Faagdisplay gebruiken om ubiquitinevariatoren voor E3-ligases te ontwikkelen

Faagweergave helpt ons niet alleen de bindingskenmerken van klinisch belangrijke enzymen te onderzoeken, maar ontwikkelt ook modulatoren voor die enzymen en de bijbehorende ziekten. Faagweergave kan worden gebruikt om nieuwe bindmiddelen te ontwikkelen voor een breed scala aan doeleiwitten en is ook gemakkelijker uit te voeren dan andere conventionele weergavemethoden. Deze procedure omvatte veel repetitieve actie, dus de sleutel is om niet automatisch te werken en gedurende de hele tijd gefocust te blijven.

Begin met het inenten van 30 milliliter 2YT tetracycline bouillon met 200 microliter van de zaadcultuur. Incubeer het gedurende ongeveer drie uur bij 37 graden Celsius met 200 RPM orbitaal schudden totdat de bacteriën zich in de middenlogfase bevinden. Gooi de coatingoplossing van de plaat weg in een gootsteen.

Droog het voorzichtig af met keukenpapier. Voeg vervolgens 200 microliter PB-buffer toe aan elke gecoate put. Gooi de PB-buffer van het bord en droog deze op keukenpapier.

Voeg nog eens 200 microliter PB-buffer toe aan elke gecoate put van de plaat. Incubeer het bij kamertemperatuur gedurende een uur met 300 RPM orbitaal schudden. Ontdooi de faagbibliotheek op ijs en verdun deze vervolgens tot 100X de bibliotheekdiversiteit in PBS.

Voeg de polyethyleenglycolnatriumchlorideoplossing toe aan een vijfde van het verdunde bibliotheekvolume en incubeer de oplossing gedurende 30 minuten op ijs. Centrifugeer vervolgens de oplossing op 11.000 keer G gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Gooi het supernatant weg en centrifugeer het nog twee minuten om het resterende supernatant naar beneden te trekken en de faagkorrel te concentreren.

Resuspend de faagkorrel voorzichtig in één milliliter PBT-buffer per te analyseren doeleiwit, meestal vier in totaal. Voeg 100 microliter faagbibliotheek toe aan elke gecoate put in de controleplaat. Incubeer het bij kamertemperatuur gedurende een uur met 300 RPM orbitaal schudden.

Gooi de PB-buffer van de doelplaat in de gootsteen en droog de plaat op keukenpapier. Breng alle 100 microliter van de faagbibliotheek in de controleplaat over naar elke gecoate put van de doelplaat. Incubeer het bij kamertemperatuur gedurende een uur met 300 RPM orbitaal schudden.

Verwijder vervolgens de faagbibliotheek van de plaat en was de gecoate putten vier keer met PT-buffer. Keer de plaat om en tik op een papieren handdoek om de laatste druppels buffer te verwijderen. Voeg 100 microliter 0,1 molair zoutzuur toe aan elke gecoate put om de faag te elueren.

Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten met 300 RPM orbitaal schudden. Neutraliseer daarna de pH door 12,5 microliter pH 11 één molaire tris hydrochloride toe te voegen aan elke gecoate put. Breng de geëlueerde faag uit alle acht putten over in een enkele microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.

Pipetteer op en neer tijdens de overdracht om oplossingen homogeen te maken en alle vloeistof uit de putten op te zuigen. Voeg 10% BSA toe aan de geëlueerde faag om de uiteindelijke concentratie 1% te maken Bewaar de microcentrifugebuis bij vier graden Celsius. Dit is de ronde één uitgang.

Bereid een zaadcultuur voor voor het kweken van de faaginvoer voor de volgende selectieronde door vijf milliliter 2YT tetracycline-zaadkweek te enten met een geïsoleerde E.coli-kolonie uit een agarplaat. Incubeer het 's nachts bij 37 graden Celsius met 200 RPM orbitaal schudden. Verdun het doeleiwit in de rondes twee en drie buis met een geschikte hoeveelheid PBS.

Neem de helft van de inhoud van ronde twee en drie buis en dek vier putjes per doeleiwit in een 96-well bindingsplaat voor de volgende ronde. Gebruik vervolgens de helft van de round one-uitgang om drie milliliter mid-log fasecellen te enten. Incubeer het bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten met 200 RPM orbitaal schudden.

Voeg M13KO7 helperfaag toe aan een uiteindelijke concentratie van 10 miljard PFU per milliliter. Incubeer het opnieuw bij 37 graden Celsius gedurende een uur met 200 RPM orbitaal schudden. Breng na een uur de volledige drie milliliter cultuur over op 30 milliliter 2YT carbenicilline kanamycine-oplossing.

Groei 's nachts bij 37 graden Celsius met 200 RPM orbitaal schudden. De representatieve resultaten voor een selectie van ubiquitinevarianten tegen UBE4B worden hier weergegeven. UIV's werden besteld van de hoogste naar de laagste frequentie.

Sequenties vertegenwoordigen het gediversifieerde ubiquitinegebied in de UBV met alle gerandomiseerde residuen. De relatieve bindingsaffiniteit van de bindmiddelen aan het wildtype doeleiwit, gemuteerd doeleiwit en off-target eiwitten wordt gemeten door enzymgebonden immunosorbent assays of ELISA. Alle ELISA-absorpties werden genormaliseerd tegen 96 gemiddelde BSA ELISA-scores en 96 gemiddelde GST ELISA-scores.

Donkerder groen vertegenwoordigt de sterkere relatieve binding. GST werd opgenomen als een controle voor niet-specifieke binding omdat het doeleiwit GST-gelabeld is. De ELISA-resultaten worden hier grafisch weergegeven.

De x-as vertegenwoordigt de UBL's en de y-as vertegenwoordigt de overeenkomstige genormaliseerde absorptie. Wanneer u deze procedure probeert, is het belangrijk dat u de oplossing niet in de plaat weggooit nadat u het zoutzuur hebt toegevoegd. De fagen hangen nu in oplossing en deze wilt u behouden zodat u latere verrijkingsanalyses of beide kunt uitvoeren.

Volgens deze procedure moet sequencing worden uitgevoerd om UBV-frequenties te bepalen. ELISA's en IC50-assays kunnen worden uitgevoerd om respectievelijk bindende werkzaamheid en remmende werkzaamheid te bepalen en ook om te helpen bepalen welke UIV's verder moeten worden gekarakteriseerd.