Fluorescentie-geactiveerde celsortering-radioligand behandeld weefsel (FACS-RTT) om de cellulaire oorsprong van radioactief signaal te bepalen

Dit protocol is complementair aan in vivo beeldvorming. Het maakt celtype en cellulaire niveau kwantificering van radiotracers mogelijk, wat een andere schaal is dan degene die in vivo is verkregen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de gevoeligheid en de cellulaire resolutie die wordt gegeven door het gebruik van radioliganden en de celsortering.

Schakel de camera in en laad de bedieningssoftware. Klik op de Home XYZ stage knop om homing uit te voeren. Stel het experiment in dat bestaat uit één scanacquisitie van 10 minuten.

Stel de stapmodus in op fijn en de acquisitiemodus op de Listmode om het volledige emissiespectrum op te nemen. Stel het bed in en zorg ervoor dat het verwarmingssysteem, de ademhalingssensor en de anesthesie functioneel en veilig zijn. Plaats vervolgens een fantoom waar het hoofd van het dier zal worden geplaatst.

Stel het scangebied in door de cursors voor de drie dimensies te schuiven met behulp van de drie afbeeldingen in het onderste deel van het scherm. Zorg ervoor dat het scanvolume van het fantoom en het dier hetzelfde is. Start de fantoomscan voor latere kalibratie met de eerder vastgestelde parameters.

Zorg ervoor dat u werkt in een geschikte omgeving die is toegestaan voor experimenten met radioactiviteit. Incubeer 100 microgram tributylineprecursor in 100 microliter azijnzuur met natriumjodide en vijf microliter 37% paracetinezuur bij 70 graden Celsius gedurende 20 minuten in een thermocycler in een handschoenenkastje. Verdun de reactie met 50% acetonitril in water tot een volume van 500 microliter.

Injecteer de 500 microliter van de verdunde reactie in een omgekeerde fasekolom. Isoleer de CLINDE met een lineaire gradiënt HPLC-run van 5 tot 95% ACN in zeven millimolair fosforzuur gedurende 10 minuten. Verdun het isolaat in water tot een eindvolume van 10 milliliter en injecteer vervolgens de verdunde reactie op een concentratiekolom.

Eluteer de CLINDE uit de kolom met 300 microliter absolute ethanol en verdamp vervolgens de ethanol door deze gedurende 40 minuten in een vacuümcentrifuge bij kamertemperatuur te incuberen. Verdun het residu dat de CLINDE bevat in 300 microliter zoutoplossing om een voorraadoplossing te creëren. Verdun na het meten van de radioactiviteit de stamoplossing in zoutoplossing tot een oplossing van 0,037 megabecquerel in 500 microliter.

Stel de kalibratiecurven vast met koude referentieverbindingen en los de lineaire regressievergelijking op:Y gelijk aan AX plus B om A- en B-coëfficiënten te verkrijgen. X vertegenwoordigt de massa van koude verbinding en Y vertegenwoordigt het gebied onder de krommen. Controleer het gebied onder de curve van het radioligand en meet de ultraviolette absorptie op 450 nanometer op basis van de kalibratiecurve en het gebied onder de curve van het radioligand.

Schat de massa en meet de activiteit van de radioligand. Zorg ervoor dat de specifieke activiteit groter is dan 1.000 gigabecquerel per micromol. Klik op de knop Afbeelding bijwerken om de positie van het dier bij te werken.

Stel het scangebied in door de cursors te schuiven met behulp van de drie afbeeldingen in het onderste deel van het scherm voor de drie dimensies. Stel het experiment in op een scan van 60 minuten die 60 frames van één minuut omvat. Gebruik alle andere parameters die in eerste instantie zijn ingesteld opnieuw.

Injecteer 500 microliter van de radioactieve radiotracer en spoel de buis vervolgens met 300 microliter steriel 0,9% natriumchloride. Klik tegelijkertijd op Acquisitie starten om de scan te starten. Open de scanreconstructiesoftware en open vervolgens de gegevensset, op zoek naar het bestand met bestandsnaamparameters dat is gemaakt in de map van de scan.

Selecteer de gewenste isotoop. Merk op dat de parameter list mode bij deze stap meerdere isotopenselectie toestaat. Stel de verschillende reconstructieparameters in, zoals de voxelgrootte, het aantal subsets en iteraties zoals beschreven in het manuscript.

Selecteer het uitvoerformaat als NIFTI en selecteer vervolgens Spect-reconstructie starten. Gebruik een platte metalen spatel en een scheermesje om de interessegebieden van de hersenen te ontleden. Plaats de weefsels in een centrifugebuis van twee milliliter en weeg het verkregen weefsel.

Doe de monsters in een centrifugebuis van twee milliliter met één milliliter calcium- en magnesiumvrij HBSS en centrifugeer vervolgens gedurende twee minuten bij kamertemperatuur op 300 maal G en verwijder het supernatant zonder de pellet te verstoren. Voeg 1.900 microliter enzymmix toe en incubeer het gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius terwijl je de buizen elke vijf minuten door inversie roert. Voeg 30 microliter enzymmix twee toe.

Roer voorzichtig met een pipet van 1.000 microliter 30 keer heen en weer. Incubeer vervolgens het mengsel gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius terwijl u de buizen om de vijf minuten door inversie roert. Meng voorzichtig heen en weer met een pipet van 200 microliter en vervolgens een pipet van 10 microliter voordat u het mengsel gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius incubeert om de weefsels te dissociëren.

Filter de cellen met een celzeef van 70 micrometer en voeg 10 milliliter calcium- en magnesiumvrij HBSS toe. Centrifugeer 300 maal G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant zonder de pellet te verstoren. Voor myeline-depletie, resuspend de pellet met 400 microliter myelineverwijderingsbuffer en voeg vervolgens 100 microliter myelineverwijderingsparels toe voordat u gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius broedt.

Voeg vijf milliliter myelineverwijderingsbuffer toe en centrifugeer 300 keer G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 500 microliter myelineverwijderingsbuffer toe en plaats de gesuspendeerde pellets in de magnetische veldkolom. Was de kolom vier keer met één milliliter myelineverwijderingsbuffer.

Centrifugeer twee minuten bij kamertemperatuur op 300 maal G en verwijder het supernatant zonder de pellet te storen. Vortex kort om de cellen te dissociëren en vijf microliter Fc Block CD32 toe te voegen. Voeg 100 microliter van de mix van primaire antilichamen van belang toe en incubeer gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius.

Centrifugeer bij 350 maal G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en verwijder het supernatant zonder de pellet te verstoren. Dep de buisjes ondersteboven op zacht papier. Vortex de buis kort, voeg dan 100 microliter van het secundaire antilichaammengsel toe en incubeer gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius.

Voeg een milliliter myelineverwijderingsbuffer toe en herhaal de centrifugatie. Gooi het bovennatuurlijke middel weg en dep de buisjes ondersteboven op zacht papier. Resuspend de cellen in 250 microliter steriel PBS en ga direct over tot celsortering.

De in vivo SPECT-scan van wild-type ratten toonde een hogere binding van CLINDE op de plaats van de lipopolysaccharide-injectie dan in het contra-laterale gebied van de hersenen. De ex vivo monsters die fluorescentie geactiveerde celsortering radioligand-behandeld weefsel, of FACS-RTT, ondergingen de aanwezigheid van een hoger aantal CLINDE-bindingsplaatsen alleen in microglia, wat aantoont dat de cellulaire oorsprong van het CLINDE-signaal in de ipsilaterale kant van de hersenen microglia was. De toename van translocatoreiwit, of TSPO-binding, na 12 maanden bij TgF344-AD-ratten was beperkt tot astrocyten.

Bij 24 maanden oude ratten werd de toename van TSPO-binding waargenomen als gevolg van zowel astrocytische als microgliale veranderingen. Bij oudere TgF344-AD-ratten vertoonden striatale astrocyten een verminderde 5HT2AR-dichtheid in vergelijking met wildtype. Een corticale overexpressie van TSPO werd waargenomen in zowel astrocyten als microglia van AD-proefpersonen in vergelijking met leeftijdsgematchte controles wanneer FACS-RTT werd uitgevoerd op menselijke AD-postmortale monsters.

Volg bij het werken met radioactiviteit de instructies van radiobeveiliging en draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. Zorg er vervolgens na de procedure voor dat u de werkomgeving ontsmet. Eiwitkwantificering en genexpressieanalyse kunnen na deze procedure eenvoudig worden uitgevoerd op geïsoleerde celpopulaties.