Microfluïdische fabricage van core-shell microcapsules met menselijke pluripotente stamcelsferoïden

Het gebied wordt beschouwd als van belang in 3D-culturen van menselijke pluripotente stamcellen vanwege de verbeterde pluripotentie en het differentiatiepotentieel dat deze cultuur heeft gevormd. We beschreven onze inkapselingsstrategie die leidt tot reproduceerbare vorming van menselijke pluripotente stamcellen sferoïden. Eenmaal ingekapseld, zijn deze stamcelsferoïden vatbaar voor teelt, hetzij in multi-well platen of geroerde bioreactoren.

Onze inkapselingsstrategie is het optimaliseren van de overlevingskansen van pestilentie en de hoge efficiëntie van sferoïdevorming. Ingekapselde sferoïden worden beschermd tegen afschuiving of mechanische energie geassocieerd met roeren of schommelen. De ontwikkeling van stamcellen afgeleid van de cellulaire therapie hangt gedeeltelijk af van het vermogen om het gewenste cellulaire product op een schaalbare, efficiënte en kosteneffectieve manier te genereren.

De hier beschreven inkapselingstechnologie vertegenwoordigt een stap in deze richting. De hier beschreven inkapselingstechnologie zal waarschijnlijk toepasbaar zijn op 3D-cultivatie van verschillende celtypen van andere cellen naar andere pluripotente stamcellen. Begin met het bereiden van 30 milliliter twee keer de kernvoorraadoplossing door 4,8 gram 35 kilodalton PEG, 10,2 milliliter dichtheidsgradiëntmedia en 19,8 milliliter DMEM / F-12-media te mengen.

Filter vervolgens deze kernoplossing met behulp van een spuitfilter van 0,22 micrometer. Bereid vervolgens 50 milliliter minerale olie met 3 procent oppervlakteactieve stof door 48,5 milliliter minerale olie en 1,5 milliliter oppervlakteactieve stof te mengen. Steriliseer vervolgens de oplossing door deze door een spuitfilter van 0,22 micrometer te laten gaan.

Bereid vervolgens 1 molaire DTT, 1 molaire TEA en 1 procent PF127-oplossingen, zoals beschreven in het teksthandschrift. Bereid vervolgens een cross-linker emulsie door 4,5 milliliter minerale olie te mengen met 3 procent oppervlakteactieve stof en 300 microliter 1 molaire DTT. Na het vortexen van de oplossing gedurende twee minuten, soniceer gedurende 45 tot 60 minuten in een ultrasoon bad bij 20 graden Celsius en laad het op een spuit van 5 milliliter met een naald van 27 gauge.

Bereid vervolgens een afschermende olieoplossing voor door de minerale olie met 0,5 procent oppervlakteactieve stof in een spuit van 5 milliliter met een naald van 27 gauge te laden. Om de shell-oplossing te bereiden, voegt u 32 milligram PEG4-maleimide toe aan 400 microliter DPBS. Voeg vervolgens 6 microliter van 1 kies TEA toe.

Vortex de oplossing gedurende 2 minuten en centrifugeer deze door een spinfilter. Houd de oplossing in het donker op de wip gedurende 30 minuten voordat u deze in een spuit van 1 milliliter met een naald van 27 gauge laadt. Bereid ten slotte de uiteindelijke kernoplossing voor door 20 miljoen hPSC's opnieuw op te schorten in media van 200 microliters en te mengen met 30 microliter van 1 procent PF127 en 200 microliter 2X-kernoplossing.

Steek een kleine roerstaaf in een spuit van 1 milliliter. Laad vervolgens de cel met kernoplossing in de spuit met een naald van 27 gauge. Begin met het plaatsen van het gebonden PDMS-druppelapparaat, 4 stuks van 20 centimeter lang en 1 stuk van 5 centimeter lange inlaatmicrobuisjes, 1 stuk uitlaatbuis van 10 centimeter en 6 stuks van 0,5 centimeter fittingbuizen onder de kiemdodende lichtbron gedurende 30 minuten voor sterilisatie.

Plaats nu de 4 stuks van 20 centimeter lange inlaatmicrobuisjes in de schaal, olie, cross-linker emulsie en dissociatie-apparaatinlaten met behulp van een tang. Steek vervolgens het andere uiteinde van de buisjes in de naald van de spuit met de bijbehorende oplossing. Verbind ondertussen de kerninlaat van de microfluïdische apparaten en de uitlaat van de dissociatieapparaten met een microbuis van 5 centimeter.

Steek 1 uitlaatbuis in de vloeistofuitlaatpoort en plaats het andere uiteinde in een opvangreservoir. Plaats het apparaat vervolgens op een microscooptrap en bevestig de slang om beweging te voorkomen. Lijn en richt de microscoop op het mondstuk van het apparaat voor stroominspectie.

Plaats elke spuit op verschillende spuitpompen en zet goed vast. Programmeer elke pomp volgens de protocollen van de fabrikant volgens de stroomsnelheden die in het tekstmanuscript worden vermeld en start de stroom in alle pompen. Wacht tot elke vloeistof het apparaat binnenkomt en vul de kanalen terwijl u de resterende lucht naar buiten duwt.

Wanneer de capsulevorming is gestabiliseerd, plaatst u het andere uiteinde van de opvangbuis in een nieuwe conische buis met 5 milliliter mTeSR-media. Zodra voldoende capsules zijn verzameld, incubeer ze gedurende 10 minuten. De capsules die zich in de oliefase bevinden, bevinden zich aan de bovenkant van de buis, die naar de bodem sedimenteert bij het zachtjes tikken op de buis.

Om de capsules op te halen, begint u met het verwijderen van olie uit de opvangbuis. Plaats vervolgens de capsules op een celzeef van 100 micrometer poriegrootte en was de zeef met overvloedige hoeveelheden media. Keer het filter om bovenop een put van een 6-well kweekplaat en vang de microcapsules door 2 milliliter media door het filter te laten gaan.

Incubeer de stamcelcapsules in een 6-well kweekschaal bij 37 graden Celsius met 5 procent koolstofdioxide. Vervang de media om de dag door de capsules op een celzeeffilter te verzamelen, ze te wassen met overtollige media en ze opnieuw op te hangen in een nieuwe put in 6-putplaten met 2 milliliter media. Voer de levensvatbaarheidstest uit door 4 microliter van de 2 micromolaire Ethidium Homodimer-1 en 1 microliter van de 4 micromolaire Calcein-AM-oplossingen toe te voegen aan 2 milliliter steriele DPBS.

Vortex om een volledige menging te garanderen. Verzamel ongeveer 100 microcapsules op een celzeef en spoel ze af met steriele DPBS om mediumdiffusie uit de capsules mogelijk te maken. Verzamel ze opnieuw in een 12-well kweekplaat met behulp van 1 milliliter van de bereide oplossing met Ethidium Homodimer-1 en calceïne AM en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 20 minuten.

Visualiseer de cellen onder een fluorescentiemicroscoop. De optimale en suboptimale microcapsules vervaardigd met behulp van microfluïdische druppelgeneratie vertoonden verschillen in capsulemorfologie als functie van peg4-maleimidegehalte in de schaal. Gladde capsules met heldere randen worden geassocieerd met de gewenste mechanische integriteit.

Aggregatie van kralen in het midden van de capsules geeft aan dat de kern waterig was en dat de kralen vrij waren om te bewegen. De fluorescerende annulus duidde op de aanwezigheid van een hydrogelschaal en werd gebruikt om de dikte van de schaal te bepalen. Levende of dode kleuringen 6 uur na het inkapselen van H9-cellen toonden aan dat de cellen routinematig meer dan 95 procent levensvatbaarheid bereikten tijdens de inkapselingsruns.

Bij het vergelijken van de groeisnelheid en het differentiatiepotentieel van ingekapselde versus niet-ingekapselde sferoïden. Er werd vastgesteld dat het proces van inkapseling geen nadelige effecten heeft op hPSC's. Houd er rekening mee dat het belangrijk is om een optimale stroomsnelheidsverhouding vast te stellen tussen de kernschil en oliestromen.

Als u dit niet doet, kan dit resulteren in capsules die niet mechanisch sterk zijn en kunnen scheuren tijdens het hanteren. We willen erop wijzen dat deze inkapselingstechniek voor andere celtypen was dan menselijke pluripotente stamcellen. We hebben, voornamelijk verondersteld, kankercellijnen en mesenchymale stamcellen ingekapseld met behulp van een vergelijkbare strategie.

Momenteel ontwikkelt ons team de volgende generatie microcaptures. Deze microcaptures zijn bioactief en kunnen worden geladen met kruisfactoren voor ingekapselde differentiatie van stamcellen.