Synthese en karakterisering van mRNA-geladen poly (bèta-aminoesters) nanodeeltjes voor vaccinatiedoeleinden

Dit protocol is belangrijk omdat het aantoont hoe polymere nanodeeltjes, ingekapselde nucleïnezuren in één eenvoudige stap kunnen worden ingekapseld. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn veelzijdigheid, omdat deze kan worden toegepast op verschillende nucleïnezuren en celtypen. Het gebruik van eenvoudige procedures voor deeltjesvoorbereiding, zoals pipetteren op en neer, en de mogelijkheid om de stabiliteit van de nanodeeltjes en trommelcondities te verlengen door lyofilisatie.

De procedure wordt gedemonstreerd door Laura Olmo, Coral Garcia-Fernandez, Maria Stampa Lopez-Pinto en Maria Navalon-Lopez, promovenda van ons laboratorium en Marta Diaz-Caballero, een postdoc voor ons laboratorium. Voor de vorming van polyplexen ontdooit u de eerder bereide polymeren, C6-peptide, poly bèta-aminoesters en vortex de oplossing. Na het pipetteren van het polymeermengsel op en neer, bereidt u een 12,5 millimolar oplossing in natriumacetaat.

Vortex de oplossing en wacht 10 minuten. Bereid vervolgens mRNA voor op 0,5 milligram per milliliter en meng door pipetteren. Vortex de polymeeroplossing opnieuw, meng vervolgens de genetische materiaaloplossing in de polymeeroplossing in een één-op-één-verhouding in een microcentrifugebuis en incubeer de buis bij 25 graden Celsius gedurende 30 minuten in een Thermoblock.

Na incubatie slaat u het mengsel neer met één tot twee RNase-vrij water door het monster toe te voegen aan een microcentrifugebuis die het water bevat, en vervolgens om de hulpstoffen op te nemen, een 20 millimolaire hopen en 4% sucrose-oplossing toe in hetzelfde volume als het mengsel van mRNA en poly bèta-aminoesters, en gemengd door pipetteren. Voor lyofilisatie na het invriezen van de polyplexoplossing bij min 80 graden Celsius gedurende één uur, voert u de primaire droging uit en slaat u de polyplexen onmiddellijk op bij min 20 graden Celsius om rehydratatie te voorkomen. Verwijder voor polyplex resuspensie de gelyofiliseerde nanodeeltjes uit de vriezer van min 20 graden Celsius en voeg snel de overeenkomstige hoeveelheid diep gehydrogeneerd water toe om de vaste stof opnieuw te verspreiden en de gewenste concentratie te bereiken.

Pipetteer voorzichtig tot de totale resuspensie en pipetteer, eenmaal opgelost, krachtig op en neer om bubbels te vermijden. Na 24 uur transfectie voor kwalitatieve beoordeling door fluorescentiemicroscopie, plaatst u de 96-putplaat met de getransfecteerde Hela-cellen op de microscoop en begint u te visualiseren met behulp van het 10-voudige objectief. Pas eerst een witbalans toe om een achtergrondverwijzing voor de software te maken en verkrijg vervolgens een afbeelding om deze tijdens de analyse met het fluorescentiebeeld te bedekken.

Wijzig de microscoopmodus in de reflectiemodus en verplaats het filterwiel naar de blauwe laser om EGFP te visualiseren. Verkrijg vervolgens afbeeldingen voor alle omstandigheden of putten met dezelfde belichtingstijd. Voor kwantitatieve beoordeling door flowcytometrie, was de Hela-cellen getransfecteerd in een 96-putplaat met 100 microliter PBS per put.

Na het aspirateren van de PBS op 25 microliter trypsine per put en incuberen bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten. Zodra de cellen zijn losgemaakt, voegt u de eerder teruggewonnen media toe om het trypsine te inactiveren en fixeert u de cellen door 31,25 microliter 10% formaline per put toe te voegen en gedurende 20 minuten te broeden. Schakel vervolgens de flowcytometer en de software in en stel vervolgens de juiste omstandigheden in voor het experiment, inclusief het type plaatmonstervolume en andere parameters zoals schudden en spoelen tussen monsters.

Stel de juiste parameters in om het percentage positief getransfecteerde cellen te kwantificeren door eerst de stroomgegevens te bekijken op voorwaarts verstrooid licht versus zijdelings verstrooid licht om de cellen van het puin te onderscheiden. En dan nog een scatterplot uitzetten, waarbij de amplitude versus hoogte wordt vergeleken met gate en individuele cellen worden onderscheiden. Een dag voor transfectie, plaat 10.000 JAWS II cellen per put in een 96 put plaat voor overnight incubatie.

De volgende dag transfecteren de cellen met 0,6 microgram mRNA per put en incuberen de plaat gedurende 24 uur in een droge luchtincubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Was de volgende dag de cellen die in de put achterblijven met 25 microliter PBS. Na het aspirateren van de PBS op 25 microliter trypsine en het incuberen van de plaat gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius om de cellen los te maken.

Stop de trypsinereactie door de eerder herstelde media toe te voegen aan de correspondentput. Centrifugeer vervolgens de plaat, zuig de media aan en fixeer de cellen door 50 microliter PBS en 2,5% formaline per put toe te voegen, gevolgd door de plaat gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius te incuberen, de plaat te centrifugeren. Voeg vervolgens 50 microliter PBS en 3% BSA per put en incubator toe gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius.

Na incubatiecentrifugeer de plaat opnieuw, voeg dan 50 microliter van het ovalbumine-antilichaam van de muis toe in PBS en 3% BSA en incubator gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Herhaal de centrifugatiestap en was de cellen vervolgens met 50 microliter PBS. Voeg na het aspirateren van de PBS de secundaire antilichamen toe en incubeer gedurende een uur bij vier graden Celsius.

Herhaal na de incubatie de centrifugeer- en wasstappen. Resuspend vervolgens de cellen en 100 microliter PBS en 2,5% formaline voor flowcytometrie-analyse. Fysiochemische karakterisering van verse en gelyofiliseerde GFP-mRNA dat nanodeeltjes inkapselt, vertoont geen significante verschillen in grootte en polydispergelijkheidsindex.

Transmissie-elektronenmicroscopie van de polyplexen bevestigt de vorming van bolvormige en monogedispergeerde nanodeeltjes met een diameter van ongeveer 50 nanometer. Encapsulatie-efficiëntiegegevens van een Lego-peptide en gemodificeerde poly bèta-aminoesterpolyplexen die GFP of ovalbumine inkapselen, vertonen geen significante verschillen, afhankelijk van het type mRNA. Een kwalitatieve analyse van EGFP-expressie, 24 uur na de transactie in de JAWS II-cellijn, wordt hier getoond.

Kwantitatief vergeleken met de negatieve controle. Het percentage GFP-positieve cellen is significant hoger en vergelijkbaar met een positieve controle uitgevoerd met een klassiek transfectiereagens. De ovalbumine mRNA geladen oligopeptide en gemodificeerde poly beta amino ester nanodeeltjes kunnen dendritische cellen activeren, zoals te zien is aan de significant hogere expressie van CD11b en CD86 membraanmarkers in getransfecteerde cellen in vergelijking met niet-getransfecteerde cellen.

Ons vaccinatieplatform op basis van het gebruik van mRNA als actief bestanddeel, evenals onze gepatenteerde polymeren kunnen worden aangepast om te worden gebruikt in profylaxe en voor kankertherapieën. We kunnen onze technologie gebruiken om die bijdrage in de immunotherapeutica voor kanker te benadrukken. omdat we tumor-geassocieerde antigenen in onze nanodeeltjes kunnen inkapselen en een verschuiving kunnen maken in kankerbehandelingen.