Name: Volledig optische mechanobiologie ondervraging van ja-geassocieerd eiwit in menselijke kanker en normale cellen met behulp van een multifunctioneel systeem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Leer hoe u een multifunctioneel systeem gebruikt voor optische mechanobiologie-onderzoek van YAP-eiwit in menselijke kanker- en normale cellen. Deze methode combineert automatische beeldvorming met mechanobiologische analyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit project wordt financieel ondersteund door de Cancer Pilot Award van UF Health Cancer Center (X. T. en D. S.) en het Gatorade Award Start-up Package (X. T.). De auteurs waarderen oprecht de intellectuele discussies met en de technische ondersteuning van Dr. Jonathan Licht (UFHCC), Dr. Rolf Renne (UFHCC), Dr. Ji-Hyun Lee (Biostatistiek, UF), Dr. Hugh Fan (MAE, UF), Dr. Warren Dixon (MAE, UF), Dr. Ghatu Subhash (MAE, UF), Dr. Mark Sheplak (MAE & ECE, UF), Dr. Malisa Sarntinoranont (MAE, UF), Dr. Scott Banks (MAE, MAE, UF), Dr. Matthew Traum (MAE, UF), Dr. David Hahn (Universiteit van Arizona), Dr. Weihong Wang (Oracle Corporation), Dr. Youhua Tan (Hong Kong Polytechnic University) en het ondersteuningsteam van Nikon (Drs. Jose Serrano-Velez, Larry Kordon en Jon Ekman). De auteurs zijn zeer dankbaar voor de genereuze en effectieve steun van alle leden van Tang's, Siemann's en Guan's onderzoekslaboratoria en alle medewerkers van de MAE & ECE & Physics & Radiation Oncology Departments, UF.

<ol><li>Werley, C., Boccardo, S., Rigamonti, A., Hansson, E., Cohen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+optical+sensors+in+arrayed+islands+of+cells+for+multimodal+recordings+of+cellular+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Multiplexed optical sensors in arrayed islands of cells for multimodal recordings of cellular physiology.</a> Nature Communications. 11 (1), 3881(2020).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epi-illumination+SPIM+for+volumetric+imaging+with+high+spatial-temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Epi-illumination SPIM for volumetric imaging with high spatial-temporal resolution.</a> Nature Methods. 16 (6), 501-504 (2019).</li>
<li>Saraswathibhatla, A., Galles, E. E., Notbohm, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+force+and+motion+in+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal force and motion in collective cell migration.</a> Scientific Data. 7 (1), 197(2020).</li>
<li>Saraswathibhatla, A., Henkes, S., Galles, E. E., Sknepnek, R., Notbohm, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+tractions+control+the+size+of+a+collectively+moving+pack+in+a+cell+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Extreme+Mechanics+Letters%22%5BJournal%5D)">Coordinated tractions control the size of a collectively moving pack in a cell monolayer.</a> Extreme Mechanics Letters. 48, 101438(2021).</li>
<li>Wang, W., Kim, C. K., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+tools+for+imaging+and+recording+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular tools for imaging and recording neuronal activity.</a> Nature Chemical Biology. 15 (2), 101-110 (2019).</li>
<li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+imaging+software+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Biological imaging software tools.</a> Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).</li>
<li>Carpenter, A. E., Kamentsky, L., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+call+for+bioimaging+software+usability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A call for bioimaging software usability.</a> Nature Methods. 9 (7), 666-670 (2012).</li>
<li>Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+long-term+imaging+and+quantification+of+single-cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics.</a> Nature Biotechnology. 34 (11), 1137-1144 (2016).</li>
<li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li>
<li>Luo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+multi-functional+integration+program+%28AMFIP%29+towards+all-optical+mechanobiology+interrogation%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Automatic multi-functional integration program (AMFIP) towards all-optical mechanobiology interrogation.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+control+of+microscopes+using+manager%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer control of microscopes using manager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 92 (1), 14-20 (2010).</li>
<li>Tulpule, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinase-mediated+RAS+signaling+via+membraneless+cytoplasmic+protein+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Kinase-mediated RAS signaling via membraneless cytoplasmic protein granules.</a> Cell. 184 (10), 2649-2664 (2021).</li>
<li>Tang, X., Tofangchi, A., Anand, S. V., Saif, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cell+traction+force+microscopy+to+study+multi-cellular+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel cell traction force microscopy to study multi-cellular system.</a> PLOS Computational Biology. 10 (6), 1003631(2014).</li>
<li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+force+affects+expression+of+an+in+vitro+metastasis-like+phenotype+in+HCT-8+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells.</a> Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).</li>
<li>Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stiffness+of+living+tissues+and+its+implications+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering.</a> Nature Reviews Materials. 5, 351-370 (2020).</li>
<li>Phelps, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maleimide+cross-linked+bioactive+PEG+hydrogel+exhibits+improved+reaction+kinetics+and+cross-linking+for+cell+encapsulation+and+in+situ+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Maleimide cross-linked bioactive PEG hydrogel exhibits improved reaction kinetics and cross-linking for cell encapsulation and in situ delivery.</a> Advanced Materials. 24 (1), 64-70 (2012).</li>
<li>Bajaj, P., Tang, X., Saif, T. A., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiffness+of+the+substrate+influences+the+phenotype+of+embryonic+chicken+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Stiffness of the substrate influences the phenotype of embryonic chicken cardiac myocytes.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 95 (4), 1261-1269 (2010).</li>
<li>Temples, M. N., Adjei, I. M., Nimocks, P. M., Djeu, J., Sharma, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+three-dimensional+tumor+models+to+study+natural+killer+cell+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Engineered three-dimensional tumor models to study natural killer cell suppression.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (7), 4179-4199 (2020).</li>
<li>Feng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+split+fluorescent+proteins+for+endogenous+protein+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Improved split fluorescent proteins for endogenous protein labeling.</a> Nature Communications. 8, 370(2017).</li>
<li>Guan, J., Liu, H., Shi, X., Feng, S., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+multiple+genomic+elements+using+correlative+CRISPR+imaging+and+sequential+DNA+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Tracking multiple genomic elements using correlative CRISPR imaging and sequential DNA FISH.</a> Biophysical Journal. 112 (6), 1077-1084 (2017).</li>
<li>Micro-Manager. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://micro-manager.org/wiki/NikonTi2">https://micro-manager.org/wiki/NikonTi2</a> (2021).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Martiel, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cell+traction+forces+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Measurement of cell traction forces with ImageJ.</a> Methods in Cell Biology. 125, 269-287 (2015).</li>
<li>Okumurai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+generalization+of+Cerruti%27s+problem+in+an+elastic+half-space%5BTitle%5D)+AND+%22Doboku+Gakkai+Ronbunshu%22%5BJournal%5D)">On the generalization of Cerruti's problem in an elastic half-space.</a> Doboku Gakkai Ronbunshu. 1995, 1-10 (1995).</li>
<li>Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+YAP%2FTAZ%3A+hippo+signaling+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).</li>
<li>Hong, W. W., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+YAP+and+TAZ+transcription+co-activators%3A+Key+downstream+effectors+of+the+mammalian+Hippo+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The YAP and TAZ transcription co-activators: Key downstream effectors of the mammalian Hippo pathway.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 23 (7), 785-793 (2012).</li>
<li>Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP%2FTAZ+at+the+roots+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">YAP/TAZ at the roots of cancer.</a> Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+yes-associated+protein+contributes+to+progression+and+poor+prognosis+of+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Overexpression of yes-associated protein contributes to progression and poor prognosis of non-small-cell lung cancer.</a> Cancer Science. 101 (5), 1279-1285 (2010).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+YAP+suppresses+CML+cell+proliferation+and+enhances+efficacy+of+imatinib+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+%26+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Inhibition of YAP suppresses CML cell proliferation and enhances efficacy of imatinib in vitro and in vivo.</a> Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 35 (1), 134(2016).</li>
<li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanically-induced+colon+cancer+cell+population+shows+increased+metastatic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">A mechanically-induced colon cancer cell population shows increased metastatic potential.</a> Molecular Cancer. 13, 131(2014).</li>
<li>Panciera, T., Azzolin, L., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+of+YAP+and+TAZ+in+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology of YAP and TAZ in physiology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 758-770 (2017).</li>
<li>Yuan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yes-associated+protein+%28YAP%29+functions+as+a+tumor+suppressor+in+breast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Yes-associated protein (YAP) functions as a tumor suppressor in breast.</a> Cell Death and Differentiation. 15 (11), 1752-1759 (2008).</li>
<li>Koushki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamin+A+redistribution+mediated+by+nuclear+deformation+determines+dynamic+localization+of+YAP%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Lamin A redistribution mediated by nuclear deformation determines dynamic localization of YAP.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Chang, S. S., Rape, A. D., Wong, S. A., Guo, W. H., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+regulates+cellular+mechanical+states%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Migration regulates cellular mechanical states.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (26), 3104-3111 (2019).</li>
<li>Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+guidance+of+integrin+mediated+traction+stress+during+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 69, 174-183 (2015).</li>
<li>Lee, J., Abdeen, A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+directed+adipogenesis+and+neurogenesis+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+adipose+tissue+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Matrix directed adipogenesis and neurogenesis of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow.</a> Acta Biomaterialia. 42, 46-55 (2016).</li>
<li>Tang, X., Bajaj, P., Bashir, R., Saif, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+far+cardiac+cells+can+see+each+other+mechanically%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">How far cardiac cells can see each other mechanically.</a> Soft Matter. 7 (13), 6151-6158 (2011).</li>
<li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li>
<li>Rape, A., Guo, W. H., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+traction+force+in+relation+to+cell+shape+and+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions.</a> Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2011).</li>
<li>Shiu, J. Y., Aires, L., Lin, Z., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopillar+force+measurements+reveal+actin-cap-mediated+YAP+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nanopillar force measurements reveal actin-cap-mediated YAP mechanotransduction.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 262-271 (2018).</li>
<li>Fracchia, A., Asraf, T., Salmon-Divon, M., Gerlitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+lamin+B1+levels+promote+cell+migration+by+altering+perinuclear+actin+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Increased lamin B1 levels promote cell migration by altering perinuclear actin organization.</a> Cells. 9 (10), 2161(2020).</li>
<li>Ramdas, N. M., Shivashankar, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+control+of+nuclear+morphology+and+chromatin+o1rganization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal control of nuclear morphology and chromatin o1rganization.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (3), 695-706 (2015).</li>
<li>Khatau, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perinuclear+actin+cap+regulates+nuclear+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A perinuclear actin cap regulates nuclear shape.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19017-19022 (2009).</li>
<li>Kim, D. H., Cho, S., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+coupling+between+nucleus+and+cell+migration+through+the+perinuclear+actin+cap%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Tight coupling between nucleus and cell migration through the perinuclear actin cap.</a> Journal of Cell Science. 127 (11), 2528-2541 (2014).</li>
</ol>

Er zijn geen belangenconflicten aan te geven.

Het beeldvormingsproces (stap 6.3) is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de fluorescentiebeelden van voldoende goede kwaliteit zijn om geldige kwantificeringsresultaten op te leveren. De z-stack-afbeeldingen van fluorescerend eiwit of kralen moeten een z-bereik hebben dat groot genoeg is om de scherpgestelde beelden op te nemen voor alle Z-posities die het monster overspant. Een andere kritische stap is het verzamelen van de referentiebeelden van fluorescerende kralen na het oplossen van de cellen (stap 6.5). Omdat de referentiebeelden op dezelfde posities in stap 6.3 moeten worden gemaakt, mag er geen relatieve verplaatsing worden geïnduceerd tussen de petrischaal, de omgevingskamer en de microscoop. De onderzoekers die de oplosstap uitvoeren, moeten voorzichtig zijn om het deksel van de petrischaal te verwijderen en ervoor te zorgen dat de toegepaste mechanische verstoring niet groot genoeg is om de locatie van de schotel in de omgevingskamer te veranderen.
Hieronder vindt u oplossingen om enkele fouten op te lossen die tijdens experimenten kunnen optreden. Als er geen macro is geactiveerd nadat u in stap 6.4 op Enter hebt geklikt, komt dit waarschijnlijk omdat het linkerondergedeelte van het scherm wordt ingenomen door een niet-elementvenster. In dat geval moet het linkerondergedeelte van het venster worden gewist, zodat macro's kunnen worden geactiveerd in Elements. Een andere veel voorkomende fout is dat de afbeeldingen met een helder veld zwart lijken. Dit probleem wordt veroorzaakt door een onvoldoende tijdsinterval tussen de acquisities van fluorescentie en helderveldbeelden. Kleine vertragingen in het tellen van de fluorescentiebeeldtijd kunnen zich in de loop van de tijd ophopen en aanzienlijke vertragingen veroorzaken en de beeldvorming van het heldere veld verstoren. Een oplossing is om de duur van één beeldvormingscyclus van alle posities aan te passen aan (niet gelijk aan) het tijdsinterval tussen het begin van opeenvolgende bewegingen. Met deze bewerking wordt de tijdtelling vernieuwd en wordt de cumulatieve fout aan het begin van elke beeldvormingscyclus geëlimineerd.
Deze volledig optische ondervragingstechnologie ondersteunt (1) een breed scala aan hardware/software, inclusief maar niet beperkt tot Nikon, (2) diverse soorten gevalideerde hydrogelsystemen, waaronder gelatine, PEG, Matrigel en collageen I-gels, en (3) de programmeerbare aanpassing op basis van verschillende behoeften van onderzoekers. Als een van de besturingsfuncties op het onderste niveau echter niet beschikbaar is via een commerciële microscoop, wordt het aanpassen van de functies met AMFIP een uitdaging. Een andere beperking van deze techniek is de ruimtelijke drift van het monster in zowel het XY- als het focusvlak (Z). Hoewel deze beperking kan worden overwonnen tijdens de nabewerking van de afbeeldingen, is het essentieel om de autofocusfunctie te verbeteren om de real-time drift van de monsters te corrigeren. Deze verbetering verhoogt de doorvoer van het beeldvormingsproces en vermindert de potentiële fout veroorzaakt door de drift tijdens experimenten.
Mechanotransducers, zoals YAP, kunnen dienen als nieuwe therapeutische doelen voor de ontwikkeling van veelbelovende kankertherapieën25,26,27. Opkomende gegevens suggereren dat YAP de proliferatie en invasie van kankercellen bevordert. Door de mechanica geïnduceerde YAP-translocatie van het cytoplasma naar de kern activeert de transcriptie van genen die verband houden met celmigratie, proliferatie, invasie en apoptose, wat leidt tot afwijkend celgedrag28,29,30,31. Dit werk was gericht op het onderzoeken van de potentiële correlatie van de YAP N / C-verhouding en celmechanica in twee typische menselijke longkanker en normale cellijnen. Tijdens de 10 uur celverspreidingsperiode vertonen PC9-cellen vergelijkbare YAP-concentraties in de kern en het cytoplasma (figuur 3D en figuur 5A). B2B-cellen vertonen een hogere YAP-concentratie in de kern dan in het cytoplasma (figuur 3C en figuur 5A). Deze relatie gevonden tijdens de vroege verspreidingsfase verschilt van de meerderheid van de gepubliceerde bevindingen die de YAP-concentratie in de kern tussen normale en kankercellen vergelijken. Hoewel niet noodzakelijkerwijs in het vroege verspreidingsstadium, tonen de meeste gepubliceerde bevindingen aan dat YAP meer geconcentreerd is in de kern van kankercellen dan in de kern van normale cellen27,28. Slechts één studie over borstkanker rapporteerde een uitzondering32 die aantoont dat YAP meer geconcentreerd is in het cytoplasma, wat overeenkomt met onze huidige waarnemingen in pc9-cellen van longkanker. Voor zover de auteurs weten, is dit werk het eerste dat een lagere YAP N / C-ratio laat zien in een menselijke longkankercellijn. De auteurs veronderstellen dat de reden voor een stabiele YAP N / C-verhouding in PC9-cellen te wijten kan zijn aan de lage variatie in het cel / kernverspreidingsgebied en tractie in PC9-cellen in het vroege verspreidingsstadium. De dissectie van de onderliggende moleculaire mechanismen van lage YAP N / C-verhouding in PC9- en B2B-cellen is aan de gang.
Tijdens de eerste 10 uur van de verspreiding vertonen deze twee cellijnen een duidelijke relatie tussen de YAP N/C-verhouding, celtractie en verspreidingsgebied (figuur 5). Voor B2B-cellen is een hogere YAP N/C-verhouding gecorreleerd met een hoger cel- en kernspreidingsgebied (figuur 6A,B), wat consistent is met de gerapporteerde gegevens van andere normale cellen33. Interessant is dat, hoewel de ontwikkelingstrend van deze relatie over het algemeen wordt gevonden in alle B2B-cellen die zijn geregistreerd, twee verschillende graden (hoog en laag) van deze relatie worden gevonden. B2B-cellen die zich tegelijkertijd verspreiden en migreren, vertonen een lagere tractie en een hoger cel- en kernverspreidingsgebied met een hogere YAP N / C-verhouding (2,05 ± 0,32). Voor B2B-cellen die zich verspreiden en op dezelfde locatie blijven, vertonen ze een hogere tractie en een lager cel- en kernverspreidingsgebied met een lagere YAP N / C-verhouding (1,74 ± 0,21). Deze twee graden van relaties worden aangetoond in de gespleten verspreide gegevensgroepen (figuur 6C,D). Zoals gemeld in de literatuur, hebben stationaire normale cellen, zoals embryonale fibroblast NIH 3T3-cellen, een hogere tractie dan migrerende cellen34. De gegevens die in dit artikel worden gerapporteerd, suggereren dat de zich verspreidende en niet-migrerende B2B-cellen een hogere tractie toepasten dan verspreidende en migrerende B2B-cellen, wat waarschijnlijk suggereert dat hoge tractie nodig is voor niet-migrerende cellen om zich op het substraat te stabiliseren.
Bovendien tonen deze gegevens aan dat stationaire normale B2B-cellen een hogere peri-nucleaire kracht genereren, terwijl eerder onderzoek uitgevoerd door andere onderzoekers alleen hogere celtractie meldde die werd gegenereerd aan de periferie van stationaire cellen34,35,36,37. De auteurs denken dat het verschil in de intrinsieke neiging van migratie in de experimenten deze tegenstrijdige resultaten kan veroorzaken. In de gepubliceerde experimenten was vierkante micropatterning gebruikt om te voorkomen dat afzonderlijke cellen zich verspreiden en migratie remmen; of de cellen de neiging hadden om te migreren is onbekend. Aangezien migrerende cellen vaak een hoge tractiekracht vertonen aan de periferie van de cellen38, is het waarschijnlijk dat cellen met de neiging om te migreren nog steeds een hoge periferietractie zullen behouden, ook al is hun migratie beperkt. In deze huidige studie worden de stationaire cellen niet beperkt door een micropattern, maar migreren ze niet, wat aangeeft dat de cellen de neiging hebben om hun niet-migrerende toestand te behouden. Een andere mogelijkheid is dat de celvorm gedefinieerd door het micropatroon de verdeling van focale verklevingen en trekkrachten kan beïnvloeden39. De resultaten in deze studie werden gegenereerd zonder enige beperkende micropatterning en vertegenwoordigen de krachtverdeling van stationaire cellen in hun oorspronkelijke vorm.
Voor zover de auteurs weten, meldde slechts één publicatie tot nu toe specifiek de vondst van peri-nucleaire krachten in normale cellen (embryonale fibroblasten van muizen), mogelijk veroorzaakt door de actinekap die zich over de nucleus uitstrekt40. YAP cytoplasma-naar-kern translocatie is gecorreleerd met de toename van peri-nucleaire kracht40. Een grondige zoektocht van de relevante literatuur leverde geen publicaties op die melding maken van een peri-nucleaire kracht of de actinecap in kankercellen. Een indirecte studie naar melanoomkankercellen toonde aan dat de actinerand (een andere peri-nucleaire actine-organisatie die zich rond maar niet in de kern bevindt) de celmigratiesnelheden vermindert41, wat indirect het bestaan van een peri-nucleaire kracht suggereert. Er worden echter geen directe experimentele gegevens gerapporteerd. In deze studie ontdekten de auteurs dat zowel PC9- als B2B-cellen peri-nucleaire verplaatsing en tractie vertonen. De mechanismen van het genereren van de peri-nucleaire krachten en hun effecten blijven controversieel. In normale cellen werd gemeld dat de actinecap een rol speelde bij het reguleren van de morfologie van de kern en de chromatineorganisatie42, het overbrengen van mechanische signalen van focale verklevingen naar de kern via linkers van nucleoskelet en cytoskelet (LINC) complex43, en het reguleren van celmigratie44. Lamin A/C is gerelateerd aan de vorming en verstoring van de actine cap40,41,42,43,44. Het rapport dat beweerde dat de actin cap een peri-nucleaire kracht genereert, hield echter geen rekening met de potentiële rol van de actine rim40. In kankercellen vergemakkelijkt overexpressie van lamin A de vorming van een actinerand en beperkt de migratie van kankercellen. Overexpressie van Lamin B vermindert actine velgvorming en bevordert migratie. De peri-nucleaire kracht kan bij dit proces betrokken zijn vanwege het bestaan van peri-nucleaire actine-organisatie en het effect van Lamin A. De resultaten van deze studie toonden echter geen bewijs van gemeten peri-nucleaire krachten of het gedrag van de actinecap. Daarom is de ontdekking van peri-nucleaire krachten in PC9-cellen in deze huidige studie het eerste rapport dat peri-nucleaire krachten en verplaatsingen in longkankercellen laat zien. De auteurs onderzoeken momenteel de moleculaire mechanismen en functies van peri-nucleaire krachten in CRISPR / Cas9-engineered PC9- en B2B-cellen.
Naast de volledig optische mechanobiologische ondervraging die in dit artikel wordt gedemonstreerd, kan het geïntegreerde multifunctionele systeem worden toegepast om optisch een groot aantal andere essentiële fysiologische en pathologische signalen in levende systemen te onderzoeken. Het laboratorium van de auteurs heeft bijvoorbeeld onlangs meerdere stabiel getransduceerde menselijke kankercellijnen vastgesteld die drie lichtgevoelige membraaneiwitten co-uitdrukken: membraanspanningsindicator QuasAr2 (excitatie: 640 nm; emissie: 660 nm-740 nm), membraanspanningsdepolarizer CheRiff (excitatie: 488 nm) en membraanspanningshyperpolarizer eNpHR3 (excitatie: 590 nm). Deze drie functionele eiwitten kunnen worden geactiveerd door spectrum-orthogonale laserlijnen op een kruisverwijzingsvrije manier, waardoor volledig optische tweerichtingssignaleringscommunicatie (uitlezing en controle) van membraanelektrofysiologie mogelijk is. Met behulp van een geïntegreerd opto-elektronisch systeem en een handmatige patch-clamp hebben de auteurs de volledig optische controle en uitlezing van de membraanspanning (Vm) in enkele menselijke kankercellen en meercellige tumorsferoïden gevalideerd. De volledig optische elektrofysiologische ondervraging opent de mogelijkheid voor gedetailleerde verkenningen van voorheen ontoegankelijke bio-elektriciteit in kankercellen, die de tumorbiologie van een nieuwe as kunnen helpen bevorderen.

Het algemene doel van deze methode is om volledig optische multifunctionele beeldvorming en analyse van levende cellen mogelijk te maken. Een alles-in-één beeldvormingsprogramma dat de automatische coördinatie van multifunctionele opto-elektronische apparaten mogelijk maakt, vermindert arbeidsintensieve en foutgevoelige handmatige bewerkingen en is essentieel voor onderzoekers om langdurige live-cell imaging uit te voeren1,2,3,4. De meeste bestaande openbare programma's in de biomedische onderzoeksgemeenschap zijn echter alleen van toepassing op beperkte opto-elektronische apparaten of vereisen extra hardware voor de coördinatie van verschillende apparatuur5,6,7,8,9. Onlangs is een open-source en software-gebaseerd programma ontwikkeld, getiteld "Automatic Multi-functional Integration Program (AMFIP)," waardoor multi-channel en time-lapse imaging mogelijk is. Op basis van Java-taal en de Application Programming Interface (API) van μManager11,12, is AMFIP ontwikkeld als een plug-in in μManager die aangepaste Java-scripts uitvoert om softwaregebaseerde communicatie van meerdere opto-elektronische hardware- en softwareplatforms uit te voeren, inclusief maar niet beperkt tot die van Nikon. De oprichting van AMFIP opent de mogelijkheid voor programmeerbare en multifunctionele ondervraging van celgedrag. Een geïntegreerd experimenteel en computationeel systeem wordt ontwikkeld in dit artikel en combineert AMFIP met digitale beeldvormingsanalyse en celtractiekrachtmicroscopie. Het systeem maakt de opheldering van de verschillende YAP-mechanobiologie in CRISPR / Cas9-engineered menselijke normale B2B (figuur 1) en longkanker PC9 (figuur 2) cellijnen mogelijk. Het systeem biedt de wetenschappelijke gemeenschap een uitgebreide oplossing die de vraag vermijdt om extra besturingsapparaten aan te schaffen die mogelijk niet beschikbaar zijn voor en / of compatibel zijn met elk beeldvormingssysteem.
De protocollen die in dit artikel worden gepresenteerd, introduceren hoe (1) AMFIP kan worden toegepast om automatische langetermijnbeeldvorming uit te voeren voor zowel CRISPR / Cas9-engineered cellijnen die mNEonGreen2-tagged YAP uitdrukken; en (2) Fiji ImageJ, MATLAB en Origin combineren voor de kwantitatieve analyse van yap nucleair/cytoplasma (N/C) verhouding op basis van hun fluorescerende intensiteit (figuur 3 en figuur 4), cellulair verplaatsingsveld (figuur 1C en figuur 2C) en cellulair tractieveld (figuur 1D en figuur 2D) ). De resultaten suggereren dat (1) tijdens de eerste 10 uur celverspreiding op de substraten met fysiologisch relevante mechanische stijfheid13,14,15,16,17,18, de YAP N/C-verhouding van enkele B2B-cellen meer merkbare tijdsafhankelijke variatie en fluctuatie vertoont in vergelijking met die van enkele PC9-cellen (figuur 5 en figuur 6). ); en (2) PC9-kankercellen genereren merkbare tractie in hun peri-nucleaire regio's (figuur 7). Het geïntegreerde systeem en de methodologieën die in dit protocol worden beschreven, overstijgen de specifieke soorten cellen en optogenetische moleculen. Onderzoekers kunnen de protocollen toepassen om hun specifieke live-cell ondervragingsexperimenten aan te passen en veelzijdige signaaldynamiek op te helderen in de context van celfysiologie en pathologie.

<table><tbody><tr><td>(3-Aminopropyl)triethoxysilaan</td><td>Sigma-aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Trypsine</td><td>Corning</td><td>25-051-CI</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 flacon</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>8 Benchtop Centrifuge</td><td>Thermo</td><td>75007210</td><td></td></tr><tr><td>A1R confocal systeem</td><td>Nikon</td><td>HD25</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Sigma-aldrich</td><td>695092</td><td>glashelder, ACS reagens, &ge;99,7%</td></tr><tr><td>BEAS-2B (B2B) cellen</td><td>Sigma-aldrich</td><td>95102433</td><td>menselijke epitheliale cellen uit longweefsel</td></tr><tr><td>Carboxylaat-gemodificeerde microsferen</td><td>Invitrogen</td><td>F8797</td><td></td></tr><tr><td>Kweekmedium (RPMI-1640)</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Desktopcomputer</td><td>Dell</td><td>2018</td><td>met Windows 10-besturingssysteem</td></tr><tr><td>Omgevingskamer TIZB</td><td>Tokai Hit</td><td>TIZB</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectine Menselijke Eiwit, Plasma</td><td>Gibco</td><td>33016015</td><td></td></tr><tr><td>Fiji ImageJ</td><td>National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation</td><td>1.53k</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal met glazen bodem</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES gebufferde zoutoplossing</td><td>Sigma-aldrich</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>Hydrazinehydraat oplossing</td><td>Sigma-aldrich</td><td>53847</td><td></td></tr><tr><td>IntelliJ IDEA</td><td>JetBrains</td><td>2020</td><td>Java ontwikkelingsplatform</td></tr><tr><td>Java Development Kit</td><td>Oracle</td><td>14.0</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimtech Science</td><td>3066-05</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>2020b</td><td></td></tr><tr><td>Monochroom &nbsp;Camera</td><td>FLIR</td><td>BFS-U3-70S7M-C</td><td></td></tr><tr><td>MycoAlert Mycoplasma Detectiekit</td><td>Lonza</td><td>LT07-218</td><td></td></tr><tr><td>N,N&prime;-Methyleenbisacrylamide oplossing</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M1533</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements software platform</td><td>Nikon</td><td>4.50</td><td>software platform</td></tr><tr><td>Origin</td><td>OriginLab</td><td>OriginPro 2017 (Learning Edition)</td><td>software voor gegevensanalyse en het maken van grafieken</td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PC9 cellen</td><td>Sigma-aldrich</td><td>90071810</td><td>menselijke adenocarcinoomcellen&nbsp; uit longweefsel</td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>&nbsp;F-553S</td><td>high-fidelity DNA polymerase</td></tr><tr><td>Scotch tape</td><td>Scotch</td><td></td><td>hechttape</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfaatoplossing</td><td>Sigma-aldrich</td><td>05030</td><td></td></tr><tr><td>Superlijm</td><td>Gorilla</td><td></td><td>cyanoacrylaatlijm</td></tr><tr><td>Ti2-E omgekeerd microscoop</td><td>Nikon</td><td>MEA54000</td><td></td></tr><tr><td>TI2-S-SE-E gemotoriseerde Stage met Encoder</td><td>Nikon</td><td>MEC56120</td><td></td></tr><tr><td>&mu;Manager</td><td></td><td>versie 2.0 gamma</td><td>open source microscoopsoftware (https://micro-manager.org/)</td></tr></tbody></table>

volledig optische mechanobiologie ondervraging van ja-geassocieerd eiwit in menselijke kanker en normale cellen met behulp van een multifunctioneel systeem

All-optical Mechanobiology Interrogation of Yes-associated Protein in Human Cancer and Normal Cells using a Multi-functional System

Langdurige multifunctionele beeldvorming en analyse van levende cellen vereisen gestroomlijnde, functionele coördinatie van verschillende hardware- en softwareplatforms. Handmatige bediening van verschillende apparatuur die door verschillende fabrikanten wordt geproduceerd, is echter arbeidsintensief en tijdrovend, waardoor de nauwkeurigheid, reproduceerbaarheid en kwaliteit van de verkregen gegevens mogelijk afnemen. Daarom kan een alles-in-één en door de gebruiker programmeerbaar systeem dat automatische, multifunctionele en langdurige beeldacquisitie mogelijk maakt en compatibel is met de meeste fluorescerende microscopieplatforms, de wetenschappelijke gemeenschap ten goede komen. Dit artikel introduceert de volledige operationele protocollen van het gebruik van een nieuw geïntegreerd softwaresysteem dat bestaat uit (1) een zelfgebouwd softwareprogramma, getiteld "Automatic Multi-functional Integration Program (AMFIP)," dat automatische multi-channel imaging-acquisitie mogelijk maakt, en (2) een suite van kwantitatieve beeldvormingsanalyse en celtractieberekeningspakketten. 
Dit geïntegreerde systeem wordt toegepast om de voorheen onbekende relatie te onthullen tussen de ruimtelijk-temporele verdeling van mechano-gevoelig Yes-geassocieerd eiwit (YAP) en de celmechanica, inclusief celverspreiding en tractie, in CRISPR / Cas9-engineered menselijke normale cellen (B2B) en longkankercellen (PC9). Gebruikmakend van het vermogen van dit systeem om meerkanaals controle en uitlezing te bieden, laat het resultaat zien: (1) B2B-normale cellen en PC9-kankercellen vertonen een duidelijke relatie tussen YAP-expressie, tractie en celdynamica tijdens celverspreidings- en migratieprocessen; en (2) PC9-kankercellen oefenen merkbare peri-nucleaire krachten toe op substraten. Samenvattend presenteert dit artikel een gedetailleerd stapsgewijs protocol over het gebruik van een geïntegreerd door de gebruiker programmeerbaar systeem dat automatische multifunctionele beeldvorming en analyse mogelijk maakt om YAP-mechanogevoeligheid op te helderen. Deze tools openen de mogelijkheid voor gedetailleerde verkenningen van veelzijdige signaaldynamica in de context van celfysiologie en pathologie.

Dit artikel presenteert een gedetailleerd stapsgewijs protocol over het gebruik van een geïntegreerd multifunctioneel en door de gebruiker programmeerbaar systeem dat automatische meerkanaals beeldvorming en mechanobiologische analyse mogelijk maakt om de mechano-gevoeligheid van Ja-geassocieerd eiwit (YAP) op te helderen.

Volledig optische mechanobiologie ondervraging van ja-geassocieerd eiwit in menselijke kanker en normale cellen met behulp van een multifunctioneel systeem

Long-term multi-functional imaging and analysis of live cells require streamlined, functional coordination of various hardware and software platforms. ...

Deze methode zal helpen bij het illustreren van moleculaire mechanismen van een veelzijdig biologisch fenomeen. Zoals mechanobiologie, optische elektrofysiologie en de superresolutie DNA / RNA-eiwitbeeldvorming met behulp van automatische live-cell imaging-technieken. Dit protocol maakt automatische, multifunctionele, high-throughput, self-drift correcting en lange termijn beeldacquisitie mogelijk.Het is compatibel met de meeste fluorescerende microscopische platforms, zoals NYCOM. Iedereen die deze techniek voor de eerste keer probeert, moet de functie van elke stap begrijpen, in plaats van alleen het protocol strikt te volgen, om een succesvol experiment te garanderen. Begin met het plaatsen van de omgevingskamer op het gemotoriseerde stadium van de omgekeerde microscoop.Stel het CO2-debiet in op 160 milliliter per minuut en pas de temperatuur van de kamer aan. Voeg vervolgens 40 milliliter gezuiverd water toe aan het bad van de kamer. Haal de petrischaal met glazen bodem met cellen uit de couveuse eruit en plaats deze in de omgevingskamer.Schakel de confocale controller en de omgekeerde microscoop in. Schakel het lichtpad naar rechts. Observeer de cellen die zich hechten met Micro Manager.Als er voldoende cellen aan de gel zijn bevestigd, breng je de petrischaal terug naar de couveuse. Zo niet, ga dan door met de celincubatie gedurende nog eens 30 minuten voor B2B en 60 minuten voor longkanker of PC-9-cellen. Knip 2 kleine stukjes plakband en plak ze op de kamer rond het ronde gat.Breng vervolgens een beetje lijm aan op het gebied van de tape dat de petrischaal zal bedekken. Haal de petrischaal uit de couveuse. Plaats de petrischaal langzaam in de kamer en laat de bodem van de schaal contact maken met de lijm.Druk 1 minuut op het deksel van de petrischaal om de lijm volledig contact te laten maken met de petrischaal en te laten stollen. Duw de petrischaal voorzichtig horizontaal om ervoor te zorgen dat de lijm is gestold en de petrischaal niet beweegt. Sluit vervolgens het deksel van de kamer.Open IntelliJ en stel een parameter T1 in regel 93 van het bestand in elements_script.java. Zorg ervoor dat deze waarde groter is dan de looptijd van de macro en elementen die worden gebruikt voor confocale beeldvorming van één gezichtsveld. Klik op de knop Uitvoeren om het AMFIP IntelliJ-project te starten.Klik op de live- en multi-deacquisitieknop op de hoofdinterface van Micro Manager en schakel vervolgens het lichtpad van de omgekeerde microscoop naar rechts voor heldere veldbeeldvorming. Schakel over naar de 10 keer objectief en open het LED-licht met de intensiteit ingesteld op 5% Klik op het lichtpad microscoop objectief en de LED-lamp knop in de elementen TI2 paneel. Pas de XY-joystick en de knop van het Z-vlak aan om de juiste positie en het scherpstelvlak van de gel op de petrischaal te vinden.Gebruik de 10 keer doelstelling om de juiste gezichtsvelden te vinden van meerdere afzonderlijke cellen die aan de gel zijn bevestigd. Vink het XY-vak meerdere posities aan in het multidimensionale acquisitievenster. Klik op de knop Positielijst bewerken en observeer het venster van de podiumpositielijst dat verschijnt.Wijzig het doel naar 40 keer, verhoog de intensiteit van het LED-licht tot 15% Pas het gemotoriseerde XY-podium aan om de gezichtsvelden te lokaliseren en noteer de coördinaten door op de markeringsknop in het venster van de podiumpositielijst te klikken. Neem 6 tot 7 gewenste gezichtsvelden op. Klik op de knop Opslaan als in het venster van de podiumpositielijst om de coördinaten vast te leggen en voer T1 in als het tijdsintervalgedeelte van beeldacquisitie naar T1 in het tijdspuntgedeelte in het multidimensionale acquisitievenster.Open elementen, verander het lichtpad naar rechts voor confocale beeldvorming en schakel het LED-lampje uit. Klik vervolgens op de knop Interlock verwijderen en schakel het FITC-laserkanaal in voor YAP-beeldvorming door het vakje FITC aan te vinken. Nadat u de scansnelheid hebt aangepast naar 1 frame per 2 seconden, draait u aan de knop van het Z-vlak om snel de Z-positie van de aangesloten cellen te vinden.Noteer de onder- en bovengrenzen voor de Z-stack. Klik op macro op het bovenste lint, selecteer macro-editor onder het macro-vervolgkeuzemenu en voer de onder- en bovengrenzen voor de Z-stack in een macrobestand in. Schakel het DAPI-laserkanaal in voor het maken van kralenbeeldvorming door het DAPI-vakje aan te vinken om de gerichte Z-positie van kralen te vinden en vast te leggen.Ga naar de macro-editor en voer de opgenomen waarden in het macrobestand in. Om de taak van het verplaatsen van de gemotoriseerde fase met AMFIP in te stellen, gaat u naar Micro Manager, klikt u op plug-ins automatisering om de grafische gebruikersinterface van AMFIP te openen. Klik vervolgens op de knoppen punt toevoegen of verwijderen om het exacte aantal geselecteerde gezichtsvelden te verkrijgen.Voer de opgenomen coördinaten van gezichtsvelden in het coördinatenpaneel in. Definieer de totale experimenttijd in het tekstveld totale experimenttijd. Klik op de extra tijdconfiguratieknop en definieer het tijdsinterval T2 van het verplaatsen van de gemotoriseerde fase naar elke FOV.Maximaliseer de venstergrootte van elementen en sleep GUI van AMFIP naar de rechterkant van het scherm om te voorkomen dat de GUI de automatische bewerkingen van de cursor verstoort en klik vervolgens op de enter-knop. Na de eerste macro eindigt. klik op de acquire-knop in het multidimensionale acquisitievenster.Nadat u de langetermijnbeeldvorming hebt voltooid, stopt u de AMFIP-taak door op de pauzeknop in het automatiseringsplug-invenster en de stopknop in het multidimensionale acquisitievenster te klikken. Open elementen en stel Z-stackafbeelding in door op de bovenste en onderste knoppen in het ND-acquisitievenster te klikken. Schakel het lichtpad naar rechts en open het LED-lampje.Verwijder langzaam en voorzichtig de deksels van de kamer en de petrischaal terwijl u het heldere gezichtsveld controleert op eventuele afwijkingen van het gezichtsveld. Gebruik een plastic pipet om 0,5 milliliter SDS-oplossing in beslag te nemen. Houd de plastic pipet voorzichtig iets boven het kweekmedium in de petrischaal en voeg 1 tot 2 druppels van de SDS-oplossing toe aan het kweekmedium.Zodra de cellen en de heldere veldweergave zijn opgelost, sluit u het LED-lampje, schakelt u het lichtpad naar links, klikt u op de knop Interlock verwijderen. Voer de Z-stack imaging uit en sla de afbeeldingsstack op als reference_N, waarbij N het volgnummer van elk gezichtsveld is. Klik op de XY-knop meerdere posities in het multidimensionale acquisitievenster.Selecteer vervolgens het volgende gezichtsveld en klik op de go-to-knop om de gemotoriseerde fase naar de tweede FOV te verplaatsen. Herhaal deze stap voor elk gezichtsveld. De nucleaire lokalisatie is van ja-geassocieerd eiwit of YAP in B2B-ells verhoogd met toenemende substraatstijfheid, terwijl PC-9-cellen een vergelijkbare YAP-concentratie vertoonden in de kern en cytoplasma op substraten met verschillende stijfheid.De B2B-cel verhoogde monotoon het verspreidingsgebied in de loop van de tijd, samen met een afname van de YAP nucleaire tot cytoplasmatische verhouding, terwijl de PC-9-cel een relatief onveranderlijk celverspreidingsgebied, oriëntatie en YAP nucleaire tot cytoplasmatische verhouding handhaafde gedurende het 10 uur durende verspreidingsproces. Tijdens de 10 uur durende duur van de vroege verspreiding vervormde de representatieve B2B-cel constitutief het substraatoppervlak en paste tijd evoluerende celtractie toe over het hele celgebied. Daarentegen ontwikkelde de representatieve PC-9-cel alleen verplaatsing en tractie aan de 2 uiteinden van het cellichaam en nam de tractie na 7,5 uur af.De YAP nucleaire tot cytoplasmatische verhouding en dipooltractie van B2B-cellen leken twee verschillende trends te volgen, wat suggereert dat er mogelijk twee groepen B2B-cellen naast elkaar bestonden in het experiment. In de eerste groep namen de YAP nucleaire tot cytoplasmatische verhouding en dipooltractie toe samen met de vergroting van het celverspreidingsgebied en bereikten hun maxima op ongeveer 1.000 vierkante micrometer. In de tweede groep namen de YAP nucleaire tot cytoplasmatische verhouding en dipooltractie langzamer toe met de vergroting van het celverspreidingsgebied en handhaafden bijna constante waarden wanneer het celverspreidingsgebied bleef toenemen.Het Z-stackbereik voor alle laserkanalen moet zorgvuldig worden bepaald om de potentiële drift van het gezichtsveld tijdens fasebewegingen in langetermijnbeelden te overwinnen. Deze nieuwe techniek maakt automatische, niet-invasieve langetermijn- en multipositiebeeldvorming mogelijk en kan helpen bij het ophelderen van moleculair biologisch mechanisme dat temporele en ruimtelijke tracking van cellen en organellen vereist.

all-optical-mechanobiology-interrogation-yes-associated-protein-human

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Dit document heeft tot doel de lezer in de exploitatie van een geïntegreerde atomic force-microscoop optische beeldvorming instrueren voor de mechanische stimulatie van levende cellen in cultuur. Een stap-voor-stap protocol wordt gepresenteerd. Een representatieve dataset die levende cellen als reactie op mechanische stimulatie shows gepresenteerd.

Live-cel respons op mechanische stimulatie onderzocht door Integrated Optical en Atomic Force Microscopy

Op lange termijn Cultuur van menselijke borstkankercellen Monsters en hun analyse met behulp van optische projectie Tomografie

We beschrijven het gebruik van een standaard optisch microscoop om kwantitatieve metingen van cellulaire massa, volume en dichtheid uit te voeren door een combinatie van lichtveld en differentiële interferentiecontrast beeldvorming.

Kwantitatieve Optische Microscopie: Meting van Cellulaire biofysische eigenschappen met een standaard optische microscoop

Beschreven worden protocollen voor het kwantificeren van mechanische interacties tussen aderente cellen en microgestructureerde substraten. Deze interacties zijn nauw verbonden met essentiële celgedragingen, waaronder migratie, proliferatie, differentiatie en apoptose. De protocollen presenteren een open-source beeldanalysesoftware genaamd MechProfiler, die de bepaling van betrokken krachten voor elke micropost mogelijk maakt.

Gemakkelijk en nauwkeurig voor mechanische profilering op MicroPOST Arrays

De assemblage en het gebruik van een multimodaal microendoscoop wordt beschreven, die oppervlakkige weefseldatagegevens kan co-registreren met fysiologische weefselparameters, waaronder hemoglobineconcentratie, melanineconcentratie en zuurstofverzadiging. Deze techniek kan nuttig zijn voor het evalueren van weefselstructuur en perfusie, en kan worden geoptimaliseerd voor individuele behoeften van de onderzoeker.

Multimodale beeldvorming en spectroscopie Fiber-bundel microendoscopy Platform voor niet-invasieve,<em&gt; In Vivo</em&gt; Tissue Analyse

Hier gepresenteerd is het protocol van de Conpokal techniek, die confocale en atomaire kracht microscopie combineert in een enkel instrument platform. Conpokal biedt dezelfde cel, dezelfde regio, in de buurt van gelijktijdige confocale beeldvorming en mechanische karakterisering van levende biologische monsters.

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) op Live Cells

Deze studie presenteert een nieuw protocol om direct mechanische kracht uit te oefenen op de celkern door middel van magnetische microbeads die in het cytoplasma worden afgeleverd en om gelijktijdige live-cell fluorescerende beeldvorming uit te voeren.

Combinatie van 3D Magnetic Force Actuator en multifunctionele fluorescentie beeldvorming om Nucleus Mechanobiology te bestuderen

Hier wordt een methode gepresenteerd om afzonderlijke cellen mechanisch te fenotyperen met behulp van een op elektronica gebaseerd microfluïdisch platform dat mechano-node-pore sensing (mechano-NPS) wordt genoemd. Dit platform handhaaft een gematigde doorvoer van 1-10 cellen / s terwijl het zowel de elastische als viskeuze biofysische eigenschappen van cellen meet.

Mechano-Node-Pore Sensing: een snel, labelvrij platform voor multi-parameter single-cell visco-elastische metingen

Dit protocol schetst de kwantificering van de mechanische eigenschappen van kankerachtige en niet-kankerachtige cellijnen in vitro. Geconserveerde verschillen in de mechanica van kankercellen en normale cellen kunnen fungeren als een biomarker die implicaties kan hebben voor de prognose en diagnose.

Shear Assay Protocol voor de bepaling van eencellige materiaaleigenschappen

Dit protocol presenteert een multimodale benadering die Raman-spectroscopie en tomografische fasemicroscopie combineert voor labelvrije, niet-invasieve fenotypering van levende menselijke borstkankercellen. Het omvat een gebruiksvriendelijke, menselijke bias-vrije analysepijplijn voor snelle, kwantitatieve morfochemische analyse, die gedetailleerde moleculaire en structurele inzichten biedt met toepassingen in kankeronderzoek en celbiologie.

Een multimodaal beeldvormingskader om fenotypering van levende labelvrije borstkankercellen te bevorderen

Dit protocol beschrijft een methodologie voor multiplex-mRNA-detectie met massacytometrie voor eiwitbeeldvorming in in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde weefselsecties.

Moleculaire cartografie met dubbele modaliteit: integratie van multiplex-mRNA-detectie met massacytometrie voor eiwitbeeldvorming

Leer hoe u een multifunctioneel systeem gebruikt voor optische mechanobiologie-onderzoek van YAP-eiwit in menselijke kanker- en normale cellen. Deze methode combineert automatische beeldvorming met mechanobiologische analyse.

Volledig optische mechanobiologie ondervraging van ja-geassocieerd eiwit in menselijke kanker en normale cellen met behulp van een multifunctioneel systeem (Video) | JoVE Journal

Volledig optische mechanobiologie ondervraging van ja-geassocieerd eiwit in menselijke kanker en normale cellen met behulp van een multifunctioneel systeem

Meer video's verkennen