Ontwerp en ontwikkeling van een model om het effect van aanvullende zuurstof op het cystische fibrose-luchtwegmicrobioom te bestuderen

Deze protocollen zijn ontworpen om de in vitro effecten van aanvullend zuurstofgebruik op het longmicrobioom van cystische fibrosepatiënten te modelleren. Dit mediarecept is afgestemd op de fysiologische samenstelling van sputum voor mensen met cystische fibrose. Het spargingproces introduceert het vermogen om onder verschillende zuurstofomstandigheden te kweken.

Veranderingen aan kunstmatig sputummedium maken het mogelijk om andere chronische longziekten na te bootsen en microbiële gemeenschappen te modelleren onder andere omstandigheden, zoals verschillende glucoseconcentraties bij gelijktijdige cystische fibrose en diabetespatiënten. Een overzicht van de stappen voor kunstmatige sputum medium bereiding toont het mengen van de bereide ASCM, ASMM en ASBM. De dweilbuffer wordt gebruikt om de pH tot 6,3 te titreren en filtersterilisatie van het medium wordt uitgevoerd in een koude ruimte op een orbitale shaker.

Bereid om te beginnen een kunstmatig sputummedium door 250 milliliter ASCM toe te voegen aan de fles van één liter met ASMM. Voeg vervolgens 250 milliliter ASBM toe aan de middelgrote fles. Titreer het medium met een basisbuffer van één kies om een pH van 6,3 op een pH-papier te bereiken.

Koel het kunstmatige sputummedium bij vier graden Celsius tot filtratie. Om vervolgens het filtratieproces te starten, brengt u 200 milliliter ongefilterd kunstmatig sputummedium over naar een vacuümfiltratiesysteem met een poriegroottefilter van 0,22 micrometer. Nadat u het filtratiesysteem op de vacuümpomp hebt aangesloten, schakelt u de vacuümpomp in en plaatst u de kamer op een orbitale shaker en schudt u met 90 omwentelingen per minuut in een koude kamer bij vier graden Celsius.

Vervang het filter nadat 350 milliliter medium is gefilterd om het verstoppingsprobleem op te lossen. Nadat een aanzienlijke hoeveelheid is gefilterd, op een extra 150 milliliter medium voor filtratie. Herhaal de filtratie met extra kamers totdat alle media zijn gefilterd.

Overzicht van zuurstofsparingen die de toevoeging van patiëntensputum aan kunstmatig sputummedium in een geautoclaveerde serumfles aantonen. Spaar vervolgens de afgesloten serumfles met een gasmengsel. Ten slotte wordt de serumfles geïncubeerd om kweek Alec Watts te verkrijgen met het interval van 24 uur voor daaropvolgende meta genomics-sequencing.

Om te beginnen met het sparren van serumflessen, etiketteer 500 milliliter geautoclaveerde serumflessen met monsteridentificaties, datum en tijd van inenting en doelzuurstofpercentage. Voeg in een biologische kap 24 milliliter van het kunstmatige sputummedium toe aan elke serumfles die wordt opgezet. Om een voldoende monstervolume voor elke kweekconditie te verkrijgen, verdunt u indien nodig het monster met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing, vervolgens gehomogeniseerd sputum met een naald van 18 gauge en voegt u één milliliter van het patiëntensputum toe aan elke serumfles.

Plaats vervolgens met behulp van een steriel pincet de geautoclaveerde rubberen stoppen op de bovenkant van elke serumfles, druk de rubberen stoppen naar beneden zonder de onderkant van de stop aan te raken. Nadat u de flessen van de kap hebt verwijderd, brengt u de aluminium afdichtingen aan en krimpt u deze. Verwijder het middelpunt van de afdichtingen en veeg de bovenkant van de flessen af met een alcoholdoekje en passeer de flesafdichting door een Bunsen-brandervlam.

Bevestig nu een steriele naald van 18 gauge op een spuit met een plunjerlijst met een filter, steek eerst de aangebrachte gasafgiftespuit in de fles. Bevestig nu een steriele naald van 18 gauge op de gasafgifte van het systeem en steek de gasafgiftenaald ook in de fles. Leid de T-knooppunten vanuit de tanks door de zuurstofmonitor.

Na het verifiëren van de beoogde zuurstofconcentratie die door het systeem stroomt, richt u zich op ongeveer vijf liter per minuut gasstroom. Leid de T-knooppunten van de tanks om naar de gasafgifte. Als het gas door de serumfles begint te stromen, let dan goed op de manometer en als de druk onverwacht toeneemt, sluit u het systeem onmiddellijk uit.

Na het hardlopen sparren zuurstof gedurende één minuut door de serumfles met vijf liter per minuut, de instellingen maken 10 luchtuitwisselingen mogelijk en zorgen ervoor dat de interne atmosfeer de gewenste concentratie van 100% zuurstof bereikt. Verwijder de gasafgifte, 18 gauge naald. Nadat u de druk in de serumfles tot één atmosfeer hebt laten opbouwen, verwijdert u onmiddellijk de gasafgiftenaald.

Incubeer de serumflessen in een incubator shaker van 37 graden Celsius met 150 rotaties per minuut gedurende intervallen van 3, 24 uur. Alec Watts worden genomen op elk 24-uurs interval voor downstream analyse en monsters worden elke keer gere resparged. Het voorbeeld hier laat zien hoe een cultuur eruit kan zien voor en na incubatie.

De uitstroom zuurstof- en pH-waarden werden gemeten in de loop van het kweekproces voor sputummonsters die op 37 graden Celsius werden gehouden. Met beide spaarintervallen van 12 uur en 24 uur werden de zuurstofconcentraties in de loop van de tijd ongeveer gehandhaafd met een matige daling van de zuurstofconcentratie waargenomen voor alle drie de omstandigheden. De gemeten pH-waarden lagen binnen het fysiologische bereik zonder significante veranderingen in de loop van de tijd.

De vergelijking van microbiële belasting, diversiteit en samenstelling van de gemeenschap tussen ongecultiveerd en gekweekt sputum onthulde een 20-voudige toename van microbiële belasting in gekweekt sputum. Diversiteitsstatistieken gaven het behoud van de samenstelling van de gemeenschap aan met minimale wereldwijde verschillen die door het cultuurproces werden geïntroduceerd. Vergelijkende analyse van de 120 microbiële soorten in gekweekt en ongecultiveerd sputum werd uitgevoerd door meta-genomische sequencing.

46 van deze soorten werden geïdentificeerd in zowel ongekweekte als gekweekte monsters. Terwijl 35 uitsluitend werden geïdentificeerd in niet-gekweekte monsters en 39 uitsluitend werden geïdentificeerd in gekweekte monsters. Absorberende groeicurven werden gegenereerd voor veel voorkomende CF-longpathogenen gekweekt in kunstmatige sputummedia uit patiëntmonsterisolaten onder een normale zuurstofconcentratie van 21%.

Geen verandering in de tijd in de optische dichtheid bij 600 nanometer in de ASM alleen negatieve controle wees op contaminatievrije cultuur. De typische waargenomen groeicurvepatronen geven aan dat ASM-medium kan worden gebruikt voor het genereren van groeicurven met behulp van optische methoden. De metagenomische sequencing wordt hier gebruikt om de samenstelling van microbiële gemeenschappen te beschrijven.

Andere technieken zoals metatranscriptomische sequencing kunnen worden gebruikt om genexpressie of metabolomica te evalueren om de productie van metabolieten te evalueren.