Continue fluorescentie-gebaseerde endonuclease-gekoppelde DNA-methylatietest om te screenen op DNA-methyltransferaseremmers
5 augustus 2022
DNA-methyltransferasen zijn potentiële doelwitten van kankergeneesmiddelen. Hier wordt een protocol gepresenteerd om kleine moleculen te beoordelen op DNA-methyltransferaseremming. Deze test maakt gebruik van een endonuclease om DNA-methylatie te koppelen aan fluorescentiegeneratie en maakt het mogelijk om enzymactiviteit in realtime te volgen.
Een robuuste plaatlezertest zoals de onze is zeer nuttig voor de eerste screening van potentiële methyltransferaseremmers. De mogelijkheid om gegevens in realtime te verzamelen is een groot voordeel van de continue endonuclease-gekoppelde test. Begin met het bereiden van 600 microliter van de testomstandigheden die 20 micromolaire en 50 micromolaire verbindingen afzonderlijk bevatten in de microcentrifugebuizen op ijs.
Voeg hiervoor dubbel gedestilleerd water en 5X methylatiebuffer toe aan elke buis om een uiteindelijke concentratie van 1X methylatiebuffer te bereiken. Voeg vervolgens 3,15 microliter 20 milligram per milliliter runderserumalbumine of BSA toe aan elk monster. Voeg vervolgens twee microliter 3,15 micromolair haarspeld DNA-substraat en 1,33 microliter 4,75 micromolair S-adenosylmethionine of SAM toe aan elk monster.
Voeg de remmer toe aan de juiste monsters om een eindconcentratie van 21 micromolair of 52,5 micromolair en een equivalente hoeveelheid dimethylsulfoxide of DMSO aan een controlemonster te bereiken voordat de oplossingen gedurende drie seconden met 3.000 omwentelingen per minuut worden gemengd. Draai vervolgens de monsters gedurende een paar seconden in een tafeltafel minicentrifuge op 1, 200 maal G om ervoor te zorgen dat de oplossing op de bodem van de buis wordt verzameld. Aliquot 95 microliter van elke testoplossing in zes opeenvolgende putten in een zwart half gebied 96 putplaat.
Bereid 75 microliter Gla I of DNMT1 plus Gla I enzymoplossing in de microcentrifugebuizen zoals eerder beschreven tot een uiteindelijke concentratie van eenmalige buffer. Voeg vervolgens 1,2 microliter van 10 eenheden per microliter Gla I toe aan elke oplossing om een uiteindelijke concentratie van 0,16 eenheden per microliter te bereiken. Voeg 0,6 microliter van vijf micromolaire RFTS-ontbrekende DNMT1 toe aan de DNMT1 plus Gla I-oplossing voor een eindconcentratie van 40 nanomolair.
Na voorzichtig mengen, draai de monsters gedurende enkele seconden in een tafelblad minicentrifuge op 1.200 G om ervoor te zorgen dat de oplossing op de bodem van de buis wordt verzameld. Vervolgens aliquot 12 microliter van elke enzymoplossing in zes putten in een conisch bodemplaatje van 96 putten. Voor de methylatietest van het DNA-monster verwarmt u de plaatlezer voor op 37 graden Celsius.
Plaats vervolgens de zwarte plaat met de testoplossingen in de plaatlezer. Na het schudden van de plaat op 425 CPM, meet de fluorescentie met een excitatiegolflengte van 485 nanometer en een emissiegolflengte van 528 nanometer. Incubeer vervolgens de plaat op 37 graden Celsius gedurende vijf minuten.
Verwijder de testplaat uit de plaatlezer en voeg vijf microliter van de enzymoplossing toe aan elke put, gevolgd door de oplossing te mengen door op en neer te pipetteren. Steek de plaat in de plaatlezer en schud de plaat voordat u de fluorescentie elke 53 seconden gedurende 30 minuten opneemt. Verkrijg de gemiddelde fluorescentie van de drievoudige Gla I-controletests voor elke aandoening en trek de gemiddelde Gla I-met controlereactietrays af van de drievoudige sporen die zijn verkregen in aanwezigheid van RFTS-ontbrekende DNMT1.
Bepaal vervolgens de gemiddelde en standaardfout van het gemiddelde voor de gecorrigeerde replicaties. Plot het gemiddelde gecorrigeerde reactiespoor en pas het initiële lineaire gedeelte aan op een lijn om de beginsnelheid te bepalen. Bepaal het percentage activiteit door de snelheid waargenomen in de aanwezigheid van een verbinding te delen door de snelheid waargenomen in de DMSO die controlereactie bevat en te vermenigvuldigen met 100.
De resultaten van een discontinue endonuclease-gekoppelde test toonden aan dat volledig gemethyleerd product-DNA wordt beschermd tegen splitsing, wat bevestigt dat RFTS-ontbrekende DNMT1 actief is en in staat is om het gehemimethyleerde substraat-DNA te methyleren. In de op fluorescentie gebaseerde test had, bij afwezigheid van Gla I, de toevoeging van DNMT1 of buffer alleen geen invloed op de achtergrondfluorescentie. Latere toevoeging van Gla I aan alle assays resulteerde in fluorescentiegeneratie alleen in assays die DNMT1 bevatten.
De gelijktijdige toevoeging van RFTS-ontbrekende DNMT1 en Gla I aan drie assays resulteerde in robuuste fluorescentiegeneratie. De toevoeging van Gla I alleen produceerde geen fluorescentie. Om te screenen op potentiële remmers, werd de DNA-methylatieactiviteit van RFTS-ontbrekende DNMT1 onderzocht in aanwezigheid van DMSO, verbinding één, verbinding twee of verbinding drie bij 20 en 50 micromolaire concentraties.
De verbindingen die de fluorescentiegeneratie in deze gekoppelde test verminderen, moeten verder worden gevalideerd. Ervoor zorgen dat de verbindingen het koppelende enzym niet remmen, is een belangrijke volgende stap.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het beoordelen van kleine moleculen als mogelijke remmers van DNA-methyltransferasen, die belangrijke doelen zijn in kankertherapie. De test gebruikt een endonuclease om DNA-methylatie te koppelen aan fluorescentie, waardoor real-time monitoring van enzymactiviteit mogelijk wordt.
Belangrijkste onderdeel van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biochemie
- Kankeronderzoek
Achtergrond
- DNA-methyltransferasen spelen een cruciale rol in genexpressie en kanker.
- Het remmen van deze enzymen kan therapeutische voordelen bieden bij kankerbehandeling.
- Real-time assays verbeteren het screeningproces voor mogelijke remmers.
- Fluorescentie-gebaseerde methoden maken een gevoelige detectie van enzymactiviteit mogelijk.
Doel van het onderzoek
- Om een robuuste test te ontwikkelen voor het screenen van DNA-methyltransferaseremmers.
- Om real-time dataverzameling te gebruiken voor verbeterde testprestaties.
- Om de identificatie van kleine moleculen die DNA-methyltransferaseactiviteit kunnen remmen, te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Bereiding van testcondities met specifieke concentraties van verbindingen.
- Gebruik van bovien serumalbumine (BSA) in de testopstelling.
- Incorporatie van haarspeld DNA-substraat en S-adenosylmethionine (SAM).
- Monitoring van enzymactiviteit door fluorescentiegeneratie.
Belangrijkste resultaten
- De test maakt continue monitoring van DNA-methyltransferaseactiviteit mogelijk.
- Real-time dataverzameling biedt een significant voordeel ten opzichte van traditionele methoden.
- Eerste screening van verbindingen laat belofte zien in het identificeren van mogelijke remmers.
- De methode is aanpasbaar voor verschillende kleine molecuulbibliotheken.
Conclusies
- De ontwikkelde test is effectief voor het screenen van DNA-methyltransferaseremmers.
- Real-time monitoring verbetert de betrouwbaarheid van de resultaten.
- Deze aanpak zou de ontdekking van nieuwe kankertherapieën kunnen versnellen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This continuous fluorescence-based endonuclease-coupled assay enables real-time monitoring of DNA methyltransferase activity, supporting early-stage screening of small molecule inhibitors. By providing quantitative initial velocity measurements in a microtiter plate format, the method reduces reagent consumption and increases throughput for target validation campaigns. The assay’s ability to detect concentration-dependent inhibition aids in prioritizing compounds with mechanistic relevance to epigenetic dysregulation in cancer.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of DNMT1 inhibition kinetics to validate epigenetic targets in oncology pipelines.
- Operational Value: Supports rapid assessment of small molecule effects on enzyme activity using fluorescence readouts in a plate-based format.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates real-time, continuous data to distinguish true inhibitors from assay artifacts in primary screens.
- Operational Value: Compatible with standard plate readers and microtiter plates, enabling scalable screening of compound libraries.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links biochemical inhibition of DNMT1 to downstream epigenetic effects, supporting mechanistic de-risking of lead candidates.
- Operational Value: Provides a reproducible platform for hit-to-lead progression where target engagement is a key decision criterion.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery workflow, positioning after target confirmation and before lead optimization, where biochemical validation of target modulation is essential.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing of DNMT1 inhibition as a mechanism for altering DNA methylation patterns in disease models.
- Screening: Enables primary screening of compound libraries with real-time kinetic readouts to identify active molecules.
- Analytics: Delivers initial velocity and percent activity outputs that allow quantitative comparison of inhibitor potency across conditions.
- Translational Research: Supports continuity from enzymatic inhibition to cellular epigenetic outcomes when paired with downstream validation assays.
- Enterprise Reuse: Can be adapted for screening other DNMT isoforms or methyltransferase targets using the same endonuclease-coupled fluorescence principle.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target modulation by providing direct, real-time measurement of enzyme activity changes.
- Operational Value: Reduces reagent use and assay time through miniaturized, continuous monitoring in a 96-well format.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by distinguishing specific DNMT1 inhibitors from non-specific fluorescence interferents early in screening.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds demonstrating concentration-dependent, mechanism-consistent inhibition.
Implementation Considerations
- Requires expertise in enzymology and fluorescence-based assay design to interpret kinetic traces and control for background signals.
- Dependent on access to a plate reader capable of temperature control and timed fluorescence excitation at 485 nm and emission at 528 nm.
- Necessitates standardization of reagent preparation, including hemimethylated DNA substrate, SAM, BSA, and Gla I endonuclease, to ensure assay reproducibility.
- Requires validation that test compounds do not inhibit the coupling enzyme Gla I or interfere with fluorescence independently.
- Limited to methyltransferase activity assessment and does not directly report on cellular permeability, metabolic stability, or off-target effects.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:24
Prepare Assay Solutions for the Screen
1:48
Prepare Enzyme Solutions for the Screen
2:52
Run the Methylation Assay and Analyze the Data
4:29
Results: Determination of Initial Velocities of DNA Methylation in the Presence and Absence of Potential Inhibitors
5:40
Conclusion
