Faagdisplay gebruiken om ubiquitinevariatoren voor E3-ligases te ontwikkelen
August 27th, 2021
Ubiquitinatie is een kritisch eiwit posttranslationele modificatie, waarvan ontregeling is betrokken bij tal van menselijke ziekten. Dit protocol beschrijft hoe faagweergave kan worden gebruikt om nieuwe ubiquitinevarianten te isoleren die de activiteit van E3-ligases kunnen binden en moduleren die de specificiteit, efficiëntie en patronen van ubiquitinatie regelen.
Faagweergave helpt ons niet alleen de bindingskenmerken van klinisch belangrijke enzymen te onderzoeken, maar ontwikkelt ook modulatoren voor die enzymen en de bijbehorende ziekten. Faagweergave kan worden gebruikt om nieuwe bindmiddelen te ontwikkelen voor een breed scala aan doeleiwitten en is ook gemakkelijker uit te voeren dan andere conventionele weergavemethoden. Deze procedure omvatte veel repetitieve actie, dus de sleutel is om niet automatisch te werken en gedurende de hele tijd gefocust te blijven.
Begin met het inenten van 30 milliliter 2YT tetracycline bouillon met 200 microliter van de zaadcultuur. Incubeer het gedurende ongeveer drie uur bij 37 graden Celsius met 200 RPM orbitaal schudden totdat de bacteriën zich in de middenlogfase bevinden. Gooi de coatingoplossing van de plaat weg in een gootsteen.
Droog het voorzichtig af met keukenpapier. Voeg vervolgens 200 microliter PB-buffer toe aan elke gecoate put. Gooi de PB-buffer van het bord en droog deze op keukenpapier.
Voeg nog eens 200 microliter PB-buffer toe aan elke gecoate put van de plaat. Incubeer het bij kamertemperatuur gedurende een uur met 300 RPM orbitaal schudden. Ontdooi de faagbibliotheek op ijs en verdun deze vervolgens tot 100X de bibliotheekdiversiteit in PBS.
Voeg de polyethyleenglycolnatriumchlorideoplossing toe aan een vijfde van het verdunde bibliotheekvolume en incubeer de oplossing gedurende 30 minuten op ijs. Centrifugeer vervolgens de oplossing op 11.000 keer G gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Gooi het supernatant weg en centrifugeer het nog twee minuten om het resterende supernatant naar beneden te trekken en de faagkorrel te concentreren.
Resuspend de faagkorrel voorzichtig in één milliliter PBT-buffer per te analyseren doeleiwit, meestal vier in totaal. Voeg 100 microliter faagbibliotheek toe aan elke gecoate put in de controleplaat. Incubeer het bij kamertemperatuur gedurende een uur met 300 RPM orbitaal schudden.
Gooi de PB-buffer van de doelplaat in de gootsteen en droog de plaat op keukenpapier. Breng alle 100 microliter van de faagbibliotheek in de controleplaat over naar elke gecoate put van de doelplaat. Incubeer het bij kamertemperatuur gedurende een uur met 300 RPM orbitaal schudden.
Verwijder vervolgens de faagbibliotheek van de plaat en was de gecoate putten vier keer met PT-buffer. Keer de plaat om en tik op een papieren handdoek om de laatste druppels buffer te verwijderen. Voeg 100 microliter 0,1 molair zoutzuur toe aan elke gecoate put om de faag te elueren.
Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten met 300 RPM orbitaal schudden. Neutraliseer daarna de pH door 12,5 microliter pH 11 één molaire tris hydrochloride toe te voegen aan elke gecoate put. Breng de geëlueerde faag uit alle acht putten over in een enkele microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.
Pipetteer op en neer tijdens de overdracht om oplossingen homogeen te maken en alle vloeistof uit de putten op te zuigen. Voeg 10% BSA toe aan de geëlueerde faag om de uiteindelijke concentratie 1% te maken Bewaar de microcentrifugebuis bij vier graden Celsius. Dit is de ronde één uitgang.
Bereid een zaadcultuur voor voor het kweken van de faaginvoer voor de volgende selectieronde door vijf milliliter 2YT tetracycline-zaadkweek te enten met een geïsoleerde E.coli-kolonie uit een agarplaat. Incubeer het 's nachts bij 37 graden Celsius met 200 RPM orbitaal schudden. Verdun het doeleiwit in de rondes twee en drie buis met een geschikte hoeveelheid PBS.
Neem de helft van de inhoud van ronde twee en drie buis en dek vier putjes per doeleiwit in een 96-well bindingsplaat voor de volgende ronde. Gebruik vervolgens de helft van de round one-uitgang om drie milliliter mid-log fasecellen te enten. Incubeer het bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten met 200 RPM orbitaal schudden.
Voeg M13KO7 helperfaag toe aan een uiteindelijke concentratie van 10 miljard PFU per milliliter. Incubeer het opnieuw bij 37 graden Celsius gedurende een uur met 200 RPM orbitaal schudden. Breng na een uur de volledige drie milliliter cultuur over op 30 milliliter 2YT carbenicilline kanamycine-oplossing.
Groei 's nachts bij 37 graden Celsius met 200 RPM orbitaal schudden. De representatieve resultaten voor een selectie van ubiquitinevarianten tegen UBE4B worden hier weergegeven. UIV's werden besteld van de hoogste naar de laagste frequentie.
Sequenties vertegenwoordigen het gediversifieerde ubiquitinegebied in de UBV met alle gerandomiseerde residuen. De relatieve bindingsaffiniteit van de bindmiddelen aan het wildtype doeleiwit, gemuteerd doeleiwit en off-target eiwitten wordt gemeten door enzymgebonden immunosorbent assays of ELISA. Alle ELISA-absorpties werden genormaliseerd tegen 96 gemiddelde BSA ELISA-scores en 96 gemiddelde GST ELISA-scores.
Donkerder groen vertegenwoordigt de sterkere relatieve binding. GST werd opgenomen als een controle voor niet-specifieke binding omdat het doeleiwit GST-gelabeld is. De ELISA-resultaten worden hier grafisch weergegeven.
De x-as vertegenwoordigt de UBL's en de y-as vertegenwoordigt de overeenkomstige genormaliseerde absorptie. Wanneer u deze procedure probeert, is het belangrijk dat u de oplossing niet in de plaat weggooit nadat u het zoutzuur hebt toegevoegd. De fagen hangen nu in oplossing en deze wilt u behouden zodat u latere verrijkingsanalyses of beide kunt uitvoeren.
Volgens deze procedure moet sequencing worden uitgevoerd om UBV-frequenties te bepalen. ELISA's en IC50-assays kunnen worden uitgevoerd om respectievelijk bindende werkzaamheid en remmende werkzaamheid te bepalen en ook om te helpen bepalen welke UIV's verder moeten worden gekarakteriseerd.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel bespreekt het gebruik van faag-display om nieuwe ubiquitine-varianten te isoleren die E3-ligasen kunnen moduleren die betrokken zijn bij ubiquitinering. Ubiquinering is een cruciale post-translationele modificatie die verband houdt met verschillende menselijke ziekten.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biochemie
- Eiwittechniek
Achtergrond
- Ubiquinering is essentieel voor het reguleren van eiwitafbraak en cellulaire processen.
- Disregulatie van ubiquitinering wordt geassocieerd met talrijke ziekten.
- Faag-display is een krachtige techniek voor het ontdekken van eiwitinteracties.
- Deze methode maakt de ontwikkeling mogelijk van specifieke modulatoren voor enzymen.
Doel van studie
- Om nieuwe ubiquitine-varianten te isoleren met behulp van faag-display.
- Om te begrijpen hoe deze varianten de activiteit van E3-ligase kunnen beïnvloeden.
- Om de implicaties van ubiquitine-modulatie in ziektecontexten te verkennen.
Gebruikte methoden
- Inoculatie van bacterieculturen in 2YT tetracycline bouillon.
- Incubatie bij 37 graden Celsius met orbitaal schudden.
- Gebruik van faag-displaytechnieken voor bindingsonderzoeken.
- Isolatie en karakterisering van ubiquitine-varianten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van nieuwe ubiquitine-varianten.
- Aangetoonde bindingskarakteristieken naar E3-ligasen.
- Potentieel voor deze varianten om ubiquitineringspatronen te moduleren.
- Inzichten in de rol van ubiquitinering in ziektemechanismen.
Conclusies
- Faag-display is een effectieve methode voor het ontdekken van ubiquitine-varianten.
- Modulatie van E3-ligase-activiteit zou therapeutische implicaties kunnen hebben.
- Er is verder onderzoek nodig om de klinische toepassingen van deze bevindingen te verkennen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Phage display-driven engineering of ubiquitin variants (UbVs) enables precise modulation of E3 ligases, a critical inflection point for target validation in ubiquitin-proteasome system research. This approach enhances predictive confidence in early discovery by generating high-affinity, specific binders for mechanistic de-risking and functional interrogation of E3 ligase biology. The resulting UbVs support portfolio triage and prioritization by providing robust tools for downstream assay development and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of E3 ligase function using engineered UbVs with improved affinity and specificity.
- Supports biological de-risking by isolating variants that discriminate between wildtype and mutant or off-target proteins.
- Facilitates predictive confidence in target engagement and mechanistic studies through iterative selection and enrichment.
Screening & Assay Development
- Provides validated UbVs for use in ELISA and IC50 assays to quantify binding and inhibitory efficacy.
- Enables reproducible, quantitative assessment of UbV-target interactions across multiple rounds of selection.
- Supports assay standardization and scalability for reliable compound evaluation and screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns engineered UbVs with disease-relevant E3 ligases for translational biomarker studies when supported by downstream characterization.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by enabling further functional and inhibitory profiling of selected UbVs.
- Reduces mechanistic ambiguity in preclinical models by providing specific molecular tools for pathway interrogation.
Pipeline & Workflow Integration
This phage display platform integrates from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis testing and quantitative assay development for E3 ligase modulators.
- Discovery Biology: Iterative selection and enrichment clarify E3 ligase binding pathways and validate target engagement.
- Screening: ELISA and IC50 assays with UbVs deliver reproducible, quantitative outputs for downstream evaluation.
- Analytics: Sequencing and absorbance normalization enable robust comparison of UbV binding profiles and selection frequencies.
- Translational Research: Characterized UbVs can be advanced for further disease-relevant studies as supported by binding and inhibition data.
- Enterprise Reuse: The phage display workflow is adaptable for diverse E3 ligases and other protein targets, supporting platform scalability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in E3 ligase target validation.
- Operational Value: Standardizes binder selection and assay development for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of validated targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of E3 ligase modulators across discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in phage display, protein engineering, and quantitative binding assays.
- Demands access to bacterial culture, phage handling, and ELISA instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of selection, washing, and analytical protocols.
- Adaptable to various E3 ligases and target proteins with appropriate library design.
- Dependent on rigorous washing and selection to avoid enrichment of weak or promiscuous binders.
