Name: Beeldvorming mitochondriale Ca2+ opname in astrocyten en neuronen met behulp van genetisch gecodeerde Ca2+ indicatoren (GECIs) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Leer mitochondriale calciumbeeldvorming in astrocyten en neuronen met behulp van genetisch gecodeerde calciumindicatoren GCaMP5G en GCaMP6s. Deze methode maakt celtype-specifieke in vitro en in vivo analyse van mitochondriale calciumdynamica mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Health National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) verleent R01NS069726 en R01NS094539 aan SD. Wij danken Erica DeMers voor de audio-opname.

Procedures met betrekking tot dieren zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Missouri-Columbia.
1. Constructie van DNA-plasmiden
OPMERKING: Voor in vitro en in vivo beeldvorming worden DNA-plasmiden geconstrueerd die coderen voor GCaMP5G/6s met astrocyten- en neuronspecifieke promotors en mitochondriale targetingsequenties.
<ol><li>Mitochondriale matrix (MM)-targeting sequence (mito-) ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGG CTCCCAGTGC CGCGCGCCAA GATCCATTCG TTG17 in de kloonlocaties EcoRI en BamHI in de ruggengraat van adeno-geassocieerd virus (AAV) plasmide pZac2.1 om plasmiden te verkrijgen die astrocytische gfaABC1D-promotor of neuronale CaMKII-promotor18,19,20bevatten.</li>
	<li>Subclone GCaMP5G/6s in de kloonlocaties BamH I en Not 1 in de bovenstaande plasmiden om nieuwe plasmiden pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G/6s en pZac-CaMKII-mito-GCaMP5G/6s te verkrijgen die zich richten op transgenexpressie in mitochondriën in astrocyten en neuronen20,21 (Figuur 1A).</li>
	<li>Bereid pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G en pZac-CaMKII-mito-GCaMP6s DNA-plasmiden voor transfectie voor in vitro onderzoek (sectie 2). Produceer AAV-vectoren met serotype 5 voor astrocyten en serotype 9 voor neuronen voor in vivo onderzoek18 (sectie 3).</li>
</ol>2. In vitro mitochondriale Ca2+ beeldvorming in astrocyten en neuronen
<ol><li>Bereid primaire astrocyten uit de cortex van P1 neonatale muizen en primaire neuronen uit de cortex van E15-16 embryo's18,22,23,24en kweek ze op glazen coverslips met een diameter van 12 mm in 24-putplaten met behulp van Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS) en neuronaal basaal medium (NBM) met 2% B27, respectievelijk.</li>
	<li>Transfecteer volwassen astrocyten en neuronen met pZac-gfaABC1D-GCaMP6s en pZac-CaMKII-GCaMP5G plasmiden met behulp van lipide gebaseerde transfectie reagens om GCaMP6s tot expressie te brengen in de mitochondriën van astrocyten en GCaMP5G in de mitochondriën van neuronen18,20,21. Transfecteer cellen in elke put met 0,5 μg DNA en verander het medium 6 uur later. OPMERKING: De astrocyten en neuronen zijn 1-2 dagen na transfectie klaar voor beeldvorming.</li>
	<li>Voer in vitro mitochondriale Ca2+ beeldvorming uit 1-2 dagen na transfectie.<ol>
<li>Breng de glazen coverslips gekweekt met astrocyten of neuronen over naar de PH-1 perfusiekamer onder een epifluorescentie of twee fotonenmicroscoop.</li>
		<li>Stimuleer astrocytische mitochondriale Ca2+ opname met 100 μM ATP in ACSF, of stimuleer neuronale mitochondriën met 100 μM glutamaat/10 μM glycine20,25 (Figuur 2 en Figuur 3). OPMERKING: Oplossingsveranderingen van ACSF naar ATP- en glutamaat/glycine-bevattende ACSF worden geregeld door een ALA-VM8-perfusiesysteem21. De snelheid van de oplossingsverandering wordt geregeld bij 1-2 ml / min door een klep aan te passen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. In vivo mitochondriale Ca2+ beeldvorming in astrocyten en neuronen
<ol><li>AAV voorbereidingen.<ol>
<li>Bereid de volgende recombinante adeno-geassocieerde virus (rAAV) vectoren met behulp van de DNA-plasmiden bereid in sectie 1: rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G en rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s vectoren. OPMERKING: In dit experiment werden rAAV-vectoren van serotype 5 voorbereid om GCaMP5G in mitochondriën in astrocyten tot expressie te brengen en rAAV-vectoren van serotype 9 werden voorbereid om GCaMP6's in mitochondriën in neuronen tot expressie te brengen.</li>
	</ol></li>
	<li>Stereotaxische AAV injectie.<ol>
<li>Verdoof de muis met 3% isofluraan. OPMERKING: Later tijdens de operatie worden de isofluraanspiegels verlaagd tot 2%.</li>
		<li>Nadat de muis een chirurgisch niveau van anesthesie heeft bereikt, zoals bepaald door staart- en teenknijpen, scheert u het haar over de operatieplaats, motorische of somatosensorische cortex, met een haartrimmer.</li>
		<li>Plaats de muis op het stereotaxische apparaat van de muis en bevestig het hoofd met oorstaven. Breng oogheelkundige zalf aan op de ogen om ze tijdens de operatie te beschermen. Gebruik een verwarmingskussen om de lichaamstemperatuur van de muis gedurende de hele operatie op 37 °C te houden. OPMERKING: Voer een operatie uit met behulp van aseptische procedures. Alle chirurgische hulpmiddelen moeten worden gesteriliseerd door middel van autoclaveren of een hete kraalsterilisator.</li>
		<li>Nadat de muis op het stereotaxische apparaat is gemonteerd, steriliseert u de hoofdhuid drie keer met afwisselend op jodium gebaseerde scrub en 70% ethanol. Maak een incisie in de middellijn van de hoofdhuid om de injectieplaats bloot te leggen.</li>
		<li>Snijd de huid in de bregma-lamda-as open en maak een braamgat met een diameter van ~ 1 mm met een boor met hoge snelheid op de beoogde injectielocatie van de motor of somatosensorische cortex.</li>
		<li>Gebruik een Hamilton-spuit van 33 G met adeno-geassocieerd virus (rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G-vectoren [1 x 1011 GC] of rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s vectoren [1 x 1011 GC]) om tot 1 μL virus in het doelgebied te injecteren. OPMERKING: Injecteer bijvoorbeeld voor corticale virale toediening de virusoplossing op twee diepten in meerdere stappen. Breng eerst de naald in op een diepte van 1 mm van de dura en laat 5 minuten intrekken voordat de hersenen zich herstellen. Beweeg vervolgens de naald tot ~ 700 μm diepte en injecteer 500 nL van de virusoplossing met een injectiesnelheid van 10 nL / s met behulp van een hamiltonspuit die wordt bestuurd door een microsyringe pompregelaar. Nadat de injectie is voltooid, wacht u 5 minuten om het virus in de hersenen te laten diffunderen. Verplaats vervolgens de naald naar de tweede injectieplaats op een diepte van 300 μm. Injecteer hier nog eens 500 nL van de virusoplossing. Wacht 10 minuten om het virus in de hersenen te laten diffunderen.</li>
		<li>Sluit de hoofdhuid en de huid met een weefsellijm. Laat de muizen herstellen op het verwarmingskussen. Stuur muizen na herstel terug naar de dierenfaciliteit.</li>
	</ol></li>
	<li>Cranial-window intstallatie en in vivo twee-foton (2-P) beeldvorming van mitochondriale Ca2+ signalen. OPMERKING: Craniale vensterimplantatie wordt 3 weken na AAV-injectie over de motorische of somatosensorische cortex26,27,28,29 gedaan. Carprofen (10 mg/kg) wordt subcutaan geïnjecteerd om verlichting te bieden van mogelijke pijn vóór de operatie. De craniale raamchirurgische procedures zijn identiek aan de AAV-injectiechirurgische procedures en worden uitgevoerd onder aseptische omstandigheden.<ol>
<li>Verdoof de muis met 3% isofluraan. OPMERKING: Dit is de aanvangsdosis en verlaag tot 2% voor de operatie later. Tijdens de beeldvorming wordt een intraperitoneale (IP) injectie van 130 mg ketamine/10 mg xylazine/kg lichaamsgewicht opgelost in ACSF gebruikt voor anesthesie.</li>
		<li>Plaats de muis op het stereotaxische apparaat van de muis en bevestig het hoofd met oorstaven. Breng oogheelkundige zalf aan op de ogen. Gebruik een verwarmingskussen om de lichaamstemperatuur van de muis gedurende de hele operatie op 37 °C te houden. OPMERKING: Alle chirurgische hulpmiddelen moeten worden gesteriliseerd.</li>
		<li>Maak een incisie van 5-8 mm lang in de middellijn van de hoofdhuid en verwijder een flap van de huid met een schaar.</li>
		<li>Nadat de schedel is blootgesteld, voert u craniotomie met een diameter van 2,0-3,0 mm uit met behulp van een snelle boor over het door het virus geïnjecteerde gebied (d.w.z. motorische cortex of somatosensorische cortex, figuur 1B). Maak eerst vier kleine gaatjes en boor dan mee in een cirkel die de gaten met elkaar verbindt. Til vervolgens het bot op en verwijder het met een scherpe schaar en verwijder het. De blootgestelde dura mater kan worden verwijderd of intact worden gehouden voor impantatie van het schedelraam.</li>
		<li>Plaats een glazen afdekplaat met een diameter van 3-5 mm met een transparante siliconen over de craniotomie. Gebruik een tandenstoker om het schedelraam zachtjes op het oppervlak van de hersenen te duwen. Sluit vervolgens de rand af met een kleine hoeveelheid siliconenlijm. OPMERKINGEN: Als alternatief kan in plaats van siliconenschijf 1,2% agarose-gel met een laag smeltpunt worden gebruikt tussen het dekglas en het hersenweefsel.</li>
		<li>Sluit ten slotte de randen van de afdekplaat af met tandcement. Zorg ervoor dat u het cement iets aanbrengt aan de rand van het schedelraam voor een sterke hechting. Bevestig een op maat gemaakte metalen kopplaat aan de schedel met tandcement. OPMERKING: De metalen plaat wordt gebruikt om de kop van de muis tijdens de beeldvormingssessie in het stadium van de 2-P-microscoop te bevestigen(figuur 1C).</li>
		<li>Voeg 0,5 ml ACSF-oplossing toe over de coverslip op het schedelvenster voor onderdompeling in water tijdens het afbeelden.</li>
		<li>Time-lapse in vivo 2-P beeldvorming van mito-GCaMP5G in astrocyten en mito-GCaMP6s uitvoeren in neuronen met een golflengte van 910 nm door het schedelvenster(Figuur 1C)18,20,27. OPMERKING: Tijdens het afbeelden zitten muizen op het verwarmingskussen om de fysiologische temperatuur te handhaven. De muizen worden onmiddellijk na afloop van de beeldvormingssessie opgeofferd.</li>
		<li>Label astrocyten in vivo met sulforhodamine 101 (SR101) wanneer het nodig is om colocalisatie te bepalen.<ol>
<li>Breng aan het einde van stap 3.3.4 gedurende 1-5 minuten 100 μL 100 μM SR101 in ACSF aan op het corticale oppervlak.</li>
			<li>Spoel het oppervlak af met ACSF om de ongebonden SR101 weg te spoelen. Met behulp van 2-P beeldvorming kan co-labeling van mito-GCaMP5G en SR101 in astrocyten 45-60 minuten later worden waargenomen(Figuur 4A).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Griffiths, E. J., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+as+a+key+regulator+of+mitochondrial+ATP+production+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium as a key regulator of mitochondrial ATP production in mammalian cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1787 (11), 1324-1333 (2009).</li>
<li>Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Ca2%2B+homeostasis%3A+mechanism%2C+role%2C+and+tissue+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv+-+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Ca2+ homeostasis: mechanism, role, and tissue specificities.</a> Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).</li>
<li>Llorente-Folch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-regulation+of+mitochondrial+respiration+maintains+ATP+homeostasis+and+requires+ARALAR%2FAGC1-malate+aspartate+shuttle+in+intact+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Calcium-regulation of mitochondrial respiration maintains ATP homeostasis and requires ARALAR/AGC1-malate aspartate shuttle in intact cortical neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (35), 13957-13971 (2013).</li>
<li>Burkeen, J. F., Womac, A. D., Earnest, D. J., Zoran, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+signaling+mediates+rhythmic+extracellular+ATP+accumulation+in+suprachiasmatic+nucleus+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium signaling mediates rhythmic extracellular ATP accumulation in suprachiasmatic nucleus astrocytes.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (23), 8432-8440 (2011).</li>
<li>Duchen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+calcium-dependent+neuronal+death+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv+-+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease.</a> Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 464 (1), 111-121 (2012).</li>
<li>Gouriou, Y., Demaurex, N., Bijlenga, P., De Marchi, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+handling+during+ischemia-induced+cell+death+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium handling during ischemia-induced cell death in neurons.</a> Biochimie. 93 (12), 2060-2067 (2011).</li>
<li>Qiu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+uniporter+Mcu+controls+excitotoxicity+and+is+transcriptionally+repressed+by+neuroprotective+nuclear+calcium+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium uniporter Mcu controls excitotoxicity and is transcriptionally repressed by neuroprotective nuclear calcium signals.</a> Nature Communications. 4, 2034(2013).</li>
<li>Filadi, R., Greotti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yin+and+yang+of+mitochondrial+Ca2%2B+signaling+in+cell+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The yin and yang of mitochondrial Ca2+ signaling in cell physiology and pathology.</a> Cell Calcium. 93, 102321(2021).</li>
<li>Finkel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ins+and+outs+of+mitochondrial+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">The ins and outs of mitochondrial calcium.</a> Circulation Research. 116 (11), 1810-1819 (2015).</li>
<li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li>
<li>Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+The+calcium+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: The calcium connection.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA. 1797 (6-7), 607-618 (2010).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
<li>Yamada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+genetically+encoded+Ca2%2B+indicators+in+cortical+pyramidal+cells+and+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of genetically encoded Ca2+ indicators in cortical pyramidal cells and cerebellar Purkinje cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 5, 18(2011).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+Calcium+Indicator+for+Neural+Activity+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging.</a> The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li>
<li>Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+green+fluorescent+protein+as+a+tool+for+visualizing+subcellular+organelles+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells.</a> Current Biology: CB. 5 (6), 635-642 (1995).</li>
<li>Xie, Y., Wang, T., Sun, G. Y., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+disruption+of+astrocytic+Ca2%2B+signaling+pathway+in+vivo+by+adeno-associated+viral+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Specific disruption of astrocytic Ca2+ signaling pathway in vivo by adeno-associated viral transduction.</a> Neuroscience. 170 (4), 992-1003 (2010).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFAP+promoter+elements+required+for+region-specific+and+astrocyte-specific+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression.</a> Glia. 56 (5), 481-493 (2008).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+mitochondrial+Ca2%2B+dynamics+in+astrocytes+using+cell-specific+mitochondria-targeted+GCaMP5G%2F6s%3A+Mitochondrial+Ca2%2B+uptake+and+cytosolic+Ca2%2B+availability+via+the+endoplasmic+reticulum+store%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Imaging of mitochondrial Ca2+ dynamics in astrocytes using cell-specific mitochondria-targeted GCaMP5G/6s: Mitochondrial Ca2+ uptake and cytosolic Ca2+ availability via the endoplasmic reticulum store.</a> Cell Calcium. 56 (6), 457-466 (2014).</li>
<li>Zhang, N., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+mitochondrial+and+cytosolic+Ca2%2B+signals+in+cultured+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Imaging of mitochondrial and cytosolic Ca2+ signals in cultured astrocytes.</a> Current Protocols in Neuroscience. 82, 1-11 (2018).</li>
<li>Bi, J., Li, H., Ye, S. Q., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-B-cell+colony-enhancing+factor+exerts+a+neuronal+protection+through+its+enzymatic+activity+and+the+reduction+of+mitochondrial+dysfunction+in+in+vitro+ischemic+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Pre-B-cell colony-enhancing factor exerts a neuronal protection through its enzymatic activity and the reduction of mitochondrial dysfunction in in vitro ischemic models.</a> Journal of Neurochemistry. 120 (2), 334-346 (2012).</li>
<li>Wang, X., Li, H., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-B-cell+colony-enhancing+factor+protects+against+apoptotic+neuronal+death+and+mitochondrial+damage+in+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Pre-B-cell colony-enhancing factor protects against apoptotic neuronal death and mitochondrial damage in ischemia.</a> Scientific Reports. 6, 32416(2016).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+NAMPT-mediated+NAD%2B+salvage+pathways+and+their+roles+in+bioenergetics+and+neuronal+protection+after+ischemic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Subcellular NAMPT-mediated NAD+ salvage pathways and their roles in bioenergetics and neuronal protection after ischemic injury.</a> Journal of Neurochemistry. 151 (6), 732-748 (2019).</li>
<li>Xie, Y., Chen, S., Wu, Y., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+deficits+in+parvalbumin+neuron+stimulation-evoked+network+activity+despite+recovery+of+dendritic+structure+and+excitability+in+the+somatosensory+cortex+following+global+ischemia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Prolonged deficits in parvalbumin neuron stimulation-evoked network activity despite recovery of dendritic structure and excitability in the somatosensory cortex following global ischemia in mice.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (45), 14890-14900 (2014).</li>
<li>Ding, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDing%2C+S+%22In+vivo+imaging+of+Ca2%2B+signaling+in+astrocytes+using+two-photon+laser+scanning+fluorescent+microscopy+in+Astrocytes%22">In vivo imaging of Ca2+ signaling in astrocytes using two-photon laser scanning fluorescent microscopy in Astrocytes</a>. Milner, R. , Humana Press. 545-554 (2012).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+IP3R2-mediated+Ca2%2B+signaling+pathway+in+astrocytes+ameliorates+neuronal+death+and+brain+damage+while+reducing+behavioral+deficits+after+focal+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Disruption of IP3R2-mediated Ca2+ signaling pathway in astrocytes ameliorates neuronal death and brain damage while reducing behavioral deficits after focal ischemic stroke.</a> Cell Calcium. 58 (6), 565-576 (2015).</li>
<li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photothrombosis+ischemia+stimulates+a+sustained+astrocytic+Ca2%2B+signaling+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Photothrombosis ischemia stimulates a sustained astrocytic Ca2+ signaling in vivo.</a> Glia. 57 (7), 767-776 (2009).</li>
<li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+astrocytic+Ca2%2B+signals+contribute+to+neuronal+excitotoxicity+after+status+epilepticus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enhanced astrocytic Ca2+ signals contribute to neuronal excitotoxicity after status epilepticus.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (40), 10674-10684 (2007).</li>
<li>Gobel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-endoplasmic+reticulum+contacts+in+reactive+astrocytes+promote+vascular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-endoplasmic reticulum contacts in reactive astrocytes promote vascular remodeling.</a> Cell Metabolism. 31 (4), 791-808 (2020).</li>
<li>Diaz-Garcia, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distinct+roles+of+calcium+in+rapid+control+of+neuronal+glycolysis+and+the+tricarboxylic+acid+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The distinct roles of calcium in rapid control of neuronal glycolysis and the tricarboxylic acid cycle.</a> eLife. 10, 64821(2021).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit artikel bieden we een methode en protocol voor het afbeelden van mitochondriale Ca2+ signalen in astrocyten en neuronen. We implementeerden mitochondria-targeting en celtype-specifieke strategieën om GECI GCaMP5G/6s tot expressie te brengen. Om GCaMP5G/6s in mitochondriën aan te pakken, hebben we een mitochondria-targeting sequentie in de plasmiden opgenomen. Om GCaMP5G/6s in vivoin astrocyten en neuronen tot expressie te brengen, hebben we een astrocytenspecifieke promotor gfaABC1D en neuronsp...

Mitochondriën zijn dynamische subcellulaire organellen en worden beschouwd als de celkrachtcentrales voor energieproductie. Aan de andere kant kunnen mitochondriën Ca2+ opnemen in de matrix als reactie op lokale of cytosolische Ca2+ stijgingen. Mitochondriale Ca2+ opname beïnvloedt de mitochondriale functie, inclusief metabole processen zoals reacties in de tricarbonzuur (TCA) cyclus en oxidatieve fosforylering, en reguleert Ca2+-gevoelige eiwitten onder fysiologische omstandigheden1,2,3,4. Mitochondriale Ca2+ overbelasting is ook een determinant voor celdood, waaronder necrose en apoptose bij verschillende hersenaandoeningen5,6,7. Het veroorzaakt de opening van mitochondriale permeabiliteitstransitieporiën (mPTPs) en de afgifte van caspase-cofactor, die apoptotische celdood initiëren. Daarom is het belangrijk om mitochondriale Ca2 + dynamiek en behandeling in levende cellen te bestuderen om cellulaire fysiologie en pathologie beter te begrijpen.
Mitochondriën handhaven matrix Ca2+ homeostase door een balans tussen Ca2+ opname en efflux. Mitochondriale Ca2+ opname wordt voornamelijk gemedieerd door mitochondriale Ca2+ uniporters (MCU's), terwijl mitochondriale Ca2+ efflux wordt gemedieerd door de Na+-Ca2+-Li+ wisselaars (NCLXs) en de H+/ Ca2+ wisselaars (mHCXs)8. Het evenwicht kan verstoord worden door de stimulatie van G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR's)9. Mitochondriale Ca2+ homeostase wordt ook beïnvloed door mitochondriale buffering door de vorming van onoplosbare xCa2+-xPO4x-xOH complexen8.
Intracellulaire en mitochondriale veranderingen in ca2+ concentratie ([Ca2+]) kunnen worden geëvalueerd door fluorescerende of luminescerende Ca2+ indicatoren. Ca2+ binding aan indicatoren veroorzaakt spectrale modificaties, waardoor vrije cellulaire [Ca2+] in real-time in levende cellen kan worden vastgelegd. Er zijn momenteel twee soorten sondes beschikbaar om Ca2+ veranderingen in cellen te monitoren: organische chemische indicatoren en genetisch gecodeerde Ca2+ indicatoren (GECI's). Over het algemeen zijn verschillende varianten met verschillende Ca2+ affiniteiten (gebaseerd op Kd),spectrale eigenschappen (excitatie- en emissiegolflengten), dynamische bereiken en gevoeligheden beschikbaar voor de onderzochte biologische vragen. Hoewel veel synthetische organische Ca2 + -indicatoren zijn gebruikt voor cytosolische Ca2 + -beeldvorming, kunnen slechts een paar selectief worden geladen in de mitochondriale matrix voor mitochondriale Ca2 + -beeldvorming, waarbij Rhod-2 het meest wordt gebruikt (voor beoordelingen zie10,11). Rhod-2 heeft echter een groot nadeel van lekkage tijdens lange tijd-cursus experimenten; bovendien is het verdeeld tussen mitochondriën, andere organellen en het cytosol, waardoor absolute metingen in verschillende subsecties moeilijk zijn. Door gebruik te maken van celtypespecifieke promotors en subcellulaire compartimentgerichte sequenties, kunnen GECI's daarentegen worden uitgedrukt in verschillende celtypen en subcellulaire compartimenten voor cel- en compartimentspecifieke Ca2+ beeldvorming in vitro of in vivo. Op fluorescentie-intensiteit gebaseerde GCaMP Ca2+-indicatoren met één golflengte zijn onlangs naar voren gekomen als belangrijke GECI's12,13,14,15,16. In dit artikel bieden we een protocol voor mitochondria-targeting en celtype specifieke expressie van GCaMP5G en GCaMP6s (GCaMP5G / 6s) in astrocyten en neuronen, en beeldvorming mitochondriale Ca2 + opname in deze celtypen. Met behulp van dit protocol kan de expressie van GCaMP6G / 6s in individuele mitochondriën worden onthuld en kan Ca2 + opname in enkele mitochondriale resolutie worden bereikt in astrocyten en neuronen in vitro en in vivo.

<table><tbody><tr><td>Kunstmatig traanoogzalf</td><td>Rugby</td><td>NDC-0536-6550-91</td><td>83% witte vaseline</td></tr><tr><td>Cyanoacrylaatlijm</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>3M Vetbond Adhesive</td></tr><tr><td>Dissectie stereomicroscoop</td><td>Nikon</td><td>SMZ 2B</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Dumont pincet met fijne punt</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td>voor verwijdering van dura</td></tr><tr><td>Glazen dekplekjes, 0,13-0,17 mm dik</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542A</td><td>voor schedelvensterdekking</td></tr><tr><td>Hoge snelheids microboor</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-17</td><td>met botpolijstschijf</td></tr><tr><td>Injectiespuit</td><td>Hamilton</td><td>2,5 ml</td><td>voor virale injectie</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>VEDCO</td><td>NDC-50989-996-06</td><td>100 mg/kg lichaamsgewicht</td></tr><tr><td>Agar-agar met laag smeltpunt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9793</td><td>beperkt bewegingsartefacten</td></tr><tr><td>Metalen frame</td><td>Op maat gemaakt</td><td>zie Fig 1</td><td>voor bevestiging van hersenen aan microscooptafel</td></tr><tr><td>MicroSyringe Pomp Controller</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3</td><td>Injectiesnelheid controller</td></tr><tr><td>Muis stereotaxisch apparaat</td><td>Stoelting</td><td>51725</td><td>voor het vasthouden van muizen</td></tr><tr><td>Perfusiekamer</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0284</td><td></td></tr><tr><td>Perfusie systeem</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>ALA-VM8</td><td></td></tr><tr><td>Zelfregulerend verwarmingskussen</td><td>Fine Science Tools</td><td>21061</td><td>om hypothermie van muizen te voorkomen</td></tr><tr><td>Sulforodamine 101</td><td>Invitrogen</td><td>S-359</td><td>rode fluorescerende kleurstof om astrocyten te labelen</td></tr><tr><td>Chirurgische schaar, 12 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-12</td><td>voor dissectie</td></tr><tr><td>Trefijnboor</td><td>Fine Science Tools</td><td>18004-23</td><td>voor het verwijderen van materiaal</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>VEDCO</td><td>NDC-50989-234-11</td><td>10 mg/kg lichaamsgewicht</td></tr></tbody></table>

beeldvorming mitochondriale ca2+ opname in astrocyten en neuronen met behulp van genetisch gecodeerde ca2+ indicatoren (geci's)

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators (GECIs)

Mitochondriaal Ca2+ speelt een cruciale rol bij het beheersen van cytosolische Ca2+ buffering, energiemetabolisme en cellulaire signaaltransductie. Overbelasting van mitochondriaal Ca2+ draagt bij aan verschillende pathologische aandoeningen, waaronder neurodegeneratie en apoptotische celdood bij neurologische aandoeningen. Hier presenteren we een celtype specifieke en mitochondria gerichte moleculaire benadering voor mitochondriale Ca2 + beeldvorming in astrocyten en neuronen in vitro en in vivo. We construeerden DNA-plasmiden die coderen voor mitochondria-targeting genetisch gecodeerde Ca2 + indicatoren (GECI's) GCaMP5G of GCaMP6s (GCaMP5G / 6s) met astrocyten- en neuron-specifieke promotors gfaABC1D en CaMKII en mitochondria-targeting sequence (mito-). Voor in vitro mitochondriale Ca2+ beeldvorming werden de plasmiden getransfecteerd in gekweekte astrocyten en neuronen om GCaMP5G/6s tot expressie te brengen. Voor in vivo mitochondriale Ca2+ beeldvorming werden adeno-geassocieerde virale vectoren (AAV's) voorbereid en geïnjecteerd in de muizenhersenen om GCaMP5G/6s in mitochondriën in astrocyten en neuronen tot expressie te brengen. Onze aanpak biedt een nuttig middel om mitochondriale Ca2 + -dynamiek in astrocyten en neuronen in beeld te brengen om de relatie tussen cytosolische en mitochondriale Ca2 + -signalering te bestuderen, evenals astrocyten-neuroninteracties.

Het doel van deze studie was om een methodologie te bieden om mitochondriale Ca2 + -signalen in beeld te brengen met behulp van GECI's in astrocyten en neuronen in vitro en in vivo. Resultaten van zowel in vitro als in vivo mitochondriale Ca2+ beeldvorming worden hier gepresenteerd.
In vitro mitochondriale Ca2+ signalering in gekweekte astrocyten en neuronen...

Dit proctocol heeft tot doel een methode te bieden voor in vitro en in vivo mitochondriale Ca2+ beeldvorming in astrocyten en neuronen.

Beeldvorming mitochondriale Ca2+ opname in astrocyten en neuronen met behulp van genetisch gecodeerde Ca2+ indicatoren (GECI's)

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of ...

De procedure wordt gedemonstreerd door afgestudeerde student Zhe Zhang, onderzoeksspecialist Nannan Zhang, professoren Illker Ozden en Shinghua Ding. Het algemene doel van deze procedure is het ontwikkelen van celtypespecifieke paar astrocyten en de neuronen en de mitochondriale targetingmethode voor in vitro en in vivo mitochondriale tellingen van beeldvorming met behulp van genetisch gecodeerde calciumindicator, GCaMP5G en 6s. Voor in vitro of in vivo beeldvorming zullen we DNA-plasmiden construeren die astrocyten- of neuronenspecifieke promotors gfaABC1D of CaMKII en genetisch gecodeerde calciumindicatoren, GCaMP5G / 6s bevatten met mitochondriale targetingsequenties.Voor in vitro mitochondriale calciumbeeldvorming transfecteerden we astrocytenneuronen gekweekt op glazen afdekslips met de bovengenoemde DNA-plasmiden met behulp van de Lipofectamine-methode. Beeldvorming kan één tot twee dagen na transfectie worden gestart door de glazen afdeksels over te brengen naar de injectiekamer onder een epifluorescentie- of tweefotonenmicroscoop. Hier zijn voorbeelden van fluorescerende signalen van mitochondriën en een astrocyt die GCaMP6s aan de linkerkant tot expressie brengt, en voor mitochondriën in een neuron, die GCaMP5G aan de rechterkant tot expressie brengen.Voor in vivo beeldvorming bereidden we serotype 5 geassocieerd adenovirus voor expressie van mito-GCaMP5G in astrocyten en serotype 9 geassocieerd adenovirus voor expressie van mito-GCaMP6s in neuronen. Voor stereotaxische virusinjectieoperaties hebben we de muis eerst verdoofd met 3%isofluraan. Later tijdens de operatie worden de isofluraanspiegels verlaagd tot 2% Nadat het juiste niveau van anesthesie is bereikt, wordt het haar over de hoofdhuid geschoren en wordt de muis op een stereotax-operatie-instrument geplaatst.Een oogheelkundige zalf wordt op de ogen aangebracht om ze tijdens de operatie te beschermen. De injectieoperaties worden uitgevoerd met behulp van aseptische procedures, waaronder steriele instrumenten en aseptische technieken. De chirurgische instrumenten worden gesteriliseerd door autoclaveren of door een hete kraalsterilisator.Nadat de muis op de stereotaks is gemonteerd, wordt de hoofdhuid drie keer gereinigd met betadine en 70% ethanol. Vervolgens wordt de huid opengesneden langs de Bregma Lambda-as en wordt de verticaal gemaakt door een snelle boor over de doellocatie. In dit werk richtten we ons op de motorische cortex of de paracortex.Een 33 gauge Hamilton-spuit met een bijbehorende adenovirusvector wordt door het gat in de hersenen ingebracht en vectoren worden geïnjecteerd in het doelgebied. Voor corticale toediening injecteren we de virusoplossing op twee diepten in meerdere stappen. Eerst steken we de naald een millimeter diep in de cortex.Na vijf minuten de hersenen te hebben gegeven om te herstellen, verplaatsen we de naald tot 700 micrometer diep, injecteren we 500 nanoliter virusoplossing. Nadat de injectie is voltooid, wachten we vijf minuten om het virus in de hersenen te laten diffunderen. En dan verplaatsen we de naald naar de tweede injectielocatie op 300 micrometer diep.Hier injecteren we nog eens 500 nano-liter virusoplossing. Nadat de injectie is voltooid, wachten we 10 minuten om het virus te laten diffunderen en dan verwijderen we de naald uit de hersenen en sluiten we het braamgat met botwas of Kwik-Sil. Ten slotte wordt de huid gehecht met Vetbond en wordt de muis teruggevonden op een verwarmingskussen voordat hij wordt teruggestuurd naar de dierenfaciliteit.De muis zal binnen minimaal drie weken klaar zijn voor gebruik voor in vivo beeldvorming, wat het tijdsbestek is waarin GCaMP-expressie rijpt. Craniale raamimplantatieoperaties worden ook gedaan met behulp van aseptische aandoeningen zoals beschreven voor injectieoperaties. De craniale raamchirurgische procedures zijn identiek aan de injectiechirurgische procedures tot het punt van blootstelling aan de schedel.Zodra de schedel is blootgesteld, worden kwarten van een craniotomie met een diameter van 2-3 mm over het virus geïnjecteerde gebied gemarkeerd met vier ondiepe gaten gemaakt door een boor met hoge snelheid die aan een manipulator is bevestigd. Vervolgens wordt het gedeelte van de schedel, bij de kloven van de craniotomie, verdund door het bot voorzichtig en langzaam in een cirkel rond te boren en deze vier gaten met elkaar te verbinden. Zodra de schedel aan de randen dun genoeg is, wordt het bot met een scherp pincet opgetild en verwijderd.De blootgestelde dura mater kan worden verwijderd of intact worden gehouden voor implantatie van het schedelvenster. Ons schedelraam bestaat uit een glazen afdekplaat van 3-5 millimeter in diameter, waardoor een siliconenschijf van ongeveer 300 micron dik in het midden ontstaat. De montage van het schedelraam wordt bereikt door het over de craniotomie te plaatsen.Een stuk tandenstoker bevestigd aan een manipulator wordt gebruikt om het schedelvenster zachtjes op het oppervlak van de hersenen te duwen. Vervolgens wordt de rand van het schedelraam afgedicht met een kleine hoeveelheid siliconenlijm Kwik-Sil. Ten slotte is het schedelvenster in de schedelranden bevestigd met tandacryl.Er moet voor worden gezorgd dat het tandacryl iets over de randen van het schedelvenster wordt aangebracht voor een sterke hechting. Zoals veel andere onderzoeksgroepen in het verleden hebben geïmplementeerd, kan een 1,2% agarose-gel worden gebruikt tussen het dekglas en de hersenen als alternatief voor de siliconenschijf. Nadat het schedelvenster veilig is geïnstalleerd, wordt een metalen plaat aan de schedel bevestigd.Deze kopplaat zal worden gebruikt voor het bevestigen van de kop van de muis op het podium van een microscoop met twee fotonen tijdens beeldvormingssessies. Mitochondriale calciumopname in astrocyten kan worden opgewekt door ATD-toepassing, terwijl mitochondriale calciumopname in neuronen kan worden opgewekt door glutamaatglycinetoepassing in kunstmatig hersenvocht, met zwaartekracht door een perfusiesysteem. Calciumopname in individuele mitochondriën in astrocyten en neuronen kan dan worden waargenomen.De volgende films tonen mitochondriale calciumopname in een astrocyte opgewekt door ATP aan de linkerkant en in een neuron opgewekt door glutamaat en glycine aan de rechterkant. De beeldvorming wordt gedaan door time-lapsed in vivo twee-fotonbeelden van mitochondriale fluorescerende signalen in astrocyten en neuronen te verzamelen met een Ultima twee-foton microscopiesysteem van Prairie Technologies, dat is uitgerust met een miljoen Ti Sapphire Ultra één laser van Coherent. We gebruiken de excitatiegolflengten van 880 tot 910 nanometer, die optimaal zijn voor in vivo beeldvorming met GCaMP5G en 6s.Astrocyten en neuron-specifieke expressie van mito-GCaMP5G en 6s en herbevestigd door co-lokalisatie van astrocyten-specifieke labeling van SR101 of neuron specifieke marker NeuN. Spontane mitochondriale calciumopname in astrocyten en neuronen in vivo kan worden waargenomen door time-lapse beeldvorming met behulp van twee-fotonenmicroscopie. Beelden tonen spontane calciumtoenames in individuele mitochondriën in een astrocyten aan de linkerkant en een neuron aan de rechterkant.Onze benaderingen zijn nuttig voor celtypespecifieke mitochondriale calciumbeeldvorming in vitro en in vivo. Na het bekijken van deze video, zou je een goed begrip moeten hebben van hoe je mitochondriale calciumopname in astrocyten en in neuronen in beeld kunt brengen.

imaging-mitochondrial-ca2-uptake-astrocytes-neurons-using-genetically

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Werkwijze voor subventriculaire zone (SVZ) cellen geladen met calcium indicator kleurstoffen voor opname calcium activiteit beschreven. De postnatale SVZ bevat dicht opeengepakte cellen met inbegrip van neurale progenitor cellen en neuroblasten. Plaats van bad loading injecteerden we de kleurstof door druk in het weefsel voor een beter kleurstofdiffusieoverdracht.

Voorbereiding van Acute subventriculaire zone Schijfjes voor Calcium Imaging

In dit protocol, updaten we de recente vooruitgang in de beeldvorming...

Imaging Calcium Reacties in GFP-gelabelde neuronen van de hypothalamus Mouse Brain Slices

This video describes a confocal microscopy imaging-based assay to measure mitochondrial calcium uptake in cultured cells. The assay uses the calcium-sensitive fluorescent dye Rhod-2/AM to measure the mitochondrial calcium in permeabilized cultured cells.

Calcium Influx Assay to Measure Mitochondrial Calcium Uptake in Cultured Cells

Hier beschrijven we een aanpassing van de protocollen voor homeostatische plasticiteit induceren in neuronen voor de studie van plasticiteit van astrocytaire G-proteïne gekoppelde receptoren. Onlangs gebruikt om wijzigingen in astrocytaire I mGluRs bij jonge muizen te onderzoeken, kan de werkwijze worden toegepast voor de schaal van verschillende astrocytaire GPCRs meten in weefsel van volwassen muizen in situ en in vivo, en een betere waardering van de gevoeligheid van astrocytaire receptoren...

Inducerende Plasticiteit van astrocyten receptoren door Manipulatie van neuronale tarieven

De eigenschappen en functies van astrocytenintracellulaire Ca2+ signalen in het striatum blijven onvolledig onderzocht. We beschrijven methoden om genetisch gecodeerde calciumindicatoren in striatale astrocyten tot expressie te brengen met behulp van adeno-geassocieerde virussen van serotype 2/5 (AAV2/5), evenals procedures om Ca2+ signalen binnen striatale astrocyten in situ betrouwbaar te beeldhouwen.

Imaging intracellulaire Ca 2+ Signalen in Striatale Astrocyten van volwassen muizen met behulp van genetisch gecodeerd Calcium Indicatoren

Hier presenteren we twee protocollen voor het meten van mitochondriale Ca2 + toestroom in geïsoleerde mitochondriën en gekweekte cellen. Voor geïsoleerde mitochondriën, detailleren wij een plaat lezer gebaseerde Ca2 + import assay met behulp van de Ca2 + gevoelige kleurstof calcium groen-5N. Voor gekweekte cellen beschrijven we een methode van de confocal microscopie met behulp van de Ca2 + kleurstof Rhod-2/AM.

Analyses van mitochondriale Calcium toestroom in geïsoleerde Mitochondria en gekweekte cellen

Genetisch gecodeerde Ca2 + indicatoren (GECIs) hebben radicaal veranderd hoe in situ Ca2 + imaging wordt uitgevoerd. Maximaliseren van de terugwinning van de gegevens uit deze opnamen, is juiste analyse van Ca2 + signalen vereist. De protocollen in deze paper vergemakkelijken de kwantificering van Ca2 + signalen opgenomen in situ met behulp van Spatio mapping en deeltje gebaseerde analyse.

Toepassingen van de Spatio-temporele Mapping en analysetechnieken deeltje te kwantificeren intracellulaire Ca2 + signalering In Situ

Dit artikel beschrijft een protocol om verschillen in basale redoxtoestand en redoxresponsen op acute verstoringen in primaire hippocampus- en corticale neuronen te bepalen met behulp van confocale levende microscopie. Het protocol kan met minimale aanpassingen worden toegepast op andere celtypen en microscopen.

Live imaging van de mitochondriale glutathion redoxtoestand in primaire neuronen met behulp van een ratiometrische indicator

De huidige methoden beschrijven een niet-ratiometrische benadering voor hoge resolutie, sub-compartimentale calciumbeeldvorming in vivo in Caenorhabditis elegans met behulp van direct beschikbare genetisch gecodeerde calciumindicatoren.

Subcellulaire beeldvorming van neuronale calciumbehandeling in vivo

Dit protocol beschrijft in vivo GCaMP-calciumbeeldvorming van intacte trigeminusganglion (TG)-neuronen. Deze beschrijving omvat TG-blootstellingschirurgie, in vivo confocale microscopiebeeldvorming van TG-neuronen, toepassing van somatische stimuli tijdens microscopische beeldvorming van TG-neuronen en analyse van in vivo GCaMP-calciumbeeldvormingsgegevens.

In vivo Calciumbeeldvorming van neuronale ensembles in netwerken van primaire sensorische neuronen in intacte trigeminusganglia

Dit protocol biedt een uitgebreide beschrijving van een methode voor het gelijktijdig registreren van calciumsignalen van neuronen en astrocyten over meerdere geheugengerelateerde hersengebieden en demonstreert de toepassing ervan tijdens een leer- en geheugengedragsparadigma.

Een tweekleurige vezelfotometriemethode voor het registreren van activiteit van astrocytenneuronen over meerdere hersengebieden tijdens leer- en geheugengedrag

Leer mitochondriale calciumbeeldvorming in astrocyten en neuronen met behulp van genetisch gecodeerde calciumindicatoren GCaMP5G en GCaMP6s. Deze methode maakt celtype-specifieke in vitro en in vivo analyse van mitochondriale calciumdynamica mogelijk.

Beeldvorming mitochondriale Ca²⁺ opname in astrocyten en neuronen met behulp van genetisch gecodeerde Ca²⁺ indicatoren (GECI's)

Meer video's verkennen