Tumorinhoud verbeteren door tumormacrodissectie

Formaline-gefixeerde paraffine-ingebedde of FFPE-weefsels zijn vaak mengsels van tumor- en niet-tumormaterialen, waarbij de aanwezigheid van niet-tumormateriaal vaak ongewenst is en, indien aanwezig in een hoog percentage, de resultaten van genomische analyse aanzienlijk kan beïnvloeden, dus het belangrijkste voordeel van macrodissectie in vergelijking met het werken met niet-gereseceerde weefsels is dat de resulterende gedeparaffiniseerde gereseceerde weefselsecties kunnen worden verzameld voor RNA- en DNA-extractie, die vervolgens met vertrouwen kan worden gebruikt in downstream genomische analyse. Wetende dat de geëxtraheerde materialen zijn afgeleid van weefsels met een verhoogd tumorgehalte met minimale bijdragen van het besmetten van niet-tumorweefsels. De meerstappenworkflow van dit proces zal worden gedemonstreerd door Mr.Lee Wisner, Dr.Brandon Larsen en ikzelf Ter voorbereiding op weefselsecties presoak de paraffineblokken gedurende 10 tot 15 minuten op ijswater.

Het koelen van de blokken verhardt de was terwijl het water het weefsel bevochtigt, wat samen het snijden van het weefsel gemakkelijker maakt. Terwijl de blokken op ijs staan, labelt u de microscoopglaasjes op de juiste manier. Vul en verwarm het waterbad tot 39 graden Celsius en zet de microtoom op de gewenste snijdikte.

Laad het mes voorzichtig op de microtoom. Vergrendel het mes op zijn plaats en plaats de beschermkap totdat u klaar bent om te beginnen met het doorsnijden van de blokken. Terwijl de beschermkap op zijn plaats zit, plaatst u het FFPE-blok in de microtoomhouder.

Om te beginnen, sectie het blok langzaam totdat een volledige gezichtssectie is verkregen. Dit staat bekend als het onder ogen zien van het blok. Zodra dit is bereikt, kan het blok sneller in sectie zijn om een lint van secties te verkrijgen.

Eenmaal doorgeknipt, breng het lint van weefselsecties over naar het warmwaterbad. Gebruik een tang om een enkel weefselgedeelte van het lint te scheiden. Plaats hiervoor de achterkant van de gesloten gebogen tang bij het gewricht tussen de twee secties en laat de tang voorzichtig openen om de secties te scheiden.

Verzamel het geïsoleerde weefselgedeelte op een microscoopglaasje. Om te voorkomen dat bellen vast komen te zitten, plaatst u de microscoopglaasje schuin in het water. Schud de glijbaan voorzichtig om overtollig water te verwijderen voordat u het op het rek plaatst om aan de lucht te drogen.

Eenmaal droog, selecteert u ten minste een van de vers gesneden weefselsecties voor hematoxyline- en eosinekleuring, ook bekend als H en E.Eenmaal gekleurd, dient u de H- en E-dia in voor pathologiebeoordeling. Tijdens pathologiebeoordeling beoordeelt een deskundige patholoog de H- en E-vlekglaasjes om te bepalen waar het weefsel van belang in elk weefsel ligt. De patholoog beoordeelt eerst het hele weefsel om te bepalen waar de weefsels van belang zich in het weefsel bevinden.

Zodra de eerste histologie en morfologische beoordeling is voltooid, gebruikt de patholoog een diamarkeringspen om aantekeningen te maken bij elke H- en E-gekleurde dia. Met behulp van de marker tekent de patholoog een cirkel rond het weefsel van belang, met uitzondering van het weefsel dat niet van belang is. Dit beoordelingsproces wordt vervolgens herhaald voor alle H- en E-gebeitste dia's in het project.

Stel de werkruimte voor de macrodissectiebank in waarmee elk monster sequentieel en efficiënt kan worden verwerkt. Voor elk monster moeten de pathologisch beoordeelde H en E, de overeenkomstige niet-gekleurde op de dia gemonteerde weefselsecties en de vooraf gelabelde microbuizen met de digestiebuffer voor weefselverzameling bij de hand zijn. Laad de niet-gebeitste glijders in een rek en ga naar de zuurkast voor deparaffinisatie.

Deparaffiniseer de dia's door de dia's onder te dompelen in twee opeenvolgende wasbeurten van onverdund D-limoneen of CitriSolv, gevolgd door een laatste wasbeurt in 100% ethanol gedurende twee minuten per wasbeurt. Roer aan het begin van elke wasbeurt de was voorzichtig gedurende ongeveer vijf tot 10 seconden. Om overdracht tussen wasbeurten te minimaliseren, laat u de dia's kort uitlekken en dept u het rek op het keukenpapier.

Na de drie wasbeurten zijn de weefsels nu goed zichtbaar op de microscoopglaasjes. Laat de dia's 10 minuten aan de lucht drogen. Eenmaal droog, worden de H en E vervolgens met de voorkant naar beneden op de bank geplaatst en het gedeparaffineerde weefsel bovenop geplaatst, ook met het gezicht naar beneden, het geparaffineerde weefsel op één lijn met de H en E.Eenmaal correct uitgelijnd, wordt het tumorgebied gemarkeerd door de patholoog op de H en E getraceerd op de achterkant van de geparaffiniseerde weefselsectieschuif.

De nu gemarkeerde niet-gekleurde dia's zijn gedoopt in een 3% glyceroloplossing om statische en hulp bij het verzamelen van weefsel te minimaliseren. Verwijder de gedompelde dia's langzaam om de hoeveelheid glyceroloplossing die zich vastklampt aan de gedompelde dia te minimaliseren. Eenmaal verwijderd, veegt u de achterkant van de dia en eventuele weefselvrije gebieden aan de voorkant van de dia schoon om overtollige glycerol te verwijderen.

Vervolgens, met behulp van een schoon mes, traceer de pathologiemarkeringen met het mes om de verbinding tussen het weefsel van belang en de rest van het weefsel te verbreken. Opmerkend dat deze stap kan worden uitgevoerd voorafgaand aan glyceroldippen, vooral als de pathologische markeringen complex zijn, omdat het snijden van droog weefsel gemakkelijker kan zijn en ook het risico op weefselweerstand kan minimaliseren. Het weefsel buiten de pathologiemarkeringen is niet van belang.

Deze worden verwijderd met behulp van de platte rand van het blad, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de hoek van het blad de buitenkant van de pathologiemarkeringen haakt. Zodra het ongewenste weefsel is verwijderd, wordt een nieuw mes gebruikt om het weefsel van belang te verzamelen. Het verzamelde weefsel wordt vervolgens uit het blad verwijderd met behulp van het platte uiteinde van een houten stok en vervolgens overgebracht in een vooraf gelabelde microbuis met spijsverteringsbuffer, waardoor macrodissectie-gemedieerde tumorweefselverrijking wordt voltooid, die nu klaar zijn voor nucleïnezuurextractie.

Om aan te tonen hoe macrodissectie de downstream genomische analyse kan beïnvloeden, werden weefselsecties van vijf diffuse grote B-cellymfomen, of DLBCL, met verschillende tumorinhouden macro-ontleed of niet macro-ontleed. Nucleïnezuurextracties werden uitgevoerd op de verzamelde weefsels en het resulterende RNA onderzocht met behulp van de DLBCL90 digitale genexpressieprofileringstest, die ook bekend staat als de double-hit signature assay. DLBCL bestaat uit drie verschillende moleculaire subtypen, namelijk GCB, ABC, en hun intermediaire subtype aangeduid als niet-geclassificeerd, dat kan worden bepaald met behulp van de DLBCL90-test.

Deze test is ook in staat om DLBCL-tumoren te identificeren die double-hit translocaties herbergen waarbij het BCL2-gen betrokken is. De DLBCL 90 resultaten zijn weergegeven in deze tabel. Macro-ontlede monsters werden twee keer uitgevoerd.

Eenmaal met behulp van hun RNA-voorraadconcentratie en eenmaal met behulp van de RNA-voorraad verdund om overeen te komen met de concentratie van hun respectieve niet-macro-ontleedde tegenhangers. De resultaten tonen aan dat macrodissectie resulteerde in subtype- of double-hit call-veranderingen in drie van de vijf monsters. Macrodissectie van monster A had geen effect op de subtype-aanroep, maar veranderde de dubbele hit-oproep van negatief naar niet-geclassificeerd, en deze verandering werd waargenomen ongeacht de macro-ontleed monster-RNA-invoer.

Macrodissectie van monster C had daarentegen geen effect op de double-hit call, maar veranderde de subtype-aanroep van GCB in niet-geclassificeerd, wat ook werd waargenomen ongeacht de macro-ontleed RNA-input van het monster. Net als bij voorbeeld A had macrodissectie van monster E geen effect op de subtypeaanroep, maar veranderde de dubbele hit-oproep. Voor monster E veranderde de aanroep echter van niet-geclassificeerd in negatief, en opnieuw deed dit ongeacht de macro-ontleedde monster-RNA-invoer.

Met name deze oproep veranderd in double-hit negatief is biologisch logisch gezien het feit dat monster E ABC bleek te zijn en double-hit translocaties met BCL2 zijn gemeld om uitsluitend te worden waargenomen in GCB-tumoren. Samen benadrukken deze resultaten het belang van tumorzuiverheid en genomische assays en macrodissectie als een betrouwbaar hulpmiddel om dit te bereiken. Na het bekijken van deze video zou u een beter begrip moeten hebben van wat macrodissectie is, het belang van pathologische beoordeling en de studievoordelen die worden verkregen door macrodissectie op te nemen in uw weefselverwerkingsworkflow.