Meten van mitochondriale substraatflux in recombinante perfringolysine O-permeabiliseerde cellen

Omdat het mitochondriale substraatflux test die kan worden beïnvloed door verschillende pathologieën of behandelingen. Vandaag zullen we het bijvoorbeeld gebruiken om de reactie van kankercellen op de behandeling met metformine te onthullen. Het vereist een minimaal aantal cellen, terwijl het voldoende replicaties en passende controle voor elk afzonderlijk materiaal heeft.

De analyzer is alleen voor onderzoeksdoeleinden. Deze techniek kan fouten in het mitochondriale metabolisme identificeren en kan worden gebruikt om krijgersgeneesmiddelen te evalueren die mitochondriën beïnvloeden. Karolina Vaneckova, een studente en onderzoekstechnicus van mijn laboratorium, demonstreert de procedure.

Om te beginnen zaad A549 cellen met een dichtheid van 20.000 cellen per put in kolommen, twee tot 11 van een zeepaardje XF 96 celkweek microplaat. Kolommen één en 12 leeg laten als achtergrondputten. Vul de lege putten met een gelijk volume van het celkweekmedium en incubeer vervolgens de cellen bij 37 graden Celsius in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide voor celaanhechting.

Voeg na drie tot vier uur 100 microliter celkweekmedium toe in de Wells. Behandel de experimentele groep kolommen zeven tot en met 11 met één millimolaire metformine en de controlegroep met een gelijk volume steriel gedestilleerd water en breng de plaat vervolgens terug naar de incubator. Voor het hydrateren van de sensoren pipetteer je 200 microliter steriel water per put in de gebruiksplaat.

Breng vervolgens de sensorcartridge voorzichtig terug terwijl u de sensor onderdompelt in water. Incubeer de patroon in een kooldioxidevrije incubator bij 37 graden Celsius tot de volgende dag. Schakel de analyzer en de besturingseenheid in.

Start de software voor instrumentbesturing en gegevensverzameling en ontwerp het testprotocol zoals beschreven in het tekstmanuscript. Maak volgens groepsdefinities vier injectiestrategieën waarbij poort A verschilt afhankelijk van het geïnjecteerde substraat en noem de strategieën naar de substraten of afkortingen. Wijs Oligomycine toe aan poort B, FCCP aan poort C en Rotenone Antimycine A-mengsel aan poort D.Maak en benoem acht groepen, onder de plaatkaart, wijs groepen toe aan de overeenkomstige putten.

Sla het protocol vervolgens op als een gebruiksklare sjabloon. Laat de analyzer inschakelen om de temperatuur 's nachts te stabiliseren. Gooi de volgende dag het water van de nutsplaat weg en voeg 200 microliter van de voorverwarmde kalibrant per put toe aan de nutsplaat.

Breng de patroon terug naar de kooldioxidevrije incubator tot het moment van de test. Zorg voor een vochtbron in de incubator en schakel de ventilatorsnelheid uit of verlaag deze tot een minimum, om snelle verdamping van het kalibrant te voorkomen. Bereid vijf milliliter van de werkoplossing van de substraten en remmers met voorverwarmde tweemaal mitochondriale assay-oplossing, 5% BSA en steriel water zoals beschreven in het tekstmanuscript.

Laad vervolgens de injectorpoorten met substraat en remmers zoals beschreven in het belastinghandschrift. Voor kalibratie onder het tabblad run assay, klik op de start run om de assay te starten. Plaats de geladen censorcartridge en wacht tot de kalibratie is voltooid.

Bereid een testmedium van 20 milliliter door twee keer mitochondriale assay-oplossing, steriel water en 5% BSA in een buis van 50 milliliter te mengen. Voeg twee microliter van 10 micromolair recombinant perfringolysine O toe om een concentratie van één nanomolair te bereiken. En suspensie het mengsel opnieuw met zacht pipetteren, waardoor schudden en vortexing worden vermeden.

Incubeer de buis bij 37 graden Celsius tot gebruik. Gebruik een meerkanaalspipet om de cellen en de lege putten twee keer te wassen, met behulp van een voorverwarmde calcium- en magnesiumvrije PBS-oplossing. Gooi de PBS weg en voeg 180 microliter van het voorverwarmde testmedium toe voor celpermeabilisatie.

Vervang onmiddellijk na permeabilisatie de gebruiksplaat van de gekalibreerde sensorcartridge door de celplaat met gepermeabiliseerde cellen en start de meting. De behandelingsgroep had een hogere snelheid van door succinaat geïnduceerde ademhaling. De respons van A549-cellen op behandeling met metformine was hoger dan hep G2. Voor de door pyruvaatmalaat geïnduceerde ademhaling vertoonden A549-cellen een verhoogde inductie in vergelijking met Hep G2-cellen tussen vijf en 15 minuten.

Vergelijkbare resultaten werden verkregen voor glutamaatmalaat geïnduceerde ademhaling en palmitoylcarnitine malaat geïnduceerde ademhaling. Om de juiste concentratie van substraat en remmers te bereiken. Het juiste volume moet in de juiste poort worden geladen.

Wanneer een verandering in een metabole route van een bepaald substraat wordt vastgesteld, zal het nodig zijn om de functie van de enzymen en transporters die bij die route betrokken zijn, te beoordelen.