Reconstitutie van Msp1-extractieactiviteit met volledig gezuiverde componenten
10 augustus 2021
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor reconstitutie van Msp1-extractieactiviteit met volledig gezuiverde componenten in gedefinieerde proteoliposomen.
Het gebruik van AAA-ATPases om eiwitten uit een lipide bilayer te verwijderen is een veel voorkomend thema in de kwaliteitscontrole van eiwitten. Een mechanistisch begrip van dit essentiële proces vereist een gereconstitueerd systeem. Eerdere reconstitutie met AAA-ATPasen was complex en heterogeen.
Ons systeem is eenvoudig en volledig gedefinieerd. Dit stelt ons in staat om de AAA-ATPase Msp1, het substraat en de lipideomgeving te manipuleren. Voeg om te beginnen eerder bereide reconstitutiebuffer, gezuiverde Msp1- en TA-eiwitten en liposomen toe aan een PCR-buis en incubeer het mengsel vervolgens gedurende 10 minuten op ijs.
Snijd tijdens de incubatie de punt van een P200-pipetpunt tot ongeveer 1/8 inch in diameter. Draai vervolgens de buis met BioBeads grondig om een uniform mengsel te verkrijgen. Verwijder vervolgens snel het deksel en gebruik de gesneden P200-pipetpunt om een geschikt volume van de kralen over te brengen naar een lege PCR-buis.
Zodra de incubatie van 10 minuten voor reconstitutie is voltooid, verwijdert u met behulp van een ongesneden pipetpunt alle vloeistof uit de BioBeads. Breng vervolgens 100 microliter van de reconstitutie over in de buis met de BioBeads en laat deze gedurende 16 uur op een wiel draaien. Draai de volgende dag de buis in een PicoFuge om de kralen te pelleteren, breng vervolgens het gereconstitueerde materiaal over naar een schone PCR-buis en houd de buis op ijs.
Voor het verwijderen van eiwitten die niet in de liposomen zijn gereconstitueerd, moet u de glutathion-spinkolommen in evenwicht brengen met extractiebuffer, wat meestal drie wasrondes met 400 microliter buffer omvat, gevolgd door centrifugatie om de buffer te verwijderen. Voeg vervolgens vijf micromol van elke chaperonne toe aan het gereconstitueerde materiaal, gevolgd door 100 microliter extractiebuffer, waardoor het volume op 200 microliter komt. Voeg dit mengsel toe aan de gebalanceerde glutathion spinkolommen, sluit vervolgens de spinkolommen aan en draai ze gedurende 30 minuten, zodat de chaperonnes zich aan de hars kunnen binden.
Draai na het draaien de kolommen kort. Verzamel de doorstroming, het voorgeklaarde materiaal dat is uitgeput van geaggregeerde eiwitten. Leg het op ijs en ga direct verder met de extractietest.
Bereid buizen voor op SDS-PAGE-analyse. Voeg 45 microliter dubbel gedestilleerd water toe aan de ingangsbuis, 40 microliter water aan de doorstroombuis en 16,6 microliter 4x SDS-PAGE-laadbuffer aan elke buis. Bereid voor de extractietest de extractiereactie voor en breng het uiteindelijke volume met de extractiebuffer op 200 microliter.
Verwarm vervolgens de extractietest gedurende twee minuten in een warmteblok van 30 graden Celsius. Om de test te starten, voegt u ATP toe aan een eindconcentratie van twee millimol. Draai de buis vijf seconden in een PicoFuge en incubeer hem gedurende 30 minuten bij 30 graden Celsius.
Neem tijdens de incubatie een monster van vijf microliter van de reactie en voeg dit toe aan de ingangsbuis. Breng ook één glutathion-spinkolom in evenwicht voor elk monster in de extractietest zoals eerder aangetoond. Zodra de incubatie van 30 minuten is voltooid, voegt u 200 microliter extractiebuffer toe aan de buis, waardoor het totale volume op 400 microliter komt.
Voeg vervolgens deze reactie toe aan de gebalanceerde glutathionhars en laat deze 30 minuten draaien bij vier graden Celsius. Draai na het draaien de kolommen om de doorstroom te verzamelen en neem vervolgens een monster van 10 microliter voor de doorstroombuis. Was de hars tweemaal met 400 microliter extractiebuffer en gooi de doorstroming na elke wasbeurt weg.
Houd na de derde wasbeurt de doorstroming en neem een monster van 50 microliter voor de wasbuis. Bereid vervolgens vijf milliliter elutiebuffer door gereduceerd glutathion toe te voegen aan een eindconcentratie van vijf millimol in de extractiebuffer. Voeg 200 microliter van de elutiebuffer toe aan de spinkolom en incubeer gedurende vijf minuten.
Centrifugeer vervolgens de kolom en verzamel de doorstroming. Herhaal de elutiestap nogmaals. Neem na de tweede elutie een aliquot van 50 microliter uit het elutiemonster en voeg dit toe aan de eluutbuis.
Na het uitvoeren van een western blot kan de extractie-efficiëntie worden bepaald door de hoeveelheid substraat in de elutefractie te vergelijken met de inputfractie. Het signaal in de doorstroming vertoont enige variabiliteit, maar is over het algemeen vergelijkbaar met de ingangsfractie en er is geen signaal in de wasfractie. Doorgaans is er een extractie-efficiëntie van ongeveer 10% voor de positieve regeling en een extractie-efficiëntie van één tot 2% voor de negatieve regeling.
Wanneer de reconstitutieomstandigheden niet zijn geoptimaliseerd, zijn de extractieniveaus vergelijkbaar tussen de positieve en negatieve monsters. Met deze techniek kon ons lab biofysische eigenschappen van de substraateffectherkenning door Msp1 testen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor de reconstitutie van de extractieactiviteit van Msp1 met gebruik van volledig gezuiverde componenten in gedefinieerde proteoliposomen. De studie heeft tot doel het reconstitutieproces van AAA-ATPases te vereenvoudigen, welke cruciaal zijn voor de kwaliteitscontrole van eiwitten.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Biochemie
- Celbiologie
Achtergrond
- AAA-ATPases spelen een essentiële rol bij het verwijderen van eiwitten uit lipidendubbellaagen.
- Een mechanistisch begrip van dit proces vereist een gereconstitueerd systeem.
- Eerdere methoden waren complex en heterogeen.
- Deze studie presenteert een eenvoudig en volledig gedefinieerd reconstitutiesysteem.
Doel van de studie
- Om het AAA-ATPase Msp1 en het substraat ervan te manipuleren.
- Om een gedefinieerde lipidenomgeving voor de studie te creëren.
- Om het begrip van eiwitextractiemechanismen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Bereiding van de reconstitutiebuffer.
- Gebruik van gezuiverde Msp1- en TA-eiwitten.
- Toevoeging van liposomen in een PCR-buisje.
- Incubatie van het mengsel op ijs gedurende 10 minuten.
Belangrijkste resultaten
- Er is een eenvoudig en effectief protocol voor de reconstitutie van Msp1 vastgesteld.
- Het gedefinieerde systeem maakt een betere manipulatie van componenten mogelijk.
- Er is een verbeterd begrip van het extractieproces bereikt.
- De resultaten duiden op een verbeterde efficiëntie in de kwaliteitscontrole van eiwitten.
Conclusies
- De studie biedt een eenvoudige methode voor het bestuderen van AAA-ATPases.
- Het draagt bij aan het begrip van eiwitextractie uit membranen.
- Dit protocol kan worden toegepast in verder onderzoek naar eiwitkwaliteitscontrole.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Dit protocol maakt mechanische risicoanalyse mogelijk van AAA-ATPase-gemedieerde proteinextractie, een geconserveerde kwaliteitscontrole-route die relevant is voor mitochondriale proteostase. Door een volledig gedefinieerd, gereconstitueerd systeem met gezuiverde componenten te bieden, ondersteunt het de validatie van targets en de ontwikkeling van assays voor ziekten die gekoppeld zijn aan mitochondriale dysfunctie, waaronder neurodegeneratie en kanker. De aanpak vergroot het voorspellend vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door variabelen te isoleren die de substraatherkenning en extractie-efficiëntie beïnvloeden.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar de rol van Msp1 bij het verwijderen van misgelokaliseerde tail-anchored proteïnen, wat bijdraagt aan de functionele targetvalidatie in mitochondriale proteostase-paden.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van gezuiverd Msp1, TA-proteïnen en liposomen om cellulaire complexiteit te elimineren, waardoor nauwkeurige manipulatie van de ATPase, het substraat en de lipidenomgeving mogelijk is.
- Voorspellende waarde: Faciliteert structuur-functieanalyse van substraatherkenning door Msp1, wat helpt bij de identificatie van leadverbindingen voor modulatoren van de proteïnextractie-activiteit.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Stelt een kwantitatieve extractie-assay vast waarbij de efficiëntie wordt gemeten door de substraatniveaus in het eluaat te vergelijken met die van het input via Western blot.
- Operationele waarde: Definieert gestandaardiseerde condities: 10 minuten incubatie op ijs voor reconstitutie, 16 uur rotatie met BioBeads en 30 minuten ATP-gestuurde extractie bij 30°C gevolgd door glutathione-eluatie.
- Assay-gereedheid: De resultaten omvatten de extractie-efficiëntie (typisch ~10% voor de positieve controle, 1–2% voor de negatieve), wat hit-detectie en dosis-responsscreening in een gereconstitueerd formaat mogelijk maakt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele relevantie: Verbindt mechanismen van mitochondriale proteostase met ziekte-modellen waarin Msp1-dysfunctie een rol speelt bij kanker, veroudering en neurodegeneratie.
- Mechanistische risicoreductie: Isoleert variabelen die de extractie beïnvloeden—zoals lipidensamenstelling en substraatbiofysica—om de target-interactie te verduidelijken en ambiguïteit bij preklinische target-validatie te verminderen.
- Continuïteit: Ondersteunt de overgang van biochemische target-validatie naar fenotypische screening in ziekterelateerde systemen door het definiëren van een minimale, controleerbare extractiemodule.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode past binnen het vroege stadium van het ontdekkingscontinuüm en maakt targetvalidatie mogelijk door mechanistische dissectie van proteïne-extractie, wat de assay-ontwikkeling voor screeningscascades informeert en go/no-go-beslissingen ondersteunt op basis van target-engagement en pathway-modulatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-testen over hoe de lipidomgeving en kenmerken van het substraat de Msp1 ATPase-activiteit en extractie-efficiëntie beïnvloeden.
- Screening: Biedt een gereconstitueerd, kwantitatief platform voor het evalueren van effecten van verbindingen op ATPase-gestuurde extractie, met gedefinieerde positieve en negatieve controles.
- Analytics: Genereert meetbare resultaten — extractie-efficiëntie via Western blot-vergelijking van eluaat- en input-fracties — wat statistische vergelijking tussen condities mogelijk maakt.
- Translationeel onderzoek: Legt een verband met preklinische relevantie door het modelleren van een geconserveerde kwaliteitscontrole-route waarvan verstoring gekoppeld is aan menselijke ziekten.
- Bedrijfmatige hergebruik: Het gedefinieerde liposoom-gereconstitueerde systeem maakt hergebruik mogelijk in projecten die AAA-ATPases, substraatspecificiteit of lipid-afhankelijke modulatie van extractie bestuderen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen door mechanistische ambiguïteit in eiwitextractiepaden te verminderen via een vereenvoudigd, gedefinieerd systeem.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie via gezuiverde componenten en een stapsgewijs protocol (reconstitutie, BioBead-behandeling, pre-clearing van chaperonnen, ATP-gestuurde extractie, glutathione-elutie).
- Strategische waarde: Verbetert de besluitvorming over het voortzetten of stopzetten van projecten door een vroege beoordeling van het potentieel voor targetmodulatie mogelijk te maken vóór cellulaire of fenotypische assays.
- Impact op de portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van targets in mitochondriale kwaliteitscontrole door mechanische aansprakelijkheid en de hanteerbaarheid van targets te verduidelijken.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in eiwitzuivering, liposoomreconstitutie en het ontwerp van ATPase-assays.
- Afhankelijk van toegang tot ultracentrifugatie of een PicoFuge voor pelletvorming, glutathione-spinzuilen en temperatuurgecontroleerde warmteblokken.
- Vereist standaardisatie van de lipidensamenstelling, eiwit:polilipide-verhoudingen en ATP-concentratie tussen laboratoria voor een reproduceerbare extractie-efficiëntie.
- Aanpassing aan andere TA-eiwitten of AAA-ATPases kan optimalisatie vereisen van de reconstitutiebuffer, de incubatietijd en de bead-gebaseerde lipiden-delipidatiestappen.
- Praktische beperkingen omvatten variabiliteit in het flow-through signaal en afhankelijkheid van de gevoeligheid van Western blots voor substraten met een lage abundantie, zoals vermeld in de bron.
