DUCT: Double Resin Casting gevolgd door Micro-Computed Tomography voor 3D Leveranalyse

Deze methode stelt ons in staat om de architectuur van levervaat- en galsystemen in 3D te analyseren, visualiseren en kwantificeren. We kunnen nu de ruimtelijke aspecten van leverziekte en regeneratie beter begrijpen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het niet afhankelijk is van het bestaan van antilichamen of fluorescentiebeeldvorming.

Het maakt ook directe visualisatie mogelijk van welke netwerken goed lumen zijn. Deze methode is geschikt voor de analyse van buisvormige systemen, vandaar dat onderzoek van bloedvaten, galwegen en luchtwegen ideale gebieden zijn. We gebruikten DUCT om de structurele veranderingen met betrekking tot galregeneratie te begrijpen.

Voordat u hars in het galsysteem van de muis injecteert, begint u de darm en pancreas naar de linkerkant van de muis te verplaatsen, met behulp van een wattenstaafje bevochtigd met PBS om de gemeenschappelijke galwegen en poortader bloot te leggen. Maak vervolgens een kleine transversale incisie in de inferieure vena cava. Draai de ventrale kant van de lever naar het hart om het viscerale oppervlak en het hilarische gebied bloot te leggen en lokaliseer het gemeenschappelijke galkanaal dat loopt van het hilarische gebied over de pancreas en in de darm bij de sluitspier van Oddi.

Gebruik de rechte tang om het omliggende weefselgebied van ongeveer vijf millimeter van het gemeenschappelijke galkanaal te verwijderen. Bind vervolgens, door een zijden hechtdraad onder het gemeenschappelijke galkanaal te plaatsen, een losse bovenhandse knoop rond het gemeenschappelijke galkanaal. Houd de veerschaar plat tegen het gemeenschappelijke galkanaal om een schuine incisie te maken naar het gemeenschappelijke galkanaal op de plek waar het gemeenschappelijke galkanaal de pancreas en darm binnenkomt naast de sluitspier van Oddi.

Meng vervolgens een milliliter van de gele hars met 50 microliter van het MV-uithardingsmiddel en vul een luerspuit van één milliliter met het mengsel van het harsuithardingsmiddel. Sluit de gevulde spuit aan op de slangenset één en druk op de zuiger om de slang te vullen totdat het mengsel van harsuithardingsmiddel uit de punt van de slang druppelt. Gebruik de tang om het gebied rond de gemeenschappelijke galwegincisie recht te trekken.

Voordat de slang in de opening in het gemeenschappelijke galkanaal wordt ingebracht met de langste rand van de afgeschuinde punt naar beneden naar de dorsale kant van het galkanaal. Span vervolgens de zijden draadknoop aan om de slang in het gemeenschappelijke galkanaal vast te zetten. Na het injecteren van de hars in het gemeenschappelijke galkanaal, observeer de galblaas en de individuele leverlobben.

Masseer de lever met een pbs-bevochtigd wattenstaafje om de hars gelijkmatig te verspreiden. Met hars gevulde galwegen terminale takken zullen vaag zichtbaar zijn aan het leveroppervlak. Stop met het injecteren van de hars wanneer er stippen hars verschijnen aan het oppervlak van de lever of wanneer weerstand wordt bereikt.

Verwijder vervolgens de slang door uit het gemeenschappelijke galkanaal te trekken en draai de zijden knoop snel aan met een tang om te voorkomen dat de hars eruit lekt. Snijd de losse uiteinden van de zijden hechtdraad, zodat ze de poortaderinjectie niet verstoren. Voordat u de hars in de poortader injecteert, verwijdert u de poortader uit het omliggende weefsel op ongeveer twee centimeter van de binnenkomst in de lever, met behulp van een rechte tang.

Plaats vervolgens de zijden hechtdraad onder het vrijgemaakte gebied van de poortader om een losse bovenhandse knoop te binden. Maak in de poortader distale naar de lever een longitudinale incisie voordat u de knoop bindt. Bereid vervolgens het mengsel van het groene harsuithardingsmiddel in de spuit en vul de slang met het mengsel zoals eerder is aangetoond.

Gebruik de tang om de poortader recht te trekken door het omliggende weefsel naar de staartzijde te trekken voordat u de slang met de langste rand van de afgeschuinde punt naar de dorsale kant van het vat brengt. Span de zijden draad aan om de slang in de poortader vast te zetten. Na het injecteren van de hars in de poortader, observeer je de bloedvaten die zich vullen met hars en masseer je de lever met een PBS-bevochtigd wattenstaafje om de hars te helpen verspreiden.

Wanneer alle bloedvaten gevuld zijn, trekt u de slang uit de poortader en spant u snel de zijden knoop aan met een tang om te voorkomen dat de hars eruit lekt. Voor micro-computertomografie of MicroCT-scan van de ontleedde lever van de muis, plaats de rechter mediale leverkwab in een conische buis van 15 milliliter en vul de buis met 1% agarosegel tot ongeveer twee derde van het totale volume van de buis om ongewenste monsterbewegingen tijdens MicroCT-meting te minimaliseren. Monteer de conische buis van 15 milliliter met het monster op de rotatietrap van een CT-apparaat.

Laat de buis zich gedurende ten minste één uur thermisch aanpassen aan de meetkamer. Wanneer het monster thermisch is aangepast, centreert u het in het gezichtsveld of FOV en optimaliseert u vervolgens de afstanden van het bronmonster en de monsterdetector, of SSD en SDD om voldoende voxelresolutie te bereiken. Zodra de parameters zijn ingesteld, start u een CT-meting.

Gebruik speciale tomografische reconstructiesoftware om de CT-gegevens te reconstrueren. Als u de CT-gegevens wilt analyseren, laadt u de bestanden door bestand, import en opdracht te selecteren. Gebruik de oppervlaktebepalingsfunctie op het bovenpaneel om de hars in de gegevens te segmenteren met behulp van globale drempelwaarden.

Bepaal in het dialoogvenster de drempelwaarde met de histogramevaluatie door de positie van de rode isowaardelijn in te stellen om alleen de met hars gevulde vaten te segmenteren. Selecteer in het linkerdeelvenster de module ROI maken van volume of CAD of mesh om een interessegebied of ROI van de met hars gevulde vaten te maken. Gebruik in het dialoogvenster de optie ROM's maken van effen om de naam van het verwerkte volume te selecteren en te bevestigen.

Elimineer foutieve segmentatie van ruisclusters in het achtergrondgebied van deze ROI. Markeer de ROI in het rechterdeelvenster door met de rechtermuisknop te klikken en de ROI van modulesplitsing te selecteren. Stel in het dialoogvenster de minimale volumeproxelparameter in om alle ruisdeeltjes uit te sluiten.

De parameterwaarde is experiment- en gegevensafhankelijk en geoptimaliseerd voor elk te analyseren monster. Gebruik op het linkerpaneel de afvlakkingsmodule om gladde, continue en solide kanaalmaskers te maken zonder artefacten, zoals de aanwezigheid van luchtbellen of harslekkage in de ROI van de harskosten. Creëer een afzonderlijke ROI zoals eerder beschreven voor het systeem gevuld met de meer absorberende hars zoals de gele hars die wordt gebruikt voor de gemeenschappelijke galweginjectie met hogere intensiteitswaarden in de CT-gegevens.

Markeer en harsmasker de nieuwe ROI door met de rechtermuisknop te klikken voordat u URI's aftrekt en vervolgens de nieuwe ROI van de ROI van het harsmasker aftrekt om een nieuwe ROI voor het resterende buisvormige systeem te creëren. Exporteer de resulterende ROI's voor beide buissystemen in verschillende formaten op basis van operatorreferenties voor latere verwerking in verschillende software. Verwerk verder de resulterende ROI's in een volumegrafische software om de uiteindelijke visualisatie in de vorm van een afbeelding of een video te exporteren.

In deze studie werd een succesvolle dubbele harsinjectie bereikt met goed gevulde intrahepatische galwegen en portale ader vasculatuur. De representatieve analyse illustreert het resultaat van de gesegmenteerde gegevens van een goed geïnjecteerde lever voor een P15-muis en een volwassen muis waar hars zichtbaar is in de zijtakken. In het typische voorbeeld van mislukte injectie resulteerde fysieke schade aan de lever tijdens de chirurgische ingreep in het lekken van de hars.

Ook de voortijdige verharding van de hars in de naald of de punt van de slang vóór de injectie en de onvoldoende transcardiale perfusie veroorzaakten ondervulling van het systeem. De kleine harslekkage kan handmatig worden gecorrigeerd tijdens MicroCT-gegevenssegmentatie. Hoge injectiedruk kan vaten of kanalen scheuren en het vat of de kanaalarchitectuur onomkeerbaar beschadigen.

Bovendien waren de bubbels een ander veel voorkomend injectieartefact dat leidde tot de schaarse vulling van de buisvormige netwerken. Wanneer vers geopende hars werd gebruikt, werd een duidelijk verschil waargenomen in het contrast tussen de gele hars geïnjecteerde galkanalen en groene hars geïnjecteerde poortaders. Na drie maanden opslag was het contrast voldoende om de poortader te onderscheiden van de galgang.

De neerslag beïnvloedde echter het mengen van de twee harsen, wat zichtbaar was als een heterogene opaciteit in de gevulde poortader. Wanneer de hars ouder was dan zes maanden, daalde het contrast tot een punt waarop het onhaalbaar was om het geel geïnjecteerde galkanaal te onderscheiden van de groen geïnjecteerde poortader, alleen al op basis van hun contrast. Het is cruciaal om een schuine incisie te maken in de gemeenschappelijke galwegen.

Anders zal het erg moeilijk zijn om de slang in te brengen. De DUCT-techniek verlicht nieuwe architecturale mechanismen van galregeneratie in een klinisch relevant model met duidelijke kenmerken in de hilaire en perifere kwabgebieden.