Kwantificering van dopaminerge neuron morfologische verandering en degeneratie in Caenorhabditis elegans

In deze video laten we zien hoe we een zevenpuntenscoresysteem kunnen gebruiken om veranderingen in dopaminerge neuron dendrietmorfologie in C.elegans te kwantificeren. Er is momenteel een grote variatie in analytische methoden voor het kwantificeren van neurodegeneratie in wormen. Bovendien richten sommige bestaande vaardigheden zich alleen op cellichamen en zijn ze niet gevoelig voor bepaalde soorten en niveaus van schade.

Het doel van de introductie van dit scoresysteem is om de mogelijkheid te bieden om een uitgebreid beeld te krijgen van neurodegeneratie op alle niveaus van schade, en om een universeel systeem te bieden om consistentie te ondersteunen in C.elegans dopaminerge neurodegeneratie-onderzoek. Hier zullen we demonstreren hoe neuronen onder fluorescentie in beeld kunnen worden brengen, scores kunnen toewijzen aan de dendrieten van die neuronen en een voorbeeld kunnen bekijken van hoe de resultaten moeten worden weergegeven en geïnterpreteerd. Pipetteer of pluk voor elke experimentele groep 20 tot 30 wormen naar een beeldvormingsplatform dat compatibel is met de beeldvormingsmicroscoop.

De meest voorkomende platforms zijn 2% agarose-pads gemonteerd op glazen dia's met een afdekslip en 96-well-platen met putvolumes op of minder dan 100 microliter vloeibaar medium. Laat wormen volledig verlammen. Dit kan enkele minuten duren.

Laad het voorbereide beeldvormingsplatform in een beeldvormingsmicroscoop die in staat is tot z-stack-opnamen. Lokaliseer het hoofdgebied van de worm eerst in een helder veld en vervolgens onder een enkele kleur GFP-fluorescentie met behulp van de beeldvormingsmicroscoop. De worm wordt hier weergegeven in een vergroting van 400x.

Blader door de focus om de boven- en ondergrenzen te vinden waar de dendrieten duidelijk zijn. Stel deze in als boven- en ondergrenzen voor het vastleggen van z-stack-afbeeldingen. Selecteer de gewenste plaats.

Hier gebruiken we één micrometer. Klik om z-stack-afbeeldingen vast te leggen in het GFP-fluorescentiekanaal. Open voor elke z-stack het afbeeldingsbestand met behulp van de microscoopsoftware of een externe beeldanalysesoftware.

Laad de stack in de software en comprimeer de stack tot één afgevlakte afbeelding. Lijn afbeeldingen tussen en binnen behandelingsgroepen handmatig of met behulp van automatische wikkelsoftware uit. Werk met één neuronbeeld tegelijk.

Kies een van de vier CEP-dendrieten om te beoordelen op blebs, breaks en onregelmatigheden, waaronder bochten, knikken en curven. Scoren van links naar rechts wanneer de neus zich bovenaan het beeld bevindt, wordt aanbevolen om herhaalbaarheid bij het scoren te garanderen. Gebruik deze richtlijnen om aan elke dendriet één scorewaarde toe te wijzen.

Wijs een score van nul toe voor dendrieten zonder zichtbare schade, een score van één voor dendrieten met onregelmatigheden maar geen blobbing of breuk, een score van twee voor dendrieten met minder dan vijf blebs, een score van drie voor tussen de vijf en 10 blebs, een score van vier voor meer dan 10 blebs en/of breuk die tot 25% van de dendriet verwijdert, een score van vijf voor breuk die 25 tot 75% van de dendriet verwijdert, en een score van zes als meer dan 75% van de dendriet afwezig is. Als aan meerdere criteria wordt voldaan binnen één dendriet, overweeg dan de criteria die overeenkomen met de hoogste score. Deze representatieve scorebeelden in figuur 1 van het artikel bij deze video kunnen als referentie worden gebruikt.

Om de score te demonstreren, zullen we door het toewijzen van scores aan een paar voorbeeld neuronbeelden lopen. Begin met de bovenste meest dendriet, er zijn geen zichtbare blebs, breuken of onregelmatigheden. Wijs een score van nul toe.

De tweede dendriet heeft ongeveer 14 blebs en geen zichtbare breuken. Wijs een score van vier toe. De derde dendriet kan niet in zijn geheel worden gezien vanwege overlap met dendriet twee en kan niet worden gescoord.

De onderste meest dendriet heeft ongeveer 11 blebs en een paar pauzes. Wijs een score van vijf toe. In deze afbeelding zijn slechts drie dendrieten verschroeibaar, omdat één dendriet niet volledig werd vastgelegd in de z-stack-opname.

Er is geen blebbing op de drie zichtbare dendrieten. Dit zou dus van boven naar beneden gescoord worden als een nul, een nul, en door de knik hier een één. Ten slotte zijn in deze afbeelding alle vier de dendrieten voor meer dan 75% verloren gegaan.

Alle dendrieten krijgen hier een score van zes. Noteer alle scores. Scores kunnen op dit moment worden ontblind.

Het scoresjabloon dat hier wordt gebruikt, is te vinden in de aanvullende bestanden. Deel neurodegeneratiescores door het totale aantal gescoorde dendrieten in de behandelingsgroep. Presenteer gegevens als percentage dendrieten binnen de behandelingsgroep bij elke neurodegeneratiescore.

Ons scoresysteem werd gebruikt om neurodegeneratie te beoordelen in L4 larvale stadium BY200 C.elegans na blootstelling aan rotenon. De gegevens worden hier weergegeven als met de verhoudingen van het totale aantal dendrieten bij elke scorewaarde voor elke experimentele groep. We beschouwen elke dendriet gescoord als n 1.

In deze figuur kan een dosisafhankelijke neurodegeneratierespons op blootstelling aan rotenon worden gewaardeerd en wordt de specifieke uitsplitsing van de scoreverdeling duidelijk weergegeven. Deze experimentele groepen waren statistisch verschillend volgens een Chi-kwadraattest voor onafhankelijkheid aangevuld met een Bonferroni-correctie voor meerdere vergelijkingen. In deze video hebben we gedemonstreerd hoe we de zevenpuntsschaal kunnen gebruiken die in ons laboratorium is ontwikkeld om niveaus van dopaminerge neuron morfologische verandering en degeneratie in C.elegans te kwantificeren.

Het gebruik van de scoringsmethode bevordert de consistentie in de analyse en maakt vergelijking mogelijk tussen neurodegeneratie-onderzoeken bij wormen. Ons scoresysteem kan worden gebruikt om gegevens te analyseren die zijn afgeleid van C.elegans-experimenten die celspecifieke fluorescerende verslaggevers gebruiken, zoals dat-1 dopaminetransporter-gen dat visualisatie van dopaminerge neuronen mogelijk maakt. Vind nu een oefenset met commentaar die kan worden gebruikt om de scoringsconsistentie van onderzoekers die nieuw zijn in deze methode te trainen, te kalibreren en te beoordelen in het aanvullende materiaal van dit artikel.