in te loggen. Druk op het instellingenpictogram, gevolgd door het weergave- en helderheidspictogram. Druk vervolgens op de automatische vergrendeling en selecteer nooit om ervoor te zorgen dat het scherm permanent ingeschakeld blijft, zodat het programma zonder onderbreking wordt uitgevoerd.

Druk vervolgens op de knop van het startscherm om terug te keren naar het hoofdscherm. Zoek en open na het sluiten van alle applicaties de LeafSensor-app en voer de informatie in het groene scherm in dat tekst en witte velden toont. Zorg ervoor dat het woord verbonden in het onderste deel van het scherm wordt weergegeven, wat aangeeft dat de app communiceert met het transmissieapparaat.

Als het bericht Adafruit NOT Found wordt weergegeven, controleert u of het apparaat is aangesloten en drukt u nogmaals op de startknop op het apparaat. Vul de eerste vier velden op de app-pagina in om de voorwaarden in te stellen voor een korte testrun met open bladclips zonder bladeren. Begin met het benoemen van het experiment in de veldnaam experimentnaam, kies vervolgens hoeveel verschillende blauwlichtintensiteiten in het experiment zullen worden gebruikt door het nummer in het veld met de naam aantal lichtintensiteiten te typen en typ vervolgens de blauwlichtintensiteiten die moeten worden gebruikt door een geheel getal tussen 0 en 3.000 te selecteren en elke intensiteit van de volgende te scheiden met een komma in het veld met de naam blauwintensiteiten.

Typ de tijdsduur voor elke blauwe lichtintensiteit in het veld met de naam blauwe duur. Druk op Experiment starten in het middelste gedeelte van het scherm. In het onderste gedeelte van het scherm verschijnen acht koppeltekens met het bericht Experiment starten.

Laat het experiment lopen totdat de eerste gegevens worden weergegeven. Nadat u ervoor hebt gezorgd dat er de eerste twee minuten geen licht van de LED wordt uitgestraald, observeert u de emissie van zwak blauw licht gedurende twee minuten en vervolgens de emissie van sterk blauw licht gedurende nog eens twee minuten. Observeer ook intens rood licht dat eenmaal per minuut kortstondig van de LED wordt uitgezonden gedurende deze reeks.

Controleer of de status Voltooid experiment wordt aangegeven door het bericht Experiment voltooid in de linkerbenedenhoek van de app-pagina en druk vervolgens tweemaal op de knop op het startscherm. Veeg uit de app en open deze opnieuw. Reset het instrument door op de aan/uit-knop te drukken om het instrument voor te bereiden op een run met bladeren.

Kies in het donker, met alleen zeer laag wit of groen licht, één breed blad van de donker-aangepaste plant om de LED te bedekken. Bereid de filterpapierstrook voor van ongeveer de lengte van een bladclip. Pons vervolgens een gat aan de bovenkant van de papierstrip om te voorkomen dat de LED wordt bedekt.

Plaats een bevochtigd filtreerpapier op het bladclipgedeelte dat de LED vasthoudt. Verwijder de donker aangepaste bladclip uit de petrischaal en plaats het blad vervolgens op de bovenkant van het natte filterpapier van de bladclip, zodat het adaxiale bladoppervlak naar de LED is gericht. Plaats vervolgens het andere bladclipdeel met een fototransistor aan de bovenkant.

Gebruik indien nodig een elastiekje om twee bladclipdelen bij elkaar te houden. Plaats de bladclip in de betreffende boot en vul met behulp van een pipet de reservoirs met water, zorg ervoor dat het blad of ten minste het filterpapier het water raakt om uitdroging van de bladeren tijdens de run te voorkomen. Stel de LeafSensor-app in op de iPad en typ EXPLORA1 in het veld met de naam experimentnaam.

Typ 10 in het veld met de naam aantal lichtintensiteiten. Voer vervolgens de getallen in het veld met de naam blauwe intensiteiten en blauwe duur in. Druk op Experiment starten.

Observeer na de eerste minuut de weergegeven uitvoerwaarden. Als de waarden ver weg zijn, controleer dan of de bladeren correct in de bladclips zijn geplaatst. Wanneer de run is voltooid, worden de gegevens automatisch opgeslagen.

Na het draaien van het scherm in de rechtopstaande positie, verschijnen er twee opties, opslaan en hulpprogramma's, op het scherm. Druk op Hulpprogramma's en selecteer vervolgens in de lijst met opgeslagen bestanden het EXPLORA1-bestand. Onder de lijst met bestanden wordt EXPLORA1 nu weergegeven in het geselecteerde experiment.

Druk vervolgens op E-mail. Voer een e-mailadres in en het EXPLORA1-bestand wordt automatisch aan het bericht toegevoegd en druk vervolgens op Verzenden. De procentuele transmissiegegevens werden uitgezet tegen de tijd, waaruit blijkt dat de transmissie van Arabidopsis thaliana afnam bij lage lichtintensiteiten, terwijl een vermijdingsrespons werd geïnduceerd wanneer de lichtintensiteiten verder toenamen.

De gemiddelde procentuele overdrachtswaarden van de wild-type en mutante Arabidopsis thaliana bladeren tijdens 19-uur durende runs worden getoond. Wanneer de bladeren werden blootgesteld aan weinig blauw licht in zowel wild-type als phot2 mutanten, werd de aanvankelijke snelle afname van de transmissie gevolgd door een langzame afname, wat aangeeft dat de chloroplasten in de accumulatierespons gingen. Vergeleken met wild-type vertoonde phot1 een verminderde accumulatierespons.

Wanneer de intensiteit van het blauwe licht na 11 uur stapsgewijs wordt verhoogd, neemt het percentage transmissie toe en gaan de chloroplasten in de vermijdingsreactie. De mate van verandering in de procentuele transmissie ten opzichte van de donkere waarde, ook wel Delta T genoemd, was afhankelijk van de exacte blauwlichtintensiteiten. De negatieve waarden geven aan dat de bladeren een accumulatierespons vertoonden, terwijl positieve waarden een vermijdingsreactie aangeven.

De snelheid van verandering in transmissie wordt berekend als de helling van de verandering in transmissie wanneer het licht wordt verhoogd. In het representatieve voorbeeld veranderde de transmissiesnelheid tijdens de eerste reacties wanneer vermijding werd geactiveerd naarmate de intensiteit van het blauwe licht werd verhoogd. Bij het onderzoeken van de transmissieveranderingen in een niet-gekarakteriseerde mutant of soort, bevestig hoe de transmissiewaarden en chloroplastposities correleren met een microscopiestudie.