Verbeterde enzymbeschermingstest om staphylococcus aureus internalisatie en intracellulaire werkzaamheid van antimicrobiële verbindingen te bestuderen
8 september 2021
Dit protocol heeft tot doel te beschrijven hoe de mate van Staphylococcus aureus internalisatie en het vermogen om te overleven in de menselijke gastheercel kan worden bestudeerd, evenals de intracellulaire werkzaamheid van antimicrobiële verbindingen.
De enzymbeschermingstest maakt het mogelijk om de mate van Staph aureus internalisatie en het vermogen om te overleven in aanhangende cellen te bestuderen, evenals de werkzaamheid van antimicrobiële verbinding. De verbeterde enzymbeschermingstest vereenvoudigt de technische behandeling aanzienlijk en maakt het mogelijk om geïnternaliseerde bacteriën te herstellen uit zwak hechtende cellen en cellen in suspensie. De procedure wordt gedemonstreerd door Josselin Rigaill, arts en promovendus uit mijn laboratorium.
Twee dagen voor de infectietest zaaien A549-epitheelcellen met een dichtheid van 2,0 keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter per put van een 24-well plaat en incuberen de cellen gedurende 48 uur bij 36 graden Celsius in 5% koolstofdioxide, totdat ze 100% confluentie bereiken. Verwijder en gooi op de dag van de test het gebruikte kweekmedium weg uit de drie putten die zijn bestemd voor het tellen van de A549-cellen en voeg één milliliter volledig infectiemedium toe met vijf microgram per milliliter Hoechst 33342 en één microgram per milliliter propidiumjodide. Incubeer de cellen gedurende 30 minuten en tel vervolgens met behulp van een breedveldfluorescentiemicroscoop het aantal cellen en bereken de levensvatbaarheid van de cel.
Om de bacteriële suspensie te bereiden, doseert u 25 milliliter volledig infectiemedium in een buis en verwarmt u deze voor op 36 graden Celsius. Pas vervolgens de Staphylococcus aureus-suspensie aan tot een OD van 0,5 in een volledig infectiemedium met behulp van een celdichtheidsmeter en bereid vervolgens 20 milliliter bacteriële suspensie voor celinenting voor celinenting door de cultuur in een volledig infectiemedium te verdunnen om een MOI van één te bereiken volgens het aantal cellen per put. Bepaal vervolgens met behulp van een automatische spiraalplater de Staphylococcus aureus-belasting van de verdunde bacteriële suspensie die moet worden gebruikt voor de celinentingsstap en incubeer de agarplaten gedurende 18 tot 24 uur bij 36 graden Celsius.
Tel de volgende dag het aantal kolonies met een kolonieteller om de nauwkeurige MOI voor elke geteste stam te berekenen. Observeer vóór de celinenting elke put van de 24-well-plaat door microscopie met lage vergroting om ervoor te zorgen dat de cellen gezond zijn en groeien zoals verwacht, verwijder en gooi vervolgens het gebruikte celkweekmedium van de 24-well-plaat en voeg 500 microliter van de bacteriële suspensie toe aan elke put met 100% confluente cellen. Incubeer de cellen gedurende twee uur bij 36 graden Celsius in 5% koolstofdioxide.
Om de intracellulaire bacteriën te kwantificeren met de verbeterde enzymbeschermingstest, bereidt u 4x lysisbuffer, 2% Triton X-100, trypsine-EDTA en lysostaphin-voorraad voor in werkoplossingen zoals vermeld in het tekstmanuscript. Bereid vervolgens 6,25 milliliter volledig infectiemedium aangevuld met lysostapine door zes milliliter volledig infectiemedium toe te voegen aan 250 microliter van de lysostaphin-werkoplossing. Voeg vervolgens 250 microliter van het volledige infectiemedium aangevuld met lysostapine toe aan elke put en roer de plaat voorzichtig door de plaat met de hand te draaien.
Om de lysostaphin in staat te stellen de extracellulaire bacteriën te doden, incubeer je de cellen gedurende een uur bij 36 graden Celsius in 5% koolstofdioxide en inactiveer je vervolgens de lysostaphin door 10 microliter proteïnase K met 20 microgram per milliliter in elke put toe te voegen en de cellen gedurende twee minuten bij kamertemperatuur te incuberen. Voeg vervolgens 250 microliter 4x lysisbuffer toe om de cellen te lyseren door osmotische shock en incubeer de cellen gedurende 10 minuten bij 36 graden Celsius. Pipetteer na de incubatie de cel meerdere keren op en neer om ervoor te zorgen dat de cellen volledig worden gelyseerd en gehomogeniseerd, gebruik vervolgens een automatische spiraalplater om de Staphylococcus aureusbelasting van elke put te bepalen en incubateer de agarplaten gedurende 18 tot 24 uur bij 36 graden Celsius.
Tel de volgende dag het aantal kolonies met een kolonieteller om de intracellulaire Staphylococcus aureus-belasting van elke put te berekenen. De internalisatie van twee stammen van Staphylococcus aureus door A549-epitheelcellen wordt hier afgebeeld. Met behulp van de enzymbeschermingstest die wasbeurten omvat om lysostaphin te verwijderen, waren de gemiddelde intracellulaire belastingen respectievelijk 4,46 en 0,49 log cfu per milliliter voor het SF8300-wildtype en de isogene mutant zonder respectievelijk de fnbA- en B-genen.
Met behulp van de verbeterde enzymbeschermingstest die proteïnase K gebruikt om lysostaphin te inactiveren, waren de belastingen respectievelijk 4,53 en 0,56 log kve per milliliter. Intracellulaire activiteit van vancomycine, rifampicine en levofloxacine tegen Staphylococcus aureus gemeten met behulp van enzymbeschermingstest wordt hier afgebeeld. De gemiddelde intracellulaire belastingen waren 4,57 log kve per milliliter voor controle, 4,51 voor vancomycine, 3,03 voor rifampicine en 2,91 voor levofloxacine.
Intensieve wasbeurten om het enzym te verwijderen hebben de neiging om de meest geïnfecteerde cellen los te maken, wat onnauwkeurige resultaten kan geven en het gebruik van het verbeterde protocol kan ondersteunen. De verbeterde enzymbeschermingstest maakt het gemakkelijker om Staph aureus internalisatie met organoïde te bestuderen en kan gemakkelijk worden aangepast op een screeningsysteem met een hoog gehalte dat wordt gebruikt door
Overzicht
Deze studie richt zich op het begrijpen van de internalisatie van Staphylococcus aureus in menselijke gastheercellen en de overlevingsmechanismen binnen deze cellen. Daarnaast wordt de effectiviteit van diverse antimicrobiële verbindingen tegen deze bacterie geëvalueerd met behulp van een verbeterde enzymbeschermingsassay.
Belangrijkste Componenten van de Studie
Onderzoeksgebied
- Microbiële pathogenese
- Antimicrobiële respons
- Cellulaire internalisatiedynamiek
Achtergrond
- Staphylococcus aureus vormt aanzienlijke klinische uitdagingen vanwege het vermogen om te overleven binnen gastheercellen.
- Inzicht in de internalisatie ervan kan bijdragen aan behandelstrategieën tegen infecties.
- Eerdere methoden kunnen beperkingen hebben bij het nauwkeurig kwantificeren van de bacteriële internalisatie.
Gebruikte methoden
- Verbeterde enzymbeschermingsassay voor het bestuderen van bacteriële internalisatie
- A549-epitheelcellen als gastcelmodel
- Fluorescentiemicroscopie, lysostafyllinebehandeling en kolonietellingsmethoden
Belangrijkste resultaten
- Gemiddelde intracellulaire belastingen van Staphylococcus aureus werden significant gekwantificeerd met behulp van de verbeterde assay.
- Gevarieerde effectiviteit van antimicrobiële verbindingen, waarbij vancomycine een hogere intracellulaire activiteit vertoonde.
- Het gemodificeerde protocol faciliteerde een nauwkeuriger meting van de bacteriële internalisatie.
Conclusies
- De studie presenteert een effectieve methode voor het kwantificeren van de overleving van Staphylococcus aureus in gastheercellen.
- Dit onderzoek biedt inzichten die essentieel zijn voor de ontwikkeling van behandelstrategieën tegen bacteriële infecties.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Een nauwkeurige kwantificering van de intracellulaire bacteriële belasting is essentieel voor het evalueren van de antimicrobiële werkzaamheid in niet-professionele fagocytaire cellen, waarbij traditionele assays de persistentie van pathogenen kunnen onderschatten. De verbeterde enzymbeschermingsassay pakt technische beperkingen aan bij het terugwinnen van geïnternaliseerde bacteriën uit zwak hechtende of gesuspendeerde cellen, waardoor de betrouwbaarheid bij antimicrobialen-screening in een vroeg stadium wordt verhoogd. Dit ondersteunt mechanistishe risicoreductie door consistente meting van de compound-activiteit tegen intracellulaire Staphylococcus aureus mogelijk te maken, wat bijdraagt aan beslissingen over lead-optimalisatie.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om de bijdrage van virulentiefactoren aan internalisatie en intracellulair overleven te onderzoeken, wat bijdraagt aan de validatie van targets voor anti-infectiestrategieën.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbare methode om isogene stammen te vergelijken, waardoor genetische determinanten van pathogeenpersistentie worden verduidelijkt.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve intracellulaire CFU-uitlezingen om de effectiviteit van verbindingen tegen geïnternaliseerde Staphylococcus aureus te beoordelen.
- Operationele waarde: Elimineert wasstappen die celdetachement veroorzaken, waardoor de robuustheid van de assay in adherente en suspensiemodellen, inclusief organoïden, wordt verbeterd.
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert de aanpassing voor high-content screening door lysis- en herstelstappen te vereenvoudigen, wat de doorvoer voor antimicrobiële profilering verhoogt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt ziekterelateerde modellering met behulp van adherente, niet-professionele fagocytische cellen en 3D-organoïdesystemen om intracellulaire niches na te bootsen.
- Operationele waarde: Maakt continuïteit mogelijk van hit-identificatie tot preklinische evaluatie door het bieden van een gestandaardiseerde metriek voor de intracellulaire bacteriële last.
Integratie van pipeline en workflow
De assay past binnen het continuüm van antimicrobiële ontdekking en verbindt targetvalidatie via fenotypische screening met preklinische efficiëntiebeoordeling door de intracellulaire pathogeenlast te kwantificeren als een cruciaal farmacodynamisch eindpunt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten van gastheer-pathogeeninteracties en virulentiemechanismen via gecontroleerde MOI en lysostaphine-beschermingsstappen.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve intracellulaire CFU-metingen die vergelijking van antimicrobiële verbindingen onder verschillende condities mogelijk maken.
- Analytics: Genereert log CFU/mL-uitlezingen waarmee teams de intracellulaire activiteit van verbindingen kunnen rangschikken en time-kill- of post-infectiebehandelingseffecten kunnen beoordelen.
- Translationeel Onderzoek: Sluit aan op preklinische workflows door een vertaalbare intracellulaire effectiviteitsmetriek te bieden die toepasbaar is op primaire cellen en organoïde modellen.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar intracellulair infectieplatform dat aanpasbaar is aan meerdere pathogenen en celtypen buiten Staphylococcus aureus.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in antimicrobiële werking door extracellulaire effecten te onderscheiden van intracellulaire effecten.
- Operationele waarde: Standardiseert het herstel van intracellulaire bacteriën, waardoor variabiliteit door celverlies tijdens de verwerking wordt geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door verbindingen met werkelijke intracellulaire activiteit te onthullen, wat het risico op falen in een late fase verlaagt.
- Impact op de portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van leads mogelijk op basis van gegevens over intracellulaire effectiviteit, wat de kapitaalefficiëntie in anti-infectieuze programma's verbetert.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in celkweek, de berekening van de multiplicity of infection en de omgang met anaerobe of facultatieve pathogenen.
- Afhankelijk van toegang tot lysostafine, proteinase K, lysisbuffers en spiraalplaten voor een nauwkeurige CFU-kwantificering.
- Maakt standaardisatie van de MOI, de blootstellingstijd aan lysostafine en de inactivatieprotocollen tussen laboratoria noodzakelijk.
- Aanpassing aan primaire cellen of 3D-modellen kan optimalisatie van de lysostafine-penetratie en de lysiscondities vereisen.
- Praktische beperking: De duur van de assay overschrijdt 24 uur, wat ultra-high-throughput screeningcampagnes kan beperken.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:41
Determination of Cell Density and Viability
1:33
Preparation of the Bacterial Suspension
2:32
Cell Inoculation
3:03
Quantification of Intracellular Bacteria with Improved Enzyme Protection Assay (iEPA)
4:44
Results: Intracellular Staphylococcus aureus Load in Epithelial Cells
5:54
Conclusion
