Name: Fluorescentie-geactiveerde celsortering-radioligand behandeld weefsel (FACS-RTT) om de cellulaire oorsprong van radioactief signaal te bepalen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Leer FACS-RTT om de cellulaire oorsprong van radioactief signaal te bepalen in het TgF344-AD ratmodel voor Alzheimeronderzoek. Deze methode biedt hoge gevoeligheid en celresolutie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Zwitserse National Science Foundation (subsidie nr. 320030-184713). Auteurs BBT en KC worden ondersteund door de Velux Foundation (projectnr. 1123). Auteur ST kreeg steun van de Swiss National Science Foundation (Early Post-Doc Mobility Scholarship, nr. P2GEP3_191446), de Prof Dr. Max Cloetta Foundation (Clinical Medicine Plus scholarship) en de Jean and Madeleine Vachoux Foundation.

Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met respectievelijk de Ethische Commissie voor menselijke en dierlijke experimenten van het kanton Genève, de Kantonnale Commissie voor Onderzoeksethiek (CCER) en de Algemene Directie van het Gezondheidsgebied Genève (Zwitserland). Gegevens worden gerapporteerd volgens de richtlijnen voor dieronderzoek: rapportage in vivo experimenten (ARRIVE).
1. SPECT camera voorbereiding en kalibratie
<ol><li>Schakel de camera in, laad de besturingssoftware (zie Tabel met materialen). Klik op de Home XYZ Stage knop om homing uit te voeren.</li>
	<li>Stel het experiment in dat bestaat uit één scanacquisitie van 10 minuten. Stel de stapmodus in op Fijn en de acquisitiemodus op de Listmode (om het volledige emissiespectrum op te nemen).</li>
	<li>Stel het bed in en zorg ervoor dat het verwarmingssysteem, de ademhalingssensor en de anesthesie functioneel en veilig zijn (figuur 1A-D). Plaats vervolgens een fantoom (d.w.z. 2 ml van een bekende concentratie van 125I in een microfugebuis van 2 ml) waar het hoofd van het dier wordt geplaatst (gecentreerd op het gebied, figuur 1E).</li>
	<li>Stel het scangebied in door de cursors voor de drie dimensies te schuiven met behulp van de drie afbeeldingen in het onderste deel van het scherm. Zorg ervoor dat het scanvolume van het fantoom en het dier hetzelfde is.</li>
	<li>Start de fantoomscan voor de daaropvolgende kalibratie met de parameters die zijn vastgesteld in stappen 1.2-1.4.</li>
</ol>2. Werkruimte-instelling voor SPECT-imaging
<ol><li>Reinig de werkruimte met het desinfectiemiddel virucide en plaats zachte papieren op alle oppervlakken.</li>
	<li>Zorg ervoor dat er voldoende isofluraan en zuurstof in hun respectieve tanks zit.</li>
	<li>Bereid een 24 G-katheter voor door de vinnen van de vlinderkatheter af te snijden om een duidelijker zicht op de ader van de rattenstaart te hebben.</li>
	<li>Bekleed de katheter door deze volledig te vullen met heparine-oplossing (25000 E/ml) na het verwijderen van de naald. Plaats vervolgens de naald er weer in om de vorming van bloedstolsels na het inbrengen van de katheter te voorkomen.</li>
</ol>3. [125I]CLINDE radiotracer synthese
LET OP: Radioactiviteit kan voldoende ioniserende energie hebben om de atomen van de levende cellen te beïnvloeden en hun genetisch materiaal (DNA) te beschadigen.
<ol><li>Zorg ervoor dat u werkt in een geschikte omgeving die is toegestaan voor experimenten met radioactiviteit. OPMERKING: Draag de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) voor het hanteren van radioactiviteit, inclusief vinger- en lichaamsdosimeters. Probeer op een veilige afstand te blijven van elke bron van radioactiviteit.</li>
	<li>Incubeer 100 μg tributylineprecursor in 100 μL azijnzuur met natriumjodide (Na125I) (zie Materiaaltabel) en 5 μL 37% perazijnzuur bij 70 °C gedurende 20 minuten in een thermocycler in een handschoenenkastje.</li>
	<li>Verdun de reactie met 50% acetonitril (ACN) in water tot een volume van 500 μL. Injecteer de 500 μL van de verdunde reactie in een kolom met omgekeerde fasen (zie Materialentabel).</li>
	<li>Isoleer de [125I]CLINDE met een lineaire gradiënt HPLC run van 5%-95% ACN in 7 mM H3PO4 gedurende 10 minuten. Verdun het isolaat in H2O tot een eindvolume van 10 ml en injecteer vervolgens de verdunde reactie in een concentratiekolom (zie Tabel met materialen).</li>
	<li>Eluteer de [125I]CLINDE uit de kolom met 300 μL absolute ethanol en verdamp vervolgens de ethanol door deze gedurende 40 minuten in een vacuümcentrifuge bij RT te incuberen.</li>
	<li>Verdun het residu dat de [125I]CLINDE bevat in 300 μL steriele zoutoplossing om een stamoplossing te creëren.</li>
	<li>Na het meten van de radioactiviteit, verdunt u de stamoplossing in steriele zoutoplossing om een oplossing van 0,037 MBq in 500 μL te verkrijgen.</li>
	<li>Zuiver de tracer met HPLC (High-performance liquid chromatography). Bepaal de elutietijd met behulp van een standaardkalibratie bij 450 nm en isoleer de enkele radioactieve piek. Voer de standaard kalibratiecurve uit met zeven standaardconcentraties koude (niet-radioactieve) CLINDE (0,1 μg, 0,5 μg, 0,75 μg, 1 μg, 1,5 μg, 2 μg en 5 μg in 400 μL van een oplossing van 50% ACN). Bepaal de radiochemische zuiverheid door een enkele piek in radio-TLC (Dunne laagchromatografie) te meten. Zorg ervoor dat de zuiverheid van de radiochemische stof boven de 60% ligt.</li>
	<li>Controleer de specifieke activiteit van de radioligand die de ultraviolette absorptie bij 450 nm meet en de kalibratiecurven die zijn vastgesteld met koude referentieverbindingen. Zorg ervoor dat de specifieke activiteit groter is dan 1000 GBq/μmol.</li>
</ol>4. [125I]R91150 radiotracersynthese
OPMERKING: Zorg ervoor dat u dezelfde beveiligingsregels volgt als vermeld in de clinde-synthesesectie.
<ol><li>Meng 300 μg R91150 precursor in een oplossing van 3 μL absolute ethanol, 3 μL ijsazijn, 15 μL dragervrije Na125I (zie Materiaaltabel) (10 mCi) in 0,05 M NaOH en 3 μL van 30% H2O2. Incubeer gedurende 30 minuten in een handschoenenkastje.</li>
	<li>Injecteer de gehele reactie in een kolom met omgekeerde fasen (zie Tabel met materialen).</li>
	<li>Isoleer [125I]R91150 door isocratische HPLC-run (ACN/water 50/50, 10 mM azijnzuurbuffer) met een debiet van 3 ml/min.</li>
	<li>Verdun [125I]R91150 in H2O voor een eindvolume van 10 ml.</li>
	<li>Injecteer 10 ml van de verdunde reactie op een concentratiekolom (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Elute [125I]R91150 uit de kolom met 300 μL absolute ethanol.</li>
	<li>Verdamp de ethanol door deze gedurende 40 minuten in een vacuümcentrifuge bij RT te broeden.</li>
	<li>Verdun het residu dat [125I]R91150 bevat in 300 μL zoutoplossing.</li>
	<li>Zuiver de tracer met HPLC. Bepaal de elutietijd met behulp van een standaardkalibratie bij 450 nm en isoleer de enkele radioactieve piek. Bepaal de radiochemische zuiverheid door een enkele piek in radio-TLC te meten. Zorg ervoor dat de zuiverheid van de radiochemische stof hoger is dan 98%.</li>
</ol>5. Bereiding van dieren
<ol><li>Weeg en anesthetiseer de TgF344-AD rat (mannelijk of vrouwelijk, van 2-24 maanden oud) in een inductiekamer met 3% isofluraan. Eenmaal diep verdoofd, verlaagt u de isofluraanstroom tot 2% (0,4 l / min, 100% O2) in de kamer.</li>
	<li>Plaats het dier op een voorverwarmd bed uitgerust met een anesthesie neuskegel. Houd isofluraan op 2% (0,4 l/min, 100% O2).</li>
	<li>Breng ooggelglijmiddel aan in de ogen van het dier en bevestig de diepte van de anesthesie via ademhalingsmonitoring; pas de anesthesie indien nodig aan.</li>
	<li>Voer het inbrengen van de 24 G-katheter in de staartader uit.</li>
</ol>6. Overname van SPECT
<ol><li>Breng het dier over naar het camerabed dat is uitgerust met een temperatuurgeregeld verwarmingskussen dat is ingesteld op 38 °C (figuur 1E).</li>
	<li>Bevestig de kop van het dier op de bijtbalk en bevestig de hoofdsteunen.</li>
	<li>Stel het experiment in op een scan van 60 minuten die 60 frames van 1 min vormt. Gebruik alle andere parameters die in stap 1 zijn ingesteld opnieuw. Klik op de knop Afbeelding bijwerken om de positie van het dier bij te werken.</li>
	<li>Stel het scangebied in door de cursors te schuiven met behulp van de drie afbeeldingen in het onderste deel van het scherm voor de drie dimensies.</li>
	<li>Injecteer 500 μL van de radioactieve radiotracer ([125I]CLINDE of [125I]R91150) en spoel de buis vervolgens met 300 μL steriel 0,9% NaCl. Klik tegelijkertijd op Acquisitie starten om de scan te starten.</li>
	<li>Zorg er tijdens de scantijd voor dat het dier onder constante anesthesie blijft met bewaking van de ademhalingsfrequentie. Pas indien nodig de stroom van isofluraan aan.</li>
	<li>Zodra de scan voorbij is, euthanaseer het verdoofde dier snel door onthoofding.</li>
</ol>7. Scan reconstructie
<ol><li>Open de software voor scanreconstructie (zie Materiaaltabel) en open vervolgens de gegevensset, op zoek naar het bestand [bestandsnaam].parameters dat is gemaakt in de map van de scan.</li>
	<li>Selecteer de gewenste isotoop. Merk op dat de parameter Listmode bij deze stap meerdere isotopenselectie toestaat.</li>
	<li>Selecteer de volgende parameters: Voxel-grootte van 0,4 mm, 4 (POS-EM)-subsets, 6 iteraties (24ME-EM-equivalent), geen postfilter en de overeenkomstige isotoop decaycorrectie. Selecteer de uitvoerindeling naar NIfTI en selecteer vervolgens SPECT-reconstructie starten .</li>
</ol>8. Hersenextractie bij ratten
<ol><li>In hetzelfde verdovingsgebeuren als de scanprocedure en na het verzekeren van de diepe anesthesietoestand van het dier door de ademhalingsfrequentie te controleren, gaat u verder met de onthoofding door guillotine en brengt u het hoofd snel over naar de dissectiebank.</li>
	<li>Knip met een schaar voorzichtig de huid bovenop het hoofd van de achterkant naar voren tot het midden van de ogen.</li>
	<li>Snijd de overtollige spieren rond de basis van de schedel en de halswervels af.</li>
	<li>Plaats vervolgens voorzichtig een mes van de schaar in het gat aan de achterkant van de schedel, het foramen magnum, en verwijder het achterste deel van de schedel met een chirurgische tang.</li>
	<li>Verwijder vervolgens met een chirurgische tang voorzichtig het bovenste deel van de schedel. De schedel van oude mannelijke ratten kan dik zijn, verwijder als kleine stukjes om schade aan de hersenen te voorkomen.</li>
	<li>Knip de hersenvliezen voorzichtig af met een schaar. Hersenvliezen kunnen de hersenen beschadigen tijdens het extractieproces; verwijder het uit voorzorg.</li>
	<li>Nadat u het bovenste deel van de schedel hebt verwijderd, draait u het hoofd van het dier rond en trekt u met een kleine platte spatel voorzichtig de hersenen eruit door de oog- en trigeminuszenuwen door te snijden.</li>
	<li>Breng de hersenen voorzichtig over op een plat, schoon glazen oppervlak voor dissectie op ijs.</li>
	<li>Gebruik een platte metalen spatel en een scheermesje om de interessegebieden van de hersenen te ontleden. Plaats de weefsels in een centrifugebuis van 2 ml en weeg het verkregen weefsel. Gebruik het hersengedeelte direct voor celisolatie of vries het snel in vloeibare stikstof in voor later gebruik.</li>
</ol>9. Celisolatie
<ol><li>Zorg ervoor dat u in een schone en steriele omgeving werkt. Werken onder een klasse-II bioveiligheidskast (BSC) wordt geadviseerd. Zorg ervoor dat de handschoenen en elk apparaat dat in de BSC wordt ingebracht steriel zijn.</li>
	<li>Om de cellen voor te bereiden op celsortering, volgt u het protocol van Jaclyn M. Schwarz14. OPMERKING: In dit experiment werd een in de handel verkrijgbare neurale dissociatiekit (zie tabel met materialen) gebruikt voor celvoorbereiding.<ol>
<li>Doe de monsters in een centrifugebuis van 2 ml met 1 ml HBSS (Ca- en Mg-vrij) en centrifugeer vervolgens (300 x g, 2 min, kamertemperatuur = RT) en verwijder het supernatant zonder de pellet te verstoren.</li>
		<li>Voeg 1900 μL enzymmix-1 toe en incubeer het gedurende 15 minuten bij 37 °C terwijl u de buisjes roert door elke 5 minuten om te keren.</li>
		<li>Voeg 30 μL enzymmix-2 toe, roer voorzichtig met pipet 1 (zie Materiaaltabel) 30 keer heen en weer. Incubeer vervolgens gedurende 15 minuten bij 37 °C terwijl u de buizen om de 5 minuten door inversie roert.</li>
		<li>Meng voorzichtig heen en weer met pipet 2 en pipetteer vervolgens 3 voordat u gedurende 10 minuten bij 37 °C incubeert om de weefsels te dissociëren.</li>
		<li>Filter de cellen met een celzeef van 80 μm, voeg 10 ml HBSS (Ca- en Mg-vrij) toe. Centrifugeer (300 x g, 10 min, RT) en verwijder het supernatant zonder de pellet te storen.</li>
		<li>Voor myelinedepletie, resuspend de pellet met 400 μL myelineverwijderingsbuffer (zie Tabel met materialen) en voeg vervolgens 100 μL myelineverwijderingsparels toe (zie Tabel met materialen), voordat u gedurende 15 minuten bij 4 °C broedt.</li>
		<li>Voeg 5 ml myelineverwijderingsbuffer toe, centrifugeer (300 x g, 10 min, RT) en verwijder het supernatant zonder de pellet te verstoren.</li>
		<li>Voeg 500 μL myelineverwijderingsbuffer toe en plaats de buis in de magnetische veldkolom. Was de kolom vier keer met 1 ml myelineverwijderingsbuffer.</li>
		<li>Centrifugeer (300 x g, 2 min, RT) en verwijder het supernatant zonder de pellet te verstoren. Vortex kort (2 s) om de cellen te dissociëren en 5 μL Fc-blok CD32 toe te voegen. Vortex opnieuw en incubeer gedurende 5 min bij 4 °C.</li>
		<li>Voeg 100 μL van de mix van primaire antilichamen van belang toe; incubeer gedurende 20 min bij 4 °C.</li>
		<li>Centrifugeer (350 x g, 5 min, 4 °C) en verwijder het supernatant zonder de pellet te storen. Dep de buisjes ondersteboven op zacht papier.</li>
		<li>Voeg na een korte vortex (2 s) 100 μL van het secundaire antilichaammengsel toe en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 °C.</li>
		<li>Voeg 2 ml myelineverwijderingsbuffer toe, centrifugeer (350 x g, 5 min, 4 °C) en verwijder het supernatant zonder de pellet te storen. Dep de buisjes ondersteboven op zacht papier. Resuspend de cellen in 250 μL steriel PBS en ga direct over tot celsortering.</li>
	</ol>
</li>
</ol>10. Cel sorteren
<ol><li>Bereid de microfugebuis voor met 500 μL steriel PBS voor het verzamelen van de gesorteerde cellen.</li>
	<li>Voeg 10 μL Hoechst per 1000 μL celoplossing toe om de kernen van de levende cellen te kleuren en ze te onderscheiden van de dode cellen.</li>
	<li>Breng de cellen zo snel mogelijk over naar de celsorteermachine bij 4 °C.</li>
	<li>Sorteer eerst de cellen op voorwaartse en zijverstrooiing en sorteer vervolgens de Hoechst-positieve cellen. Sorteer vervolgens de cellen op basis van de antilichamen van belang. Verzamel de positief gekleurde cellen afzonderlijk. Zorg ervoor dat u de positieve cellen onderscheidt van de autofluorescente cellen.</li>
	<li>Tel het aantal gesorteerde cellen voor elke interessante pool.</li>
</ol>11. Gamma tellen
<ol><li>Kalibreer het γ telsysteem met 10 μL van dezelfde fantoomoplossing die wordt gebruikt voor de SPECT-kalibratie, maar verdun het in 1 ml water. OPMERKING: De fantoomoplossing wordt verdund vanwege de verbeterde precisie van het γ telsysteem.</li>
	<li>Plaats de buis met gesorteerde cellen in het γ telsysteem en ga verder met de γ tellen volgens het protocol van de fabrikant.</li>
</ol>

<ol><li>Nichols, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((regional%2C+and+national+burden+of+Alzheimer%27s+disease+and+other+dementias%2C+1990-2016%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2016%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">regional, and national burden of Alzheimer's disease and other dementias, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016.</a> The Lancet Neurology. 18 (1), 88-106 (2019).</li>
<li>Kinney, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+as+a+central+mechanism+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%27s+%26+Dementia%22%5BJournal%5D)">Inflammation as a central mechanism in Alzheimer's disease.</a> Alzheimer's & Dementia. 4, New York, N. Y. 575-590 (2018).</li>
<li>D'Amelio, M., Puglisi-Allegra, S., Mercuri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+dopaminergic+midbrain+in+Alzheimer%27s+disease%3A+Translating+basic+science+into+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">The role of dopaminergic midbrain in Alzheimer's disease: Translating basic science into clinical practice.</a> Pharmacological Research. 130, 414-419 (2018).</li>
<li>D'Amelio, M., Serra, L., Bozzali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventral+tegmental+area+in+prodromal+Alzheimer%27s+disease%3A+Bridging+the+gap+between+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%3A+JAD%22%5BJournal%5D)">Ventral tegmental area in prodromal Alzheimer's disease: Bridging the gap between mice and humans.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 63 (1), 181-183 (2018).</li>
<li>Cohen, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+Alzheimer+rat+with+plaques%2C+tau+pathology%2C+behavioral+impairment%2C+oligomeric+a%CE%B2%2C+and+frank+neuronal+loss%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric aβ, and frank neuronal loss.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (15), 6245-6256 (2013).</li>
<li>Morrone, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+differences+in+Alzheimer%27s+disease+pathology+confound+behavioural+rescue+after+amyloid-%CE%B2+attenuation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%3A+A+Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Regional differences in Alzheimer's disease pathology confound behavioural rescue after amyloid-β attenuation.</a> Brain: A Journal of Neurology. 143 (1), 359-373 (2020).</li>
<li>Berkowitz, L. E., Harvey, R. E., Drake, E., Thompson, S. M., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+impairment+of+directional+and+spatially+precise+trajectories+by+TgF344-Alzheimer%27s+disease+rats+in+the+Morris+Water+Task%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Progressive impairment of directional and spatially precise trajectories by TgF344-Alzheimer's disease rats in the Morris Water Task.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16153(2018).</li>
<li>Koulousakis, P., vanden Hove, D., Visser-Vandewalle, V., Sesia, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cognitive+improvements+after+intermittent+deep+brain+stimulation+of+the+nucleus+basalis+of+meynert+in+a+transgenic+rat+model+for+Alzheimer%27s+disease%3A+A+preliminary+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%3A+JAD%22%5BJournal%5D)">Cognitive improvements after intermittent deep brain stimulation of the nucleus basalis of meynert in a transgenic rat model for Alzheimer's disease: A preliminary approach.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 73 (2), 461-466 (2020).</li>
<li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+reference+learning+deficits+in+absence+of+dysfunctional+working+memory+in+the+TgF344-AD+rat+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Brain%2C+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Spatial reference learning deficits in absence of dysfunctional working memory in the TgF344-AD rat model of Alzheimer's disease.</a> Genes, Brain, and Behavior. , 12712(2020).</li>
<li>Tournier, B. B., Tsartsalis, S., Ceyzériat, K., Garibotto, V., Millet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+TSPO+signal+and+neuroinflammation+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">In vivo TSPO signal and neuroinflammation in Alzheimer's disease.</a> Cells. 9 (9), (2020).</li>
<li>Backes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5B11C%5Draclopride+and+extrastriatal+binding+to+D2%2F3+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">[11C]raclopride and extrastriatal binding to D2/3 receptors.</a> NeuroImage. 207, 116346(2020).</li>
<li>Millet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+dopamine+D%282%2F3%29+receptors+in+rat+brain+using+factor+analysis+corrected+%5B18F%5DFallypride+images%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">Quantification of dopamine D(2/3) receptors in rat brain using factor analysis corrected [18F]Fallypride images.</a> NeuroImage. 62 (3), 1455-1468 (2012).</li>
<li>Tsartsalis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+simplified+reference+tissue+model+for+the+quantification+of+dopamine+D2%2F3+receptors+with+%5B18F%5DFallypride+images%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">A modified simplified reference tissue model for the quantification of dopamine D2/3 receptors with [18F]Fallypride images.</a> Molecular Imaging. 13 (8), (2014).</li>
<li>Schwarz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+fluorescence-activated+cell+sorting+to+examine+cell-type-specific+gene+expression+in+rat+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Using fluorescence-activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537(2015).</li>
<li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-activated+cell+sorting+to+reveal+the+cell+origin+of+radioligand+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-activated cell sorting to reveal the cell origin of radioligand binding.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (6), 1242-1255 (2020).</li>
<li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+TSPO+upregulation+appears+before+microglial+TSPO+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%3A+JAD%22%5BJournal%5D)">Astrocytic TSPO upregulation appears before microglial TSPO in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 77 (3), 1043-1056 (2020).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.

Voor zover wij weten, was deze techniek de eerste die een benadering beschreef die een beter begrip mogelijk maakt van in vivo bindingsveranderingen van een radiotracer op cellulair niveau. Het protocol beschrijft een multischaalmethode om radiotracerbinding op cellulair niveau te kwantificeren met behulp van [125I]CLINDE (TSPO) of [125I]R91150 (5HT2AR) als voorbeelden.
Deze techniek is robuust en gevoelig genoeg om nauwkeurig de cellulaire oorsprong t...

Neurodegeneratieve ziekten, zoals de ziekte van Alzheimer (AD), worden gekenmerkt door een neuronaal verlies geassocieerd met verhoogde symptomen. AD, de meest voorkomende oorzaak van dementie, goed voor 60% -70% van de gevallen, treft ongeveer 50 miljoen mensen wereldwijd1. Op neuropathologisch niveau zijn de twee belangrijkste kenmerken van AD de accumulatie van extracellulaire amyloïde-β (Aβ) plaques en intracellulaire Tau neurofibrillaire klitten. Gliacelveranderingen zijn ook in verband gebracht met AD2 en mogelijke verstoring van verschillende neurotransmittersystemen 3,4.
De TgF344-AD rattenlijn is aangepast naar model AD door menselijke APP- en PS1ΔE9-transgenen tot expressie te brengen, wat leidt tot oplosbare en onoplosbare Aβ-40- en Aβ-42-expressie en amyloïde plaquevorming5. Het presenteert ook de accumulatie van hyperfosforyleerde vormen van het Tau-eiwit die leiden tot tauopathie. Vanaf de leeftijd van 9-24 maanden ontwikkelen de ratten geleidelijk de pathologische kenmerken van AD en een cognitieve stoornis 5,6,7,8,9.
Positron Emission Tomography (PET), Single-Photon Emission computed Tomography (SPECT) en autoradiografie zijn technieken gebaseerd op de emissie en kwantificering van γ stralen. Radiotracers worden gekwantificeerd in vivo (PET en SPECT) of ex vivo/in vitro (autoradiografie). Die gevoelige technieken hebben bijgedragen aan het begrijpen van mechanismen van verschillende hersenziekten, zoals AD. Inderdaad, in termen van neuro-inflammatie zijn er veel studies die 18 kDa Translocator Protein (TSPO), een in vivo neuro-inflammatiemarker, beoordelen met radioactief gelabelde tracers zoals [11C] - (R) - PK11195 of [11C] PBR28 (voor beoordeling zie10). Bovendien zijn veranderingen van neurotransmittersystemen bestudeerd met behulp van radiotracers 11,12,13.
Die technieken bepalen echter niet de cellulaire oorsprong van het radioactieve signaal. Dit zou de interpretatie van de biologische onderbouwing van de verandering in de binding van een radioligand in PET/SPECT kunnen belemmeren. In het geval van TSPO-studies naar neuro-inflammatie is het bijvoorbeeld van het grootste belang om te begrijpen of de toename of afname van TSPO te wijten is aan astrocytische of microgliale veranderingen. De Fluorescence-Activated Cell Sorting to Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) techniek werd ontwikkeld om deze problemen te omzeilen, waardoor de beoordeling van radioligandbinding in elk celtype afzonderlijk en de kwantificering van de doeleiwitdichtheid per cel mogelijk is. Deze innovatieve techniek is bijgevolg complementair en zeer compatibel met PET- en SPECT-beeldvorming.
Hier werd deze techniek toegepast langs twee assen: de studie van neuro-inflammatie met behulp van TSPO-specifieke radioliganden en het beoordelen van het serotonerge systeem. Op de eerste as was het doel om de cellulaire oorsprong van het TSPO-signaal te begrijpen als reactie op een acute ontstekingsreactie. Daarom werd FACS-RTT gebruikt op de hersenweefsels van ratten na de inductie van neuro-inflammatie via een lipopolysaccharide (LPS) injectie en na een in vivo [125I] CLINDE SPECT beeldvormingsstudie. Verder werden dezelfde beeldvorming en hetzelfde FACS-RTT-protocol toegepast op 12- en 24 maanden oude TgF344-AD-ratten en bijpassende wild-type (WT) ratten. De tweede as was gericht op het bepalen van de oorsprong van serotoninerge systeemveranderingen in dit rattenmodel via ex vivo 5-HT2A R-dichtheidsbeoordelingper celtype.

<table><tbody><tr><td>Azijnzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioVet</td><td>BioVet</td><td></td><td>Software voor vitale functies controle</td></tr><tr><td>Bondclone C18 reverse-phase kolom</td><td>Phenomenex, Schlieren, Zwitserland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Des-Sur</td><td>University Hospital of Geneva</td><td></td><td>Virucide</td></tr><tr><td>Fc Block / anti-CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>BDB550270</td><td>Reactiviteit voor rat</td></tr><tr><td>FITC-geconjugeerd anti-rat CD90</td><td>Biolegend</td><td>202504</td><td>Reactiviteit voor rat</td></tr><tr><td>Heparine</td><td>B. Braun</td><td>B01AB01</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Knauer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>321312</td><td>24 G katheter</td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>Baxter</td><td>ZDG9623</td><td></td></tr><tr><td>Lacryvisc</td><td>Alcon</td><td>2160699</td><td></td></tr><tr><td>LS Kolommen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Micropore soft tape</td><td>3M</td><td>F51DA01</td><td></td></tr><tr><td>MILabs-Uspect II</td><td>MILabs</td><td></td><td>Software voor SPECT Camera</td></tr><tr><td>MoFlo Astrios</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Cel sorteerder</td></tr><tr><td>Myelin Removal Beads II</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-733</td><td>Bevat kralen en myeline verwijdering buffer.</td></tr><tr><td>NaCl 0,9% steriele oplossing</td><td>B. Braun</td><td>395202</td><td></td></tr><tr><td>Neural Dissociation Kit (P)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td>Bevat de enzymmixen, pipetten 1, 2 en 3.</td></tr><tr><td>Nylon Mesh Sheet</td><td>Amazon</td><td>CMN-0074-10YD</td><td>40 inch breedte, 80 micron maaswijdte</td></tr><tr><td>Perazijnzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>R91150 voorloper</td><td>CERMN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak C18 Kolom</td><td>Waters</td><td></td><td>Concentratiekolom</td></tr><tr><td>Natriumjodide Na125</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tributyltin voorloper</td><td>CERMN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U-SPECT Rec2.38c</td><td>MILabs</td><td>Versie Rec2.38c</td><td>Software voor reconstructie van SPECT beelden</td></tr><tr><td>USPECT II</td><td>MILabs</td><td></td><td>Spect Camera</td></tr><tr><td>Wizard 3"</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Gammateller</td></tr></tbody></table>

fluorescentie-geactiveerde celsortering-radioligand behandeld weefsel (facs-rtt) om de cellulaire oorsprong van radioactief signaal te bepalen

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

Gliacellen hebben waarschijnlijk een aanzienlijke implicatie in de pathofysiologie van neurodegeneratieve aandoeningen, zoals de ziekte van Alzheimer (AD). Hun veranderingen worden misschien geassocieerd met een pro-inflammatoire toestand. De TgF344-AD rattenstam is ontworpen om menselijke APP- en menselijke PS1ΔE9-genen tot expressie te brengen, coderend voor amyloïde eiwitten Aβ-40 en Aβ-42 en vertoont amyloïde pathologie en cognitieve tekorten bij veroudering. Het TgF344-AD rattenmodel wordt in deze studie gebruikt om de cellulaire oorsprong van de 18 kDa translocator eiwit (TSPO, een marker van gliacelactivatie) binding en de 5HT2A-receptor (5HT2AR) serotonine receptor niveaus die mogelijk verstoord zijn in AD te evalueren. De hier gepresenteerde techniek is Fluorescence-Activated Cell Sorting to Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT), een kwantitatieve celtype-specifieke techniek die complementair is aan in vivo PET of SPECT of ex vivo/in vitro autoradiografietechnieken. Het kwantificeert dezelfde radioactief gelabelde tracer die eerder werd gebruikt voor beeldvorming, met behulp van een γ teller na cytometriecelsortering. Dit maakt het mogelijk om de cellulaire oorsprong van het radioactief gelabelde eiwit met hoge cellulaire specificiteit en gevoeligheid te bepalen. Studies met FACS-RTT toonden bijvoorbeeld aan dat (i) de toename van TSPO-binding geassocieerd was met microglia in een rattenmodel van lipopolysaccharide (LPS)-geïnduceerde neuro-inflammatie, (ii) een toename van TSPO-binding na 12 en 18 maanden eerst geassocieerd was met astrocyten en vervolgens microglia in de TgF344-AD-ratten in vergelijking met wildtype (WT) ratten, en (iii) de striatale dichtheid van 5HT2A R neemt af in astrocyten na 18 maanden in hetzelfde rat AD-model. Interessant is dat deze techniek kan worden uitgebreid naar vrijwel alle radiotracers.

WT-ratten ondervonden in vivo SPECT-scan met [125I]CLINDE-radiotracer na een unilaterale LPS-injectie (figuur 2). Deze scan (met behulp van opgetelde gegevens van beelden van 45-60 min post radiotracer injectie) toonde een hogere binding van [125I]CLINDE op de plaats van de LPS-injectie (figuur 2A) dan in het contralaterale gebied van de hersenen (figuur 2B). De ex vivo monsters die FACS-RTT o...

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) is een krachtig hulpmiddel om de rol van het 18 kDa translocator eiwit of serotonine 5HT2A-receptorexpressie bij de ziekte van Alzheimer op cellulaire schaal te bestuderen. Dit protocol beschrijft de ex-vivo toepassing van FACS-RTT in het TgF344-AD rat model.

Fluorescentie-geactiveerde celsortering-radioligand behandeld weefsel (FACS-RTT) om de cellulaire oorsprong van radioactief signaal te bepalen

Glial cells probably have a considerable implication in the pathophysiology of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD). Their ...

Dit protocol is complementair aan in vivo beeldvorming. Het maakt celtype en cellulaire niveau kwantificering van radiotracers mogelijk, wat een andere schaal is dan degene die in vivo is verkregen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de gevoeligheid en de cellulaire resolutie die wordt gegeven door het gebruik van radioliganden en de celsortering.Schakel de camera in en laad de bedieningssoftware. Klik op de Home XYZ stage knop om homing uit te voeren. Stel het experiment in dat bestaat uit één scanacquisitie van 10 minuten.Stel de stapmodus in op fijn en de acquisitiemodus op de Listmode om het volledige emissiespectrum op te nemen. Stel het bed in en zorg ervoor dat het verwarmingssysteem, de ademhalingssensor en de anesthesie functioneel en veilig zijn. Plaats vervolgens een fantoom waar het hoofd van het dier zal worden geplaatst.Stel het scangebied in door de cursors voor de drie dimensies te schuiven met behulp van de drie afbeeldingen in het onderste deel van het scherm. Zorg ervoor dat het scanvolume van het fantoom en het dier hetzelfde is. Start de fantoomscan voor latere kalibratie met de eerder vastgestelde parameters.Zorg ervoor dat u werkt in een geschikte omgeving die is toegestaan voor experimenten met radioactiviteit. Incubeer 100 microgram tributylineprecursor in 100 microliter azijnzuur met natriumjodide en vijf microliter 37% paracetinezuur bij 70 graden Celsius gedurende 20 minuten in een thermocycler in een handschoenenkastje. Verdun de reactie met 50% acetonitril in water tot een volume van 500 microliter.Injecteer de 500 microliter van de verdunde reactie in een omgekeerde fasekolom. Isoleer de CLINDE met een lineaire gradiënt HPLC-run van 5 tot 95% ACN in zeven millimolair fosforzuur gedurende 10 minuten. Verdun het isolaat in water tot een eindvolume van 10 milliliter en injecteer vervolgens de verdunde reactie op een concentratiekolom.Eluteer de CLINDE uit de kolom met 300 microliter absolute ethanol en verdamp vervolgens de ethanol door deze gedurende 40 minuten in een vacuümcentrifuge bij kamertemperatuur te incuberen. Verdun het residu dat de CLINDE bevat in 300 microliter zoutoplossing om een voorraadoplossing te creëren. Verdun na het meten van de radioactiviteit de stamoplossing in zoutoplossing tot een oplossing van 0,037 megabecquerel in 500 microliter.Stel de kalibratiecurven vast met koude referentieverbindingen en los de lineaire regressievergelijking op:Y gelijk aan AX plus B om A- en B-coëfficiënten te verkrijgen. X vertegenwoordigt de massa van koude verbinding en Y vertegenwoordigt het gebied onder de krommen. Controleer het gebied onder de curve van het radioligand en meet de ultraviolette absorptie op 450 nanometer op basis van de kalibratiecurve en het gebied onder de curve van het radioligand.Schat de massa en meet de activiteit van de radioligand. Zorg ervoor dat de specifieke activiteit groter is dan 1.000 gigabecquerel per micromol. Klik op de knop Afbeelding bijwerken om de positie van het dier bij te werken.Stel het scangebied in door de cursors te schuiven met behulp van de drie afbeeldingen in het onderste deel van het scherm voor de drie dimensies. Stel het experiment in op een scan van 60 minuten die 60 frames van één minuut omvat. Gebruik alle andere parameters die in eerste instantie zijn ingesteld opnieuw.Injecteer 500 microliter van de radioactieve radiotracer en spoel de buis vervolgens met 300 microliter steriel 0,9% natriumchloride. Klik tegelijkertijd op Acquisitie starten om de scan te starten. Open de scanreconstructiesoftware en open vervolgens de gegevensset, op zoek naar het bestand met bestandsnaamparameters dat is gemaakt in de map van de scan.Selecteer de gewenste isotoop. Merk op dat de parameter list mode bij deze stap meerdere isotopenselectie toestaat. Stel de verschillende reconstructieparameters in, zoals de voxelgrootte, het aantal subsets en iteraties zoals beschreven in het manuscript.Selecteer het uitvoerformaat als NIFTI en selecteer vervolgens Spect-reconstructie starten. Gebruik een platte metalen spatel en een scheermesje om de interessegebieden van de hersenen te ontleden. Plaats de weefsels in een centrifugebuis van twee milliliter en weeg het verkregen weefsel.Doe de monsters in een centrifugebuis van twee milliliter met één milliliter calcium- en magnesiumvrij HBSS en centrifugeer vervolgens gedurende twee minuten bij kamertemperatuur op 300 maal G en verwijder het supernatant zonder de pellet te verstoren. Voeg 1.900 microliter enzymmix toe en incubeer het gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius terwijl je de buizen elke vijf minuten door inversie roert. Voeg 30 microliter enzymmix twee toe.Roer voorzichtig met een pipet van 1.000 microliter 30 keer heen en weer. Incubeer vervolgens het mengsel gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius terwijl u de buizen om de vijf minuten door inversie roert. Meng voorzichtig heen en weer met een pipet van 200 microliter en vervolgens een pipet van 10 microliter voordat u het mengsel gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius incubeert om de weefsels te dissociëren.Filter de cellen met een celzeef van 70 micrometer en voeg 10 milliliter calcium- en magnesiumvrij HBSS toe. Centrifugeer 300 maal G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant zonder de pellet te verstoren. Voor myeline-depletie, resuspend de pellet met 400 microliter myelineverwijderingsbuffer en voeg vervolgens 100 microliter myelineverwijderingsparels toe voordat u gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius broedt.Voeg vijf milliliter myelineverwijderingsbuffer toe en centrifugeer 300 keer G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 500 microliter myelineverwijderingsbuffer toe en plaats de gesuspendeerde pellets in de magnetische veldkolom. Was de kolom vier keer met één milliliter myelineverwijderingsbuffer.Centrifugeer twee minuten bij kamertemperatuur op 300 maal G en verwijder het supernatant zonder de pellet te storen. Vortex kort om de cellen te dissociëren en vijf microliter Fc Block CD32 toe te voegen. Voeg 100 microliter van de mix van primaire antilichamen van belang toe en incubeer gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius.Centrifugeer bij 350 maal G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en verwijder het supernatant zonder de pellet te verstoren. Dep de buisjes ondersteboven op zacht papier. Vortex de buis kort, voeg dan 100 microliter van het secundaire antilichaammengsel toe en incubeer gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius.Voeg een milliliter myelineverwijderingsbuffer toe en herhaal de centrifugatie. Gooi het bovennatuurlijke middel weg en dep de buisjes ondersteboven op zacht papier. Resuspend de cellen in 250 microliter steriel PBS en ga direct over tot celsortering.De in vivo SPECT-scan van wild-type ratten toonde een hogere binding van CLINDE op de plaats van de lipopolysaccharide-injectie dan in het contra-laterale gebied van de hersenen. De ex vivo monsters die fluorescentie geactiveerde celsortering radioligand-behandeld weefsel, of FACS-RTT, ondergingen de aanwezigheid van een hoger aantal CLINDE-bindingsplaatsen alleen in microglia, wat aantoont dat de cellulaire oorsprong van het CLINDE-signaal in de ipsilaterale kant van de hersenen microglia was. De toename van translocatoreiwit, of TSPO-binding, na 12 maanden bij TgF344-AD-ratten was beperkt tot astrocyten.Bij 24 maanden oude ratten werd de toename van TSPO-binding waargenomen als gevolg van zowel astrocytische als microgliale veranderingen. Bij oudere TgF344-AD-ratten vertoonden striatale astrocyten een verminderde 5HT2AR-dichtheid in vergelijking met wildtype. Een corticale overexpressie van TSPO werd waargenomen in zowel astrocyten als microglia van AD-proefpersonen in vergelijking met leeftijdsgematchte controles wanneer FACS-RTT werd uitgevoerd op menselijke AD-postmortale monsters.Volg bij het werken met radioactiviteit de instructies van radiobeveiliging en draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. Zorg er vervolgens na de procedure voor dat u de werkomgeving ontsmet. Eiwitkwantificering en genexpressieanalyse kunnen na deze procedure eenvoudig worden uitgevoerd op geïsoleerde celpopulaties.

fluorescence-activated-cell-sorting-radioligand-treated-tissue-facs

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een techniek om de lipid raft verdeling van fluorescerende eiwitten in de plasmamembraan van levende cellen sonde wordt beschreven. Het maakt gebruik van de verschillen in verspreiding tijden van eiwitten die gelegen zijn binnen of buiten van lipide rafts. Overname kan dynamisch worden uitgevoerd in controle omstandigheden of na drugsverslaving.

Bepaling van de lipid raft van afscherming van fluorescent-gelabelde probes in levende cellen met behulp van fluorescentie Correlatie Spectroscopie (FCS)

Cancer Associated Fibroblasten (CAF) te vergemakkelijken tumorinitiatie, groei en progressie door te geven dat bevordert de proliferatie, angiogenese en ontsteking. Hier beschrijven we een methode om pure populaties van normale fibroblasten en CAF isoleren van verse muis en humane weefsels door celsortering, met PDGFRα als oppervlaktemerker.

Isolatie van normale en kankergeassocieerde fibroblasten van verse weefsels door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)

Source: Kim, H. et. al., Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates a genetic screening method to detect enzyme expression using metagenomic fosmid libraries and chromogenic substrates. Flow cytometry identifies and isolates single cells producing colored products, enabling high-throughput selection of active enzyme-expressing cells.

Detection of Target Enzyme Expression in Genetically Modified Bacterial Cells

The video demonstrates a fluorescence resonance energy transfer (FRET) flow cytometry assay to detect the seeding activity of protein aggregates isolated from biological samples. Mammalian cells expressing tau reporter proteins are incubated with liposome transduction complexes containing tau seeds. These seeds mediate the aggregation of the reporter proteins, leading to generating a FRET positive signal in the flow cytometer.

A FRET Flow Cytometry Technique to Detect Tau-Seed Induced Reporter Protein Aggregation

Het doel van dit protocol is om de techniek van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) te gebruiken om specifieke typen neurale cellen te sorteren voor daaropvolgende analyse van celtype-specifieke genexpressie, epigenetische markers en/of eiwitexpressie.

Met behulp van fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting voor Onderzoek Cell-type-specifieke genexpressie in Rat Brain Tissue

Hier presenteren we een Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) protocol om moleculaire veranderingen studeren in Fos-uiting van neuronale ensembles van zowel verse als bevroren hersenweefsel. Het gebruik van bevroren weefsel maakt FACS isoleren van vele hersengebieden over meerdere zittingen aan het gebruik van kostbare proefdieren maximaliseren.

Fluorescentie Activated Cell Sorting (FACS) en genexpressie analyse van Fos expressie neuronen van verse en diepgevroren Rat Brain Tissue

Wij rapporteren een protocol met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering met plasmacytoïde dendritische cellen (PDC) met hoge zuiverheid uit het beenmerg van lupus-muizen gevoelig voor functionele studies pDC isoleren.

Fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting voor Zuivering van plasmacytoïde dendritische cellen van de muis Bone Marrow

In het manuscript beschrijven we het gebruik van een kwantitatieve analyse van gist gebaseerde fluorescentie, verslaggever te identificeren van cellulaire componenten betrokken bij de handel en het doden van processen van de cytotoxische een subeenheid van de plant toxine ricine (RTA).

Een eenvoudige fluorescentie gebaseerde verslaggever Assay identificatie van cellulaire bestanddelen die nodig zijn voor ricine toxine een keten (RTA) handel in gist

Beschrijven we een protocol voor preklinische in vivo volgen van kanker uitzaaiingen. Het is gebaseerd op een verslaggever van de radionuclide-fluorescentie combineren de natrium jodide symporter, ontdekt door niet-invasieve [18F] Zilvertetrafluorboraat-PET, en een fluorescente proteïne voor gestroomlijnde ex vivo bevestiging. De methode is toepasbaar voor preklinische in vivo cel bijhouden dan tumor biologie.

Radionuclide-fluorescentie Reporter Gene Imaging als u wilt bijhouden van de Tumor progressie in knaagdier Tumor modellen

We presenteren een experimenteel protocol en data-analyseworkflow om live cell dual-color fluorescentie cross correlation spectroscopie (FCCS) uit te voeren in combinatie met Förster Resonance Energy transfer (FRET) om membraanreceptordynamica in levende cellen te bestuderen met behulp van moderne fluorescentielabeltechnieken.

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy om eiwit-eiwitinteractie en eiwitdynamica in levende cellen te bestuderen

Leer FACS-RTT om de cellulaire oorsprong van radioactief signaal te bepalen in het TgF344-AD ratmodel voor Alzheimeronderzoek. Deze methode biedt hoge gevoeligheid en celresolutie.

Fluorescentie-geactiveerde celsortering-radioligand behandeld weefsel (FACS-RTT) om de cellulaire oorsprong van radioactief signaal te bepalen (Video) | JoVE Journal

Fluorescentie-geactiveerde celsortering-radioligand behandeld weefsel (FACS-RTT) om de cellulaire oorsprong van radioactief signaal te bepalen

Meer video's verkennen