Geprimed mycobacteriële uveïtis (PMU) als model voor post-infectieuze uveïtis

Dit protocol schetst de stappen om betrouwbare en robuuste oogontsteking te induceren met behulp van hittedode mycobacteriën in het muismodel. Dit geprimeerde mycobacteriële uveïtismodel kan helpen bij het bestuderen van de mechanismen van chronische immuungemedieerde oculaire ontsteking die zich ontwikkelt na een mycobacteriële infectie. Dit model van chronische uveïtis vereist geen gebruik van specifieke muizenstammen of immunisatie met oculaire antigenen.

Dit model vergemakkelijkt het gebruik van transgene en gen knock-out muislijnen in mechanistische studies van de pathogenese van oculaire ontsteking. Dit PMU-model zal nuttig zijn bij studies die nieuwe therapieën testen voor oogontsteking of uveïtis bij mensen. Behandelingen zoals nieuwe oogdruppels of systemisch toegediende immuunmodulerende middelen kunnen met dit model op werkzaamheid worden getest.

Dit model zal het bestuderen vergemakkelijken hoe hitte-gedode mycobacteriële antigenen de micro-omgeving van een immuungeprivilegieerd orgaan zoals het oog veranderen. Deze resultaten kunnen ook inzicht geven in hoe andere soorten ooginfecties het oog beïnvloeden of hoe immuungeprivilegieerde sites, zoals de hersenen, reageren op microbacteriële antigenen. Om te beginnen, ontklemt u het lichaam van de Sonicator-convertereenheid en reinigt u de sonde met een alcoholdoekje van 70%.

Schakel vervolgens de Sonicator in en stel de stroominstelling in op vier door aan de aan / uit-knop te draaien. Om vervolgens een fijne suspensie van de microbacterie tuberculosis H37Ra in PBS te genereren, dompelt u de punt van de sonde onder in het PBS-bevattende microbacteriële poeder. Soniceer het mengsel gedurende 30 seconden op ijs, pauzeer vervolgens gedurende 30 seconden en herhaal dit in totaal vijf minuten om het poeder volledig in een gelijkmatige suspensie te verspreiden zonder de vloeistof te verwarmen.

Voeg vervolgens 2,5 milliliter onvolledig adjuvans van Freund toe aan het mengsel en herhaal het ultrasoonapparaatproces op ijs totdat de emulsie een tandpasta-achtige consistentie vormt. Laad voor de subcutane injectie 200 tot 300 microliter van de microbacteriële emulsie in een spuit van één milliliter. Verwijder de lucht uit de spuit en blijf de spuit vullen met intermitterend omkeren en tikken totdat deze gevuld is.

Plaats vervolgens de subcutane injecties op het dorsale oppervlak van de heupen of op het ventrale oppervlak van de benen proximaal aan het gebied van de inguinale lymfeklieren van een 6 tot 10 weken oude verdoofde C57 zwarte 6J-muis. Steek de naald voorzichtig in, zorg ervoor dat u de spier niet binnendringt en injecteer 50 microliter van de emulsie in de onderhuidse ruimte. Verwijder de naald niet onmiddellijk om de dikke emulsie volledig te kunnen injecteren.

Om de antigeenvoorraad voor te bereiden op de intravitreale injectie, soniceert u de H37Ra in PBS-oplossing zoals eerder gedemonstreerd, aliquot u de oplossing in volumes van 100 microliter en bewaart u deze bij 20 graden Celsius. Op de dag van de injectie, na bevestiging van de diepte van de algemene anesthesie, anesthetie het hoornvlies met één druppel van 0,5% tetracaïne en verwijd de pupil met één druppel van 2,5% fenylefrine. Voeg na het afdeppen van overtollige vloeistof een druppel van 5% Betadine toe aan het oogoppervlak en het omliggende haar om het risico op endoftalmitis te verminderen.

Verwijder na twee tot drie minuten de Betadine en bedek het oog met 0,3% hypromellose gel om uitdroging onder anesthesie en cataractvorming te voorkomen. Laad vervolgens een spuit van 10 microliter met het antigeen- en fluoresceïnemengsel, plaats de muis vervolgens in een buikligging op het platform en gebruik de rechter- en linkeroorbalken om de muiskop te bevestigen. Plaats en oriënteer de muis onder de scoop zodat het superieure nasale aspect van het rechteroog zichtbaar is.

Verplaats vervolgens met een naald van 30 gauge de wimpers, stel de sclera bloot en visualiseer de limbus en het radiale bloedvat. Maak vervolgens met behulp van een steriele naald van 30 gauge een geleidingsgat in de sclera één tot twee millimeter achter de limbus. Steek vervolgens de naald van 34 gauge die aan de injectiehouder is bevestigd in het oog, door het geleidingsgat, in een hoek die de lens vermijdt, maar plaats de naaldpunt in de glasvochtholte.

Injecteer met behulp van een microspuitpompregelaar voorzichtig één microliter van het M.tuberculosis-extract in de glasvochtholte. In geval van consistente reflux, verhoog het injectievolume tot 1,5 microliter om een adequate dosisafgifte te garanderen. Bevestig de intravitreale plaatsing door een groenachtige reflex in het oog te visualiseren en verwijder na 10 seconden de naald uit het oog.

Na het verdoven van de muis, verwijdt u de pupil met één druppel 2,5% fenylefrine, waardoor overtollige druppels in de neus of mond worden vermeden. Dep na twee tot drie minuten de overtollige vloeistof af en bedek het oog met 0,3% hypromellose gel. Wikkel vervolgens de muis in een laag chirurgisch gaas om de lichaamswarmte te behouden, plaats de muis vervolgens op de dierencassette en plaats het hoofd met de bijtbalk.

Als u de optische coherentietomografie of OCT-beelden wilt verkrijgen, schakelt u het OCT-beeldvormingssysteem in en opent u de beeldbewerkingssoftware. Breng voor beeldvorming van de achterste kamer de OCT dicht bij het oogoppervlak en zorg ervoor dat het oppervlak van de lens niet in contact komt met het oog. Zodra het oog correct is gepositioneerd, stopt u de snelle scan, selecteert u het volumescanprotocol en activeert u de scan met de optie Doel.

Voor afbeeldingen van het posterieure segment past u zich aan totdat de oogzenuw is gecentreerd in de horizontale B-scanuitlijningsafbeelding en het netvlies is uitgelijnd met de verticale uitlijningsas. Voor afbeeldingen van het voorste segment past u de positie aan om de top van het hoornvlies te centreren in zowel de horizontale B-scanuitlijningsafbeelding als de verticale B-scanuitlijningsafbeelding. Klik ten slotte op Snapshot om de volumescanafbeelding vast te leggen en klik vervolgens op opslaan.

24 uur na intravitreale injectie worden ontstekingscellen gezien in het waterige en glasvocht. Cornea-oedeem, een hypopyon en meerdere vrij zwevende ontstekingscellen worden gezien in de voorste kamer en vitritis in de achterste kamer. De mate van oogontsteking kan op deze OCT-beelden worden gescoord.

Gecombineerde scores groter dan nul maar minder dan 2,5 vertegenwoordigen milde ontsteking. Scores groter dan 2,5, maar minder dan 4,5. vertegenwoordigen matige ontsteking en scores groter dan 4,5 identificeren ernstige ontsteking.

Ontstekingsscores kunnen ook worden bepaald met behulp van vijf kenmerken die zichtbaar zijn in hematoxyline- en eosinekleuringssecties. De ernstscore wordt bepaald door het aantal ontstekingscellen in het waterige en glasvocht te tellen. Brightfield longitudinale fundus beeldvorming kan ook retinale en perivasculaire ontsteking identificeren.

Ernstig ontstoken ogen vertonen meerdere witte infiltraten in het netvlies en vasculaire tortuositeit op kleuren fundus beeldvorming, evenals dichte vitritis en retinaal oedeem op OCT op dag twee. Licht ontstoken ogen vertonen minder en meer discrete lineaire laesies in de fundus en een aantal infiltrerende cellen in de glasvochtruimte. Het waarborgen van consistentie tijdens de subcutane en intravitreale injecties en het nemen van passende maatregelen om de ontwikkeling van infectieuze endoftalmitis te voorkomen, zijn de belangrijkste stappen die helpen bij het succesvol repliceren van dit model.

In vivo bioluminescentie beeldvorming kan worden gebruikt om ontstekingen te karakteriseren, terwijl post-mortem assays, zoals multi-parameter, flow cytometrische analyse kunnen worden uitgevoerd om infiltrerende immuunceltype populaties te identificeren en te kwantificeren. Cytokine-analyse, mRNA-sequencing en immunofluorescentiebeeldvorming kunnen worden gebruikt om gen- en eiwitexpressiepatronen te beoordelen of retinale immuuncelpopulaties bij uveïtis te identificeren. Dit protocol laat zien hoe reproduceerbare, aseptische en minimaal traumatische injecties kunnen worden uitgevoerd die toekomstige onderzoekers zullen helpen toegang te krijgen tot de intravitreale ruimte bij muizen.

OCT zal ook een belangrijke rol spelen bij het opsporen van oogontstekingen die anders gemist zouden kunnen worden door een visueel onderzoek van de ogen van kleine proefdieren.