Monstervoorbereiding door 3D-correlatieve gefocuste ionenbundelfrezen voor cryo-elektronentomografie met hoge resolutie

3D-correlatief FIB-frezen maakt specifieke en zelfs zeldzame cellulaire gebeurtenissen toegankelijk voor Cryo-TEM. Hierdoor kan de ultrastructuur van dit evenement direct in de oorspronkelijke omgeving worden onthuld. De correlatieve workflow verbetert het slagingspercentage van het richten op zeldzame cellulaire structuren en helpt ze ondubbelzinnig te identificeren in de drukke cellulaire omgeving.

Anna Bieber en Christina Capitanio, experts in correlatieve cryo-elektronentomografie, zullen de procedure demonstreren. Begin met de cryo-fluorescentiemicroscopie van de celgezaaide rasters door een breed veldoverzicht te verkrijgen in fluorescentie- en gereflecteerde "modus. Selecteer vervolgens geschikte rastervierkanten met fluorescentiesignaal.

Nadat u ervoor hebt gezorgd dat de cellen en kralen gelijkmatig naar het midden van elk vierkant zijn verdeeld, kiest u de vierkanten op 200 netrasters die toegankelijk zijn voor zowel het FIB-SEM- als het TEM-instrument en ten minste drie vierkanten verwijderd zijn van de rasterrand. Verkrijg op elk van de geselecteerde rastervierkanten een fluorescerende stapel met een geschikte gerichte stap. Objectieven met een hoog numeriek diafragma moeten worden gebruikt om het aantal fotonen en de lokalisatienauwkeurigheid te verhogen.

Op een confocale microscoop met numeriek diafragma 0,9 objectief, verwerven stapels met 300 nanometer stapgrootte en oversampling van de Nyquist-waarde. Neem meerdere kleurstapels op en bewaar rasters onder vloeibare stikstof tot verder gebruik. Gebruik de uitsparings- of oriëntatiemarkeringen om ervoor te zorgen dat het raster goed is georiënteerd voor latere plaatsing in de TEM.

Laad de roosters in het cryo FIB-SEM instrument. Zorg ervoor dat de freesrichting loodrecht staat op de kantelas van de TEM. Om de roosters te coaten met een beschermende organometaallaag, gebruikt u een plasmacoder en gasinjectiesysteem op de podiumposities die vooraf zijn gedefinieerd door de FIB-SEM-opstelling.

Neem vervolgens het SEM-rasteroverzicht op en voer een 2D-correlatie uit met FLM-overzichten. Zoek de rastervierkanten door handmatig opgenomen rasteroverzichten te inspecteren of een softwarepakket te gebruiken. Selecteer en markeer vier overeenkomstige posities voor de vierkanten in het FLM- en SEM-rasteroverzicht en bereken de transformatie tussen de gemarkeerde punten voor FLM-SEM-correlatie.

Plaats vervolgens de markeringen in het midden van de overeenkomstige rastervierkanten waarvoor FLM-stapels zijn verkregen voordat u hun positie in de SEM-weergave voorspelt. Neem voor elk gecorreleerd rastervierkant een ionenbundelafbeelding met lage stroom bij de FIB-freeshoek naar keuze en selecteer een gezichtsveld met de gewenste positie en vergroting die overeenkomt met de fluorescentiegegevens. Voor 200 netrasters verkrijgt u FIB-SEM-gegevens om enkele rastervierkanten te bevatten, inclusief de rasterbalken.

Maak vervolgens een SEM-afbeelding van hetzelfde vierkant om te helpen bij de identificatie van overeenkomstige kralen in de fluorescentie- en ionenbundelweergave. Voer registratie uit van de onbewerkte of gedeconvoleerde 3D FLM-stack en de 2D-ionenbundelweergave voor elke positie met de 3D-correlatietoolbox, 3D CT, door de overeenkomstige opnieuw gesneden 3D FLM-stack en ionenbundelweergave in 3D CT.In de fluorescentiegegevens te laden, vier fiduciale kralen te selecteren en met de rechtermuisknop op de positielijst te klikken om de 3D-positie van de kralen te bepalen via Gaussische aanpassing van het signaal in X, Y en Z.Selecteer vervolgens de bijbehorende kralen in de ionenbundelafbeelding om een eerste 3D-correlatie uit te voeren. Voeg op dezelfde manier meer kralen toe aan de registratie om de nauwkeurigheid van de correlatie te controleren.

Laat enkele fiduciale kralen weg die duidelijk herkenbaar zijn in zowel fluorescentie als ionenbundel door hun voorspelde versus werkelijke locatie in het ionenbundelbeeld te controleren. In 3D CT kunnen root mean square error"- of RMSE-waarden worden bekeken om de correlatieconsistentie te beoordelen. Zorg ervoor dat de RMSE-waarden klein zijn en in de volgorde van lokalisatienauwkeurigheid staan.

Selecteer vervolgens de beoogde cellulaire signalen en pas de 3D-positie in de FLM-stapel voordat u de transformatie toepast om de doelposities in de ionenbundelweergave te voorspellen. Breng voor elk gecorreleerd vierkant de voorspelde posities van de interessante kenmerken over naar het FIB-SEM-instrument om de lamellenfreespatronen te plaatsen. Als er meerdere signalen per cel zijn, plaats dan de patronen om de maximaal mogelijke aandachtspunten in dezelfde lamellen op te nemen.

Ruw frezen de lamellen gevolgd door fijn frezen om een uiteindelijke dikte van 150 tot 250 nanometer te krijgen. Zorg ervoor dat de lamellenoriëntatie loodrecht op de kantelas staat bij het laden van de roosters in de transmissie-elektronenmicroscoop. Verkrijg rastermontage en overzichten voor elk rastervierkant met lamellen met geschikte vergroting en belichtingstijd om de fiduciale kralen in de TEM-afbeeldingen te visualiseren zonder de totale elektronendosis aanzienlijk te verhogen.

Verkrijg TEM-kaarten met hoge resolutie van elke lamellen. Register en 3D-2D correleren de FLM-stack met het TEM-rastervierkant en de lamellenoverzichten in 3D CT. Voer een correlatie uit tussen FLM en TEM van lage naar hoge vergroting in TEM. Na het overbrengen van de posities, het instellen en uitvoeren van tilt-series op gecorreleerde posities"gebruik vervolgens een geschikte vergroting, onscherpte en totale dosis om de beeldacquisitie te starten bij de pre-tilt bepaald door de lamellen met behulp van een dosissymmetrisch kantelschema.

Volg handmatige of batchacquisitie van afbeeldingen. In de representatieve analyse wordt het TEM-overzicht met lage vergroting van de maalplaats getoond om biologische kenmerken van belang te lokaliseren. Later werd een hogere vergrotingsweergave gecorreleerd met FLM-projectie met maximale intensiteit en werden posities voor tomogramacquisitie ingesteld.

In de verkregen beelden kon de endocytische eiwitafzetting in zijn oorspronkelijke omgeving worden gevisualiseerd. De optimalisatie van de steekproef is erg belangrijk. De rastervoorbereiding moet worden geoptimaliseerd om een goede verdeling van cellen te frezen en een groot aantal zichtbare fiduciale kralen in de meeste rastervierkanten te hebben.

3D-correlatief frezen heeft geholpen om de ultrastructuur van verschillende cellulaire processen te onthullen, zoals de stapsgewijze progressie van autofagie in elke cel, en het wordt gebruikt om een nieuw fasegescheiden compartiment vast te leggen.