Isolatie en selectie van entomopathogene schimmels uit bodemmonsters en evaluatie van schimmelvirulentie tegen insectenplagen

De methode voor entomopathogene schimmelisolatie is belangrijk voor de ontwikkeling van microbiële bestrijders. Dit protocol kan worden gebruikt om entomopathogene schimmelisolaten met hoge virulentie uit de bodemmonsters te isoleren en te selecteren. Deze techniek omvat drie tanden van pathogeniciteitsscreening en combineert de thermotolerantie- en conidia-productietest om de effectieve conidia-getalrangschikking te maken.

De methode kan helpen bij het selecteren van hoge virulentie en veelbelovende entomopathogene nieuwe schimmelisolaten voor commercialisering. Dit protocol richt zich op biologische bestrijding, het kan ook worden gebruikt om de entomopathogene schimmelisolaten te ontdekken om de interactie tussen plagen en entomopathogene schimmels te bestuderen. De procedure wordt gedemonstreerd door Yao-Chia Liu en Nian-Tong Ni, masterstudent van mijn laboratorium.

Begin met het verzamelen van het bodemmonster door een centimeter van de oppervlaktegrond te verwijderen en vervolgens de grond binnen de vijf tot 10 centimeter diepte van elke bemonsteringslocatie te verzamelen met behulp van een schop. Na het vastleggen van de details van elke bemonsteringslocatie, verzamelt en bewaart u 100 gram bodemmonster in een plastic zak bij kamertemperatuur om het schimmelisolatieprotocol binnen drie uur uit te voeren. Om de potentiële entomopathogene schimmels of EPF te isoleren, voegt u 100 gram van het bodemmonster toe in een plastic beker en plaatst u vijf Tenebrio-molitorwormen op het oppervlak van de grond bij kamertemperatuur in het donker gedurende twee weken met het observeren en registreren van de larvensterfte en mycose dagelijks.

Houd de dode larve in de beker tot twee weken voor schimmelisolatie. Breng na twee weken de dode insecten over naar een schone bank en gebruik een steriele tandenstoker om de conidia te verzamelen. Om de primaire cultuur van schimmels te verkrijgen, streept u de verzamelde conidia op een kwartsterkte Sabouraud dextrose agar medium of SDA in een plaat van 55 millimeter om zeven dagen lang bij 25 graden Celsius te incuberen.

Op de achtste dag, restreak elke primaire cultuur schimmel op een 55 millimeter kwart-sterkte SDA plaat in een laminaire stroom kap voor het incuberen van de cultuur bij 25 graden Celsius gedurende zeven dagen om enkele kolonies van schimmels te verkrijgen. Plaats bij de eerste pathogeniciteitsscreening vijf Tenebrio molitorlarven direct op het oppervlak van elke pure schimmelkweekplaat bij 25 graden Celsius. Na het observeren en registreren van de mycose en mortaliteit gedurende 10 dagen, selecteert u de schimmelisolaten voor verdere analyse.

Om de tweede virulentietest uit te voeren, oogst u de conidia van elk schimmelisolaat door gedurende één minuut te vortexen en telt u het aantal conidia met behulp van een hemocytometer. Als u klaar bent, past u de conidia-suspensie aan tot een concentratie van één keer 10 tot de 1/7 conidia per milliliter in een oppervlakteactieve oplossing van 0,03% voordat u 10 microliter schimmelsuspensie verspreidt op een 55 millimeter kwartsterkte SDA-plaat om zeven dagen bij 25 graden Celsius in het donker te groeien. Plaats op de achtste dag vijf Tenebrio molitorlarven direct op het oppervlak van elke zuivere schimmelkweekplaat en sluit de platen af met Parafilm-film om te incuberen terwijl de mycose en mortaliteit zoals eerder beschreven worden waargenomen.

Na het herhalen van de tweede virulentietest in drievoud voor elk schimmelisolaat, selecteert u de isolaten om de derde virulentietest voor de doelplaag uit te voeren, zoals Spodoptera litura. Verzamel ongeveer één vierkante millimeter EPF uit de zeven dagen durende kwartsterkte SDA-plaat om het schimmelgenomische DNA te extraheren met behulp van een schimmelgenomische DNA-extractiekit. Versterk vervolgens de schimmelinternant getranscribeerde spacer of ITS-regio door PCR van het DNA-monster volgens het PCR-programma dat in het tekstmanuscript wordt beschreven.

Na het sequentiëren van het PCR-versterkte product door middel van een commerciële sequencingservice, gebruikt u de NCBI BLAST om te zoeken naar vergelijkbare schimmels in de NCBI-database en selecteert u de relatieve schimmelsoorten voor fylogenetische analyse. Lijn de meerdere sequenties uit en snijd het geconserveerde sequentiegebied handmatig bij met GeneDoc. Voer de fylogenetische analyse uit op basis van de minimale evolutie, buurverbinding en maximale waarschijnlijkheidsmethoden.

Om de morfologie van de schimmels te bestuderen, legt u de groei van de schimmelcultuurkolonie gedurende zeven dagen vast met een camera en registreert u de groei, de vorm: pluizig of stevig en de kleur van de kolonies. Om de conidia in conidioforen te observeren, schraap conidia uit de pure cultuurschimmelkolonie met een inentingslus en breng de sporen over naar een glasplaat met 0,1% Tween 80-oplossing. Gebruik een scalpel om een agarblok van de schimmelkolonie te snijden en breng het agarblok vervolgens over op een glazen dia en voeg de 0,1% Tween 80-oplossing toe om het grootste deel van de overtollige conidia op agar af te spoelen.

Bedek vervolgens de dia met een afdekplaat voor lichte microscopische observatie van de conidia. Meet en noteer de breedte en lengte van de conidia en conidioforen om het verschil tussen verschillende schimmelisolaten te vergelijken. Regel een conidiale productietest door het geselecteerde schimmelisolaat gedurende 10 dagen in het donker te kweken op SDA-medium met kwartsterkte bij ongeveer 25 graden Celsius.

Bereid vervolgens een milliliter conidiale suspensie van het schimmelisolaat in 0,03% oppervlakteactieve oplossing, gevolgd door de concentratie aan te passen tot één keer 10 tot de 1/7 conidia per milliliter zoals eerder beschreven. Na het toevoegen van drie druppels van 10 microliter conidiale suspensie op een kwartsterkte SDA-plaat, incubeer je de cultuur bij 25 graden Celsius in het donker gedurende zeven, 10 en 14 dagen om de sporulatie van schimmels te tellen. Maak op elk tijdstip een agarblok van vijf millimeter los van het midden van de kolonie met een kurkboorder en breng het blok over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter met één milliliter 0,03% oppervlakteactieve oplossing.

Na het vortexen van de buis met 3.000 rotaties per minuut bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten, gebruikt u een hemocytometer om het aantal conidia te tellen. Kweek voor de thermotolerantietest het geselecteerde schimmelisolaat en bereid één keer 10 tot de 1/7 conidia per milliliter suspensie zoals eerder geïllustreerd. Verwarm na het vortexen de conidiale suspensie in een droog bad op 45 graden Celsius voor verschillende tijdsintervallen.

Voeg na blootstelling aan hitte op elk tijdstip drie druppels van vijf microliter conidiale suspensie toe op een 55 millimeter kwartsterkte SDA-plaat en incubeer vervolgens de platen bij ongeveer 25 graden Celsius gedurende 18 uur. Om de kiemkracht te bepalen, telt u het aantal gekiemde conidiasporen met vijf willekeurig geselecteerde velden onder de lichtmicroscoop bij 200 keer vergroting. Bereken het totale effectieve conidiagetal of ECN met behulp van de formule en bereken vervolgens de analyse van de hoofdcomponenten of PCA van schimmelstammen zoals beschreven in het manuscript.

Selecteer de best presterende schimmelstammen op basis van ECN of PCA om de virulentietest van doelplagen uit te voeren. In de tweede virulentietest werd de virulentie van de 26 schimmelisolaten tegen Tenebrio molitormeelwormen beoordeeld. 12 schimmelisolaten met een hoge pathogeniciteit werden geselecteerd voor de virulentietest tegen Spodoptera litura.

Om de taxonomische posities van schimmels beter te begrijpen, werden 26 isolaten uit de eerste pathogeniciteitsscreening onderworpen aan moleculaire analyse op basis van het ITS-gebied. Door de reinigingsmethode van morfologische waarnemingen van schimmels konden de structuren van conidioforen duidelijk worden gezien met 0,1% Tween 80-oplossing. De kleur, vorm en rangschikking van de conidia werden bestudeerd door microscopische waarnemingen van de conidia-kolonie.

Het ECN combineert conidia productie- en thermotolerantiegegevens van elke EPF. De hoge levensvatbaarheid van een schimmelstam werd waargenomen wanneer de ECN-waarde hoog was. Ook werd een goede coördinatie tussen de PCA en het ECN onthuld, wat suggereert dat het ECN kan worden gebruikt om de hiërarchie van levensvatbaarheidsgerelateerde parameters te evalueren.

De pathogeniciteitsscreening waarbij het schimmel-DNA wordt geëxtraheerd en het kweken van het schimmelisolaat zijn belangrijk in de procedure. Door gebruik te maken van de ECN-rekenformule kunnen de ideale interne pathogene schimmels worden geselecteerd. Combinatie van verschillende insectensoorten, zoals grotere wasmot en meelworm samen om de entomopathogene schimmels uit de bodemmonsters te lokken, kan de diversiteit van entomopathogene schimmels vergroten.

De micro-organismendiversiteit van de bodem is een zeer interessant onderwerp tijdens de werking van dit protocol. Het zou in de toekomst ook verder onderzocht kunnen worden via dit protocol.