Beeldvorming mitochondriale Ca²⁺ opname in astrocyten en neuronen met behulp van genetisch gecodeerde Ca²⁺ indicatoren (GECI's)

De procedure wordt gedemonstreerd door afgestudeerde student Zhe Zhang, onderzoeksspecialist Nannan Zhang, professoren Illker Ozden en Shinghua Ding. Het algemene doel van deze procedure is het ontwikkelen van celtypespecifieke paar astrocyten en de neuronen en de mitochondriale targetingmethode voor in vitro en in vivo mitochondriale tellingen van beeldvorming met behulp van genetisch gecodeerde calciumindicator, GCaMP5G en 6s. Voor in vitro of in vivo beeldvorming zullen we DNA-plasmiden construeren die astrocyten- of neuronenspecifieke promotors gfaABC1D of CaMKII en genetisch gecodeerde calciumindicatoren, GCaMP5G / 6s bevatten met mitochondriale targetingsequenties.

Voor in vitro mitochondriale calciumbeeldvorming transfecteerden we astrocytenneuronen gekweekt op glazen afdekslips met de bovengenoemde DNA-plasmiden met behulp van de Lipofectamine-methode. Beeldvorming kan één tot twee dagen na transfectie worden gestart door de glazen afdeksels over te brengen naar de injectiekamer onder een epifluorescentie- of tweefotonenmicroscoop. Hier zijn voorbeelden van fluorescerende signalen van mitochondriën en een astrocyt die GCaMP6s aan de linkerkant tot expressie brengt, en voor mitochondriën in een neuron, die GCaMP5G aan de rechterkant tot expressie brengen.

Voor in vivo beeldvorming bereidden we serotype 5 geassocieerd adenovirus voor expressie van mito-GCaMP5G in astrocyten en serotype 9 geassocieerd adenovirus voor expressie van mito-GCaMP6s in neuronen. Voor stereotaxische virusinjectieoperaties hebben we de muis eerst verdoofd met 3%isofluraan. Later tijdens de operatie worden de isofluraanspiegels verlaagd tot 2% Nadat het juiste niveau van anesthesie is bereikt, wordt het haar over de hoofdhuid geschoren en wordt de muis op een stereotax-operatie-instrument geplaatst.

Een oogheelkundige zalf wordt op de ogen aangebracht om ze tijdens de operatie te beschermen. De injectieoperaties worden uitgevoerd met behulp van aseptische procedures, waaronder steriele instrumenten en aseptische technieken. De chirurgische instrumenten worden gesteriliseerd door autoclaveren of door een hete kraalsterilisator.

Nadat de muis op de stereotaks is gemonteerd, wordt de hoofdhuid drie keer gereinigd met betadine en 70% ethanol. Vervolgens wordt de huid opengesneden langs de Bregma Lambda-as en wordt de verticaal gemaakt door een snelle boor over de doellocatie. In dit werk richtten we ons op de motorische cortex of de paracortex.

Een 33 gauge Hamilton-spuit met een bijbehorende adenovirusvector wordt door het gat in de hersenen ingebracht en vectoren worden geïnjecteerd in het doelgebied. Voor corticale toediening injecteren we de virusoplossing op twee diepten in meerdere stappen. Eerst steken we de naald een millimeter diep in de cortex.

Na vijf minuten de hersenen te hebben gegeven om te herstellen, verplaatsen we de naald tot 700 micrometer diep, injecteren we 500 nanoliter virusoplossing. Nadat de injectie is voltooid, wachten we vijf minuten om het virus in de hersenen te laten diffunderen. En dan verplaatsen we de naald naar de tweede injectielocatie op 300 micrometer diep.

Hier injecteren we nog eens 500 nano-liter virusoplossing. Nadat de injectie is voltooid, wachten we 10 minuten om het virus te laten diffunderen en dan verwijderen we de naald uit de hersenen en sluiten we het braamgat met botwas of Kwik-Sil. Ten slotte wordt de huid gehecht met Vetbond en wordt de muis teruggevonden op een verwarmingskussen voordat hij wordt teruggestuurd naar de dierenfaciliteit.

De muis zal binnen minimaal drie weken klaar zijn voor gebruik voor in vivo beeldvorming, wat het tijdsbestek is waarin GCaMP-expressie rijpt. Craniale raamimplantatieoperaties worden ook gedaan met behulp van aseptische aandoeningen zoals beschreven voor injectieoperaties. De craniale raamchirurgische procedures zijn identiek aan de injectiechirurgische procedures tot het punt van blootstelling aan de schedel.

Zodra de schedel is blootgesteld, worden kwarten van een craniotomie met een diameter van 2-3 mm over het virus geïnjecteerde gebied gemarkeerd met vier ondiepe gaten gemaakt door een boor met hoge snelheid die aan een manipulator is bevestigd. Vervolgens wordt het gedeelte van de schedel, bij de kloven van de craniotomie, verdund door het bot voorzichtig en langzaam in een cirkel rond te boren en deze vier gaten met elkaar te verbinden. Zodra de schedel aan de randen dun genoeg is, wordt het bot met een scherp pincet opgetild en verwijderd.

De blootgestelde dura mater kan worden verwijderd of intact worden gehouden voor implantatie van het schedelvenster. Ons schedelraam bestaat uit een glazen afdekplaat van 3-5 millimeter in diameter, waardoor een siliconenschijf van ongeveer 300 micron dik in het midden ontstaat. De montage van het schedelraam wordt bereikt door het over de craniotomie te plaatsen.

Een stuk tandenstoker bevestigd aan een manipulator wordt gebruikt om het schedelvenster zachtjes op het oppervlak van de hersenen te duwen. Vervolgens wordt de rand van het schedelraam afgedicht met een kleine hoeveelheid siliconenlijm Kwik-Sil. Ten slotte is het schedelvenster in de schedelranden bevestigd met tandacryl.

Er moet voor worden gezorgd dat het tandacryl iets over de randen van het schedelvenster wordt aangebracht voor een sterke hechting. Zoals veel andere onderzoeksgroepen in het verleden hebben geïmplementeerd, kan een 1,2% agarose-gel worden gebruikt tussen het dekglas en de hersenen als alternatief voor de siliconenschijf. Nadat het schedelvenster veilig is geïnstalleerd, wordt een metalen plaat aan de schedel bevestigd.

Deze kopplaat zal worden gebruikt voor het bevestigen van de kop van de muis op het podium van een microscoop met twee fotonen tijdens beeldvormingssessies. Mitochondriale calciumopname in astrocyten kan worden opgewekt door ATD-toepassing, terwijl mitochondriale calciumopname in neuronen kan worden opgewekt door glutamaatglycinetoepassing in kunstmatig hersenvocht, met zwaartekracht door een perfusiesysteem. Calciumopname in individuele mitochondriën in astrocyten en neuronen kan dan worden waargenomen.

De volgende films tonen mitochondriale calciumopname in een astrocyte opgewekt door ATP aan de linkerkant en in een neuron opgewekt door glutamaat en glycine aan de rechterkant. De beeldvorming wordt gedaan door time-lapsed in vivo twee-fotonbeelden van mitochondriale fluorescerende signalen in astrocyten en neuronen te verzamelen met een Ultima twee-foton microscopiesysteem van Prairie Technologies, dat is uitgerust met een miljoen Ti Sapphire Ultra één laser van Coherent. We gebruiken de excitatiegolflengten van 880 tot 910 nanometer, die optimaal zijn voor in vivo beeldvorming met GCaMP5G en 6s.

Astrocyten en neuron-specifieke expressie van mito-GCaMP5G en 6s en herbevestigd door co-lokalisatie van astrocyten-specifieke labeling van SR101 of neuron specifieke marker NeuN. Spontane mitochondriale calciumopname in astrocyten en neuronen in vivo kan worden waargenomen door time-lapse beeldvorming met behulp van twee-fotonenmicroscopie. Beelden tonen spontane calciumtoenames in individuele mitochondriën in een astrocyten aan de linkerkant en een neuron aan de rechterkant.

Onze benaderingen zijn nuttig voor celtypespecifieke mitochondriale calciumbeeldvorming in vitro en in vivo. Na het bekijken van deze video, zou je een goed begrip moeten hebben van hoe je mitochondriale calciumopname in astrocyten en in neuronen in beeld kunt brengen.