Name: Plaquing van Herpes Simplex Virussen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: Leer het plaquing-protocol voor herpes simplex virussen om virale titers betrouwbaar te kwantificeren. Deze methode biedt inzicht in de effectiviteit van antivirale behandelingen en vereist zorgvuldige uitvoering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken talloze studenten in onze laboratoria (PJD en BJM) die in de loop der jaren met ons hebben samengewerkt om deze methoden te verfijnen. Een speciale dank aan Stan Person, onder wiens voogdij deze methodologie voor het eerst werd ontwikkeld. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het Towson University Fisher College of Science and Math Undergraduate Research Support fund en NIGMS Bridges to the Baccalaureate grant 5R25GM058264. Deze inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health.

Alle procedures met de Vero-cellen en levende herpesvirussen zijn goedgekeurd door het Towson University Institutional Biosafety Committee. Een algemeen schema van deze procedures is weergegeven in figuur 1.
1. Zaaien van de Vero-cellen
<ol><li>De dag voordat de plaquetest wordt gestart, trypsiniseren Vero-cellen en resuspenderen ze in reguliere Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) en supplement volgens de standaard celkweekmethodologie19. Resuspend de trypsinized cellen in 10 ml DMEM per T-75 kolf van de confluent Vero-cellen (~ 107 cellen). OPMERKING: DMEM wordt gebruikt voor plaque-assays in plaats van alfa-MEM omdat het de celgroeisnelheid enigszins vertraagt en betere plaque-assayresultaten bevordert.</li>
	<li>Tel de cellen volgens de voorkeursmethode (bijvoorbeeld een standaard hemocytometer met Trypan Blue-uitsluiting)19.</li>
	<li>Zaai de cellen op 4 x 106 cellen/plaat; gebruik voor HSV-2 6-putplaten met 2,5 ml DMEM (met supplementen) per put; en gebruik voor HSV-1 12-putplaten met 1,25 ml DMEM (met supplementen) per put. OPMERKING: Het aantal cellen moet constant zijn, ongeacht de gebruikte plaat, hoewel de grootte van de putten van belang is voor de nauwkeurigheid in de plaquetest. Het is essentieel om cellen gelijkmatig te verdelen, wat het meest effectief kan worden bereikt door de plaat heen en weer te bewegen, niet op een cirkelvormige manier.</li>
	<li>Laat de cellen een nacht groeien bij 37 °C/5% CO2 in een bevochtigde incubator. OPMERKING: Vochtigheid wordt gehandhaafd met een pan gedestilleerd water met een algicide in de bodem van de incubator.</li>
</ol>2. Monsterverdunning
<ol><li>Voltooi de monsterverdunning en de toevoeging van virus aan cellen in één laboratoriumsessie. LET OP: HSV-1 en -2 zijn besmettelijk voor de mens en moeten worden behandeld onder de juiste bioveiligheidsinsluiting (BSL-2). Houd alle materialen die in contact komen met het virus gescheiden en desinfecteer met een quaternair middel bij 1/256 verdunning (zie Materialentabel), jodofor, bleekmiddel of sterk ionisch reinigingsmiddel (bijv. SDS) voordat u ze uit de bioveiligheidskast verwijdert.</li>
	<li>De dag na het zaaien van de Vero-cellen, verdun elk virusmonster serieel om te worden geplakt in 1x PBS; gebruik meestal 10-voudige verdunningen voor de meest nauwkeurige tracking.</li>
	<li>Voer deze verdunningen uit via 10-4 (voor lage concentraties virussen) of via 10-9 (voor de verwachting van hogere titermonsters) waarbij ten minste 1 ml van elk monster overblijft voor de plaquetest zelf.</li>
	<li>Bewaar alle virale verdunningen op ijs (niet langer dan 1 uur) totdat ze klaar zijn om deze verdunde virusmonsters aan de cellen toe te voegen.</li>
</ol>3. Toevoeging van virus aan de cellen
<ol><li>Verwijder het celkweekmedium uit een of twee putjes met een pipet. OPMERKING: Gebruik geen aspirator omdat deze te veel vloeistof uit de celmonolaag verwijdert en de cellen uitdroogt. Een cruciale overweging is ervoor te zorgen dat de celmonolaag gedurende de hele duur van het experiment gehydrateerd blijft. Als de cellen uitdrogen, spoelen ze in de laatste stap de plaat af en genereren ze onbruikbare gegevens. Verwerk daarom slechts één of twee putten tegelijk om deze mogelijkheid te verminderen.</li>
	<li>Voeg voorzichtig het verdunde virusmonster toe (100-400 μL en 50-200 μL virusmonster worden gebruikt voor respectievelijk 6-well en 12-well platen) druppelsgewijs aan elke monolaag, waarbij de druppels langs de zijkant van elke put worden toegevoegd. Herhaal het proces voor elke één of twee putten totdat de hele plaat is gevuld met de virusmonsters die worden geplakt. OPMERKING: Het toevoegen van de druppels aan het midden van de put kan per ongeluk cellen van het substraat verwijderen.</li>
	<li>Wieg de hele plaat voorzichtig met de hand om ervoor te zorgen dat de PBS die het virus bevat de hele monolaag van cellen in elke put bedekt en plaats de plaat vervolgens in een CO2-incubator bij 37 ° C om het virus te laten adsorberen.</li>
	<li>Verwijder elke 10 minuten binnen 1 uur de plaat uit de couveuse, schommel hem voorzichtig opnieuw om het virus gelijkmatiger over elke put te verspreiden en plaats hem vervolgens terug in de couveuse. OPMERKING: Elk experiment bepaalt het aantal replicaties en welke verdunningen worden gebruikt; de voorkeur van de lezer dicteert die beslissing.</li>
	<li>Om de mogelijkheid te verkleinen om per ongeluk niet-geabsorbeerd entmateriaal te tellen, verwijdert u het virusmonster uit de putten met 1000 μL pipetpunten en plaatst u het in een afvalbeker. OPMERKING: Nogmaals, deze procedure wordt uitgevoerd met slechts één of twee putten tegelijk om de hydratatie van de celmonolaag te behouden.</li>
	<li>Plaats 2,5 ml van een methylcellulose-overlay (los 5% methylcellulose w/w op in 100 ml PBS, autoclaaf gedurende 15 minuten bij 121 °C en 15 psi in een vloeibare cyclus en voeg vervolgens 375 ml DMEM plus 25 ml FBS toe).</li>
	<li>Zodra een hele plaat overlay bevat, plaatst u de plaat terug in de incubator om twee dagen groei mogelijk te maken. OPMERKING: Als het virus en de cellen drie dagen mogen groeien, zelfs in DMEM plus supplementen, kan een aanzienlijk verlies van cellen in de monolaag het gevolg zijn, waardoor de uiteindelijke gegevens in gevaar komen.</li>
	<li>Desinfecteer het afvalbeker, meestal met de toevoeging van bleekmiddel, een jodofor of een vergelijkbaar virucide, voordat u het uit de bioveiligheidskast verwijdert.</li>
</ol>4. Kleuring voor plaques
<ol><li>Verwijder na de incubatietijd van twee dagen de methylcellulose-overlay met een pipet, opnieuw één of twee putten tegelijk, en plaats deze in een afvalbeker.</li>
	<li>Voeg ~ 2 ml 1% kristalviolet (zie tabel met materialen) in 50% ethanol toe aan elke put om de plaques te kleuren. OPMERKING: Het is niet essentieel om elke laatste druppel van de overlay te verwijderen.</li>
	<li>Incubeer de plaat met alle putjes gevuld met de vlek gedurende 30 min bij 37 °C. Desinfecteer op dit punt het bekerglas zoals hierboven beschreven in stap 3.8.</li>
	<li>Was de borden krachtig met kraanwater totdat de afvoer helder is. OPMERKING: Een zachte stroom water is niet krachtig genoeg; volledige druk van een laboratorium gootsteen armatuur is vereist.</li>
	<li>Zorg er op dit punt voor dat er ongeveer 10-voudige verschillen zijn in het aantal plaques in elke verdunningsreeks.</li>
	<li>Laat de platen een nacht ondersteboven drogen, waarna de afzonderlijke plaques kunnen worden geteld.</li>
</ol>5. Plaques tellen en virustiter bepalen
<ol><li>Ongeacht de benadering (zie OPMERKING hieronder), vermenigvuldig het aantal plaques met de verdunningsfactor (bijvoorbeeld als de plaques werden geteld in de put van 10-4 , zou het aantal plaques worden vermenigvuldigd met 104). OPMERKING: Hoewel tellen binnen een bereik van 10-100 plaques nuttig is5, is het tellen van putten met 30-300 plaques iets betrouwbaarder en houdt rekening met ongeveer 1/2-log verdunningen in plaats van full-log verdunningen.</li>
	<li>Deel dit aantal door het volume entmateriaal (zoals hierboven in stap 3.2) en gemiddelde alle putten met plaques binnen het aangegeven bereik om de meest nauwkeurige titer van HSV in het oorspronkelijke monster te krijgen.</li>
	<li>Voer de berekeningen uit in stap 5.3.1 tot en met 5.3.5, rekening houdend met het gebruik van mock-gegevens in tabel 1.<ol>
<li>Overweeg alleen putten met 30-300 plaques (stap 5.1). Gebruik daarom in tabel 1 alleen de kolom 10-5 voor replicaties 1, 2 en 3.</li>
		<li>Neem het aantal plaques bij de gegeven verdunning en vermenigvuldig met de reciproke van de verdunningsfactor. Vandaar dat de 10-5 kolom van monster 1 van 81 plaques bij de 10-5 verdunning naar 81 plaques maal 105 gaat.</li>
		<li>Deel dat getal vervolgens door het volume (in ml) van de virusverdunning die aan de cellen in die put is toegevoegd. Ervan uitgaande dat de gegevens over HSV-1 in tabel 1 afkomstig zijn van een plaat met 12 putten, zou 0,2 ml de meest geschikte meting zijn. Vandaar dat de berekening van stap 5.3.2 81 x 105 gedeeld door 0,2 ml, of 4,0 x 107 PFU / ml HSV-1 wordt.</li>
		<li>Herhaal dit proces voor alle nuttige gegevens en het gemiddelde. Voer daarom de berekening in 5.3.2-5.3.3 uit op alle monsters in de kolom 10-5 , ervan uitgaande dat ze afkomstig zijn van hetzelfde virusmonster en de biologische replicaties zijn uitgevoerd om de meest nauwkeurige titermeting te verkrijgen. In het geval van tabel 1, gemiddeld 4,0 x 107, 2,1 x 107 en 2,6 x 107 PFU/ml om een uiteindelijke gemiddelde titer van 2,9 x 107 ± 0,98 x 107 PFU/ml voor dit monster te verkrijgen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Dimmock, N., Easton, A., Leppard, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDimmock%2C+N+%22Introduction+to+Moden+Virology.+6th+end%22">Introduction to Moden Virology. 6th end</a>. , Wiley-Blackwell. (2007).</li>
<li>Mahy, B., Collier, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMahy%2C+B+%22Topley+and+Wilson%27s+Microbiology+and+Microbial+Infections.+9th+edn%22">Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections. 9th edn</a>. 1, Arnold. (1998).</li>
<li>Anderson, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+bacteriophage+particles%3A+Comparative+analysis+of+the+traditional+plaque+assay+and+real-time+QPCR-+and+nanosight-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Bacteriophage%22%5BJournal%5D)">Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays.</a> Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).</li>
<li>Earle, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+malignancy+in+vitro%3B+IV.+The+mouse+fibroblast+cultures+and+changes+seen+in+the+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Production of malignancy in vitro; IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells.</a> Journal of the National Cancer Institute. 4 (2), 165-212 (1943).</li>
<li>Dulbecco, R., Vogt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+problems+of+animal+virology+as+studied+by+the+plaque+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">Some problems of animal virology as studied by the plaque technique.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18, 273-279 (1953).</li>
<li>Enders, J. F., Weller, T. H., Robbins, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+the+lansing+strain+of+poliomyelitis+virus+in+cultures+of+various+human+embryonic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cultivation of the lansing strain of poliomyelitis virus in cultures of various human embryonic tissues.</a> Science. 109 (2822), 85-87 (1949).</li>
<li>Enders, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytopathology+of+virus+infections%3A+particular+reference+to+tissue+culture+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cytopathology of virus infections: particular reference to tissue culture studies.</a> Annual Review of Microbiology. 8, 473-502 (1954).</li>
<li>Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoizman%2C+B+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., et al. 1, Wolters Kluwer-Lippincott Williams & Wilkins. 1823-1897 (2013).</li>
<li>Madavaraju, K., Koganti, R., Volety, I., Yadavalli, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+cell+entry+mechanisms%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus cell entry mechanisms: An update.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 617578(2020).</li>
<li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plaque+assay+of+animal+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Virus+Research%22%5BJournal%5D)">The plaque assay of animal viruses.</a> Advances in Virus Research. 8, 319-378 (1961).</li>
<li>Farnham, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+of+microscopic+plaques+by+herpes+simplex+virus+in+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The formation of microscopic plaques by herpes simplex virus in HeLa cells.</a> Virology. 6 (2), 317-327 (1958).</li>
<li>Garabedian, G. A., Scott, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plaque+assay+for+herpes+simplex+virus+in+L-929+%28Earle%29+mouse+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+for+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Plaque assay for herpes simplex virus in L-929 (Earle) mouse fibroblasts.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 126 (2), 568-571 (1967).</li>
<li>Lancz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+viruses+types+1+and+2.+Type+and+strain+specific+characteristics+affecting+virus+plaque+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Gesamte+Virusforsch%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex viruses types 1 and 2. Type and strain specific characteristics affecting virus plaque formation.</a> Arch Gesamte Virusforsch. 46 (1-2), 36-43 (1974).</li>
<li>Muratore, O., Tonoli, E. L., Pesce Schito, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short-term+plaque+assay+for+antiviral+drug+research+on+herpes+simplex+virus+type+2%5BTitle%5D)+AND+%22New+Microbiologica%22%5BJournal%5D)">A short-term plaque assay for antiviral drug research on herpes simplex virus type 2.</a> New Microbiologica. 19 (3), 257-261 (1996).</li>
<li>Sato, S., Kaneki, H., Shirai, J., Takahashi, K., Kawana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+herpes+simplex+virus+types+1+and+2+by+plaque+appearances+on+semicontinuous+rabbit+lens+epithelial+cells+in+the+clinical+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Kansenshogaku+Zasshi%22%5BJournal%5D)">Differentiation of herpes simplex virus types 1 and 2 by plaque appearances on semicontinuous rabbit lens epithelial cells in the clinical laboratory.</a> Kansenshogaku Zasshi. 67 (6), 561-573 (1993).</li>
<li>Yazaki, S., Taniguchi, S., Yoshino, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+the+plaque+assay+of+herpes+simplex+virus+in+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Jouranl+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Improvement of the plaque assay of herpes simplex virus in HeLa cells.</a> Japanese Jouranl of Microbiology. 10 (3), 133-139 (1966).</li>
<li>Stanners, C. P., Eliceiri, G. L., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+types+of+ribosome+in+mouse-hamster+hybrid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+New+Biology%22%5BJournal%5D)">Two types of ribosome in mouse-hamster hybrid cells.</a> Nature New Biology. 230 (10), 52-54 (1971).</li>
<li>Giannasca, N. J., Suon, J. S., Evans, A. C., Margulies, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-based+controlled+release+delivery+of+acyclovir+from+poly-%28ethylene+co-vinyl+acetate%29+rings%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Drug+Delivery+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Matrix-based controlled release delivery of acyclovir from poly-(ethylene co-vinyl acetate) rings.</a> Journal of Drug Delivery Science and Technology. 55, 101391(2020).</li>
<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreshney%2C+RI+%22Culture+of+Animal+Cells%3A+A+Manual+of+Basic+Technique+and+Specialized+Applications.+7th+edn%22">Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. 7th edn</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2016).</li>
<li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+plaques+in+monolayer+tissue+cultures+by+single+particles+of+an+animal+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus.</a> Proceedings of the National Academy of Science, USA. 38 (8), 747-752 (1952).</li>
<li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+concentration+determination+through+plaque+assays%3A+using+traditional+and+novel+overlay+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52065(2014).</li>
<li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virology Journal. 3, 63(2006).</li>
<li>Culley, S., Towers, G. J., Selwood, D. L., Henriques, R., Grove, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+counter%3A+Automated+quantification+of+in+vitro+virus+replication+by+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Infection counter: Automated quantification of in vitro virus replication by fluorescence microscopy.</a> Viruses. 8 (7), 201(2016).</li>
<li>Hudu, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Hepatitis+B+e+antigen%3A+A+better+predictor+of+Hepatitis+B+virus+DNA+than+quantitative+Hepatitis+B+surface+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Laboratory%22%5BJournal%5D)">Quantitative Hepatitis B e antigen: A better predictor of Hepatitis B virus DNA than quantitative Hepatitis B surface antigen.</a> Clinical Laboratory. 64 (4), 443-449 (2018).</li>
<li>Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-dependent+DNA+polymerase+in+virions+of+RNA+tumour+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses.</a> Nature. 226 (5252), 1209-1211 (1970).</li>
<li>Scolnick, E. M., Aaronson, S. A., Todaro, G. J., Parks, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+dependent+DNA+polymerase+activity+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA dependent DNA polymerase activity in mammalian cells.</a> Nature. 229 (5283), 318-321 (1971).</li>
<li>Strick, L. B., Wald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostics+for+herpes+simplex+virus%3A+is+PCR+the+new+gold+standard%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Diagnosis+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Diagnostics for herpes simplex virus: is PCR the new gold standard.</a> Molecular Diagnosis and Therapy. 10 (1), 17-28 (2006).</li>
<li>Ramakrishnan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+50%25+endpoint+titer+using+a+simple+formula%5BTitle%5D)+AND+%22World+Jouranl+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Determination of 50% endpoint titer using a simple formula.</a> World Jouranl of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).</li>
<li>Kärber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beitrag+zue+kollektiven+Behandlung+pharmakologischer+pharmakologischer+Reihenversuche%5BTitle%5D)+AND+%22Archiv+for+Experimentelle+Pathologie+und+Pharmakologie%22%5BJournal%5D)">Beitrag zue kollektiven Behandlung pharmakologischer pharmakologischer Reihenversuche.</a> Archiv for Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 162 (4), 480-487 (1931).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hygiene%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27 (3), 493-497 (1938).</li>
<li>Spearman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Method+of+%27Right+and+Wrong+Cases%27+%28Constant+Stimuli%29+without+Gauss%27s+formula%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Psychology%22%5BJournal%5D)">The Method of 'Right and Wrong Cases' (Constant Stimuli) without Gauss's formula.</a> British Journal of Psychology. 2 (3), 227-242 (1908).</li>
<li>Ryu, W. -S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRyu%2C+W-S+%22Molecular+Virology+of+Human+Pathogenic+Viruses.+1st+edn%22">Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. 1st edn</a>. , Academic Press. (2017).</li>
<li>Burrill, C. P., Strings, V. R., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poliovirus%3A+generation%2C+quantification%2C+propagation%2C+purification%2C+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Poliovirus: generation, quantification, propagation, purification, and storage.</a> Current Protocols in Microbiology. , Chapter 15 Unit 15H 11 (2013).</li>
<li>Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yanguez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+and+titration+of+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Propagation and titration of influenza viruses.</a> Methods in Molecular Biology. 1836, 59-88 (2018).</li>
<li>Baz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+isolation%2C+purification%2C+and+titration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Zika virus isolation, purification, and titration.</a> Methods in Molecular Biology. 2142, 9-22 (2020).</li>
<li>Coleman, C. M., Frieman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+quantification+of+MERS-CoV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Growth and quantification of MERS-CoV infection.</a> Current Protocols in Microbiology. 37 (1), 1-9 (2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.

Hoewel plaque-assays bijna net zo oud zijn als zoogdiercelkweek zelf, lijkt het erop dat elk laboratorium zijn eigen set protocollen heeft om deze basistest uit te voeren5,6,10,11,12,13,14,15,16,20<sup class="xr...

Het begin van virus plaque assays gaan terug tot de eerste ontdekkingen van virussen in de jaren 18901. Tabaksmozaïekvirus werd voor het eerst geïsoleerd en doorgegeven op tabaksbladeren, waar individuele infectieplekken konden worden herkend en gekwantificeerd als afkomstig van een enkele, levende virusentiteit2, later geïdentificeerd als een virion2. Latere baanbrekende studies met bacteriën en bacteriofagen perfectioneerden de technieken die werden gebruikt om deze virussen te plaqueren, waaronder bacteriën in de mid-log fase van groei, seriële verdunning van bacteriofaagmonsters en top agar met daaropvolgende visualisatie van letterlijke gaten (plaques genoemd) in het bacteriële gazon3.
Plaquing van dierlijke virussen bleef achter bij het opwindende onderzoek dat werd uitgevoerd met bacteriofagen, vooral omdat de methoden die nodig zijn voor het kweken van zoogdiercellen in cultuur pas in de jaren 19404 werden ontwikkeld. De komst van groeiende muizencellen in afwezigheid van het hele gastheerorganisme4 bracht echter een nieuw tijdperk voort in het vermogen om virussen te kweken en te tellen. Dergelijk werk werd uitgebreid voor de verspreiding en kwantificering van western equine encefalomyelitisvirus in kippencellen en poliovirus in menselijke cellen5,6. Naarmate het rijk van kweekbare zoogdiercellen zich uitbreidde, gaf de schare van verschillende gastheercellen voor verschillende virale infecties de wereld een overvloed aan mogelijkheden om allerlei soorten virussen te bestuderen7. Dit omvatte de verspreiding en kwantificering van menselijke herpesvirussen, met name herpes simplex virus-1 (HSV-1) en -2 (HSV-2), die mucocutane laesies veroorzaken8. Belangrijk is dat alle plaque-assays afhankelijk zijn van het bestaan van levende virionen, die gastheercellen op een receptorgemedieerde manier in een monster kunnen binnendringen9. Ongeacht de alomtegenwoordigheid en veelheid aan publicaties over de uitvoering van plaque-assays5,10,11,12,13,14,15,16, zijn deze methoden voor HSV-1/-2 een mix van zowel kunst als wetenschap; men kan de test niet uitvoeren zonder de juiste aandacht voor elk detail in het protocol, noch kan men een succesvolle test uitvoeren zonder een kritisch oog voor subtiliteit in het proces. Dit manuscript toont een van de meest consistent reproduceerbare methoden voor HSV-1 /-2 plaque-assays, met nauwkeurige details over de kunst van de assay die zelden worden besproken.
Dit huidige protocol verkrijgt op betrouwbare wijze live plaquevormende eenheden (PFU) tellingen voor HSV-1 en -2. De beste resultaten worden verkregen met behulp van Vero-cellen (getransformeerde Afrikaanse groene apennierepitheelcellen) bij lage passage (onder passagenummer 155) en routinematig gekweekt in alfa-MEM17 aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS), L-alanyl-L-glutamine en een antibioticum / antimycotisch mengsel18. Vero-cellen worden standaard twee tot drie keer per week in dit medium vermeerderd bij een verdunning van 1/5 telkens.

<table><tbody><tr><td>12-wells platen</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>6-wells platen</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Alpha-MEM</td><td>Lonza</td><td>12169F</td><td></td></tr><tr><td>Antibioticum/antimyoticum</td><td>Gibco</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Kristal violet</td><td>Alfa Aesar</td><td>B2193214</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS (geen Mg++ of Ca++)</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal runder serum</td><td>Millipore-Sigma</td><td>TMS-013-B</td><td></td></tr><tr><td>L-alanyl-L-glutamine (Glutamax)</td><td>Gibco</td><td>GS07F161BA</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>02-671-54</td><td></td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Millipore-Sigma</td><td>27-441-0</td><td></td></tr><tr><td>Kwartair middel (Lysol I.C.)</td><td>Thermo Fisher</td><td>NC9645698</td><td></td></tr><tr><td>Trypaanblauw</td><td>Corning</td><td>25900CI</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Cytiva</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr><tr><td>Vero cellen</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td></td></tr></tbody></table>

plaquing van herpes simplex virussen

Plaquing of Herpes Simplex Viruses

Er zijn tal van gepubliceerde protocollen voor het plaquen van virussen, inclusief verwijzingen in de primaire literatuur voor methodologie. Het paaien van virussen kan echter moeilijk uit te voeren zijn, waardoor de nadruk moet worden gelegd op de specificaties en verfijning ervan. Het is een ongelooflijk uitdagende methode voor nieuwe studenten om onder de knie te krijgen, vooral omdat het nauwgezette aandacht vereist voor de meest minuscule details. Deze demonstratie van het plaquen van herpes simplex-virussen zou degenen moeten helpen die in de loop der jaren hebben geworsteld met het visualiseren van de methode, vooral de nuances ervan. Hoewel dit manuscript is gebaseerd op dezelfde principes van de standaard plaquing-methodologie, verschilt het in die zin dat het een gedetailleerde beschrijving bevat van (1) hoe gastheercellen het beste kunnen worden behandeld om verstoring tijdens het proces te voorkomen, (2) een nuttiger viskeus medium dan agarose om de diffusie van virionen te beperken, en (3) een eenvoudige fixatie- en kleuringsprocedure die betrouwbaar reproduceerbare resultaten oplevert. Bovendien helpt de bijbehorende video de fijnere onderscheidingen in het proces te demonstreren, die vaak worden gemist bij het instrueren van anderen over het uitvoeren van plaque-assays.

Tabel 1 toont een experiment dat optimale resultaten heeft. Alle 10-voudige verdunningen volgen op een ongeveer 10-voudige afname van het aantal plaques. Dit soort gegevens zijn ook te zien in figuur 2, een werkelijke plaquetest waarbij het telbare aantal plaques in het bereik van 10-4 viel voor alle drie de replicaties. Hetzelfde is te zien in figuur 3, de bovenste rij, waar het telbare aantal plaques zich in de 10-3 verdunning<...

Plaquing is een routinemethode die wordt gebruikt om levende virussen in een populatie te kwantificeren. Hoewel plaquing vaak wordt onderwezen in verschillende microbiologische curricula met bacteriën en bacteriofagen, is het plaquenten van zoogdiervirussen complexer en tijdrovender. Dit protocol beschrijft de procedures die betrouwbaar functioneren voor regelmatig werk met herpes simplex-virussen.

Plaquing van Herpes Simplex Virussen

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can ...

Het protocol helpt de studenten individuele infecties duidelijk te identificeren en de test gemakkelijk uit te voeren, waardoor het efficiënter wordt om virale titer te kwantificeren. Dit protocol bevat een eenvoudige fixatie- en kleuringsprocedure die betrouwbare en reproduceerbare resultaten oplevert. Deze methode kan inzicht geven in de nauwkeurigheid en effectiviteit van antivirale behandelingen tegen ziekten.De moeilijkere hindernissen van dit plaquingprotocol zijn de celtellingen voor zaaiplaten, die ervoor zorgen dat de cellen niet overvol raken, uitdrogen of krassen krijgen tijdens het proces. Men kan ook moeilijkheden ondervinden bij de algehele nauwgezetheid van dit protocol. De praktijk levert echter een belangrijke bijdrage aan het succes van dit experiment.Voltooi om te beginnen de monsterverdunning in de toevoeging van virus aan cellen in één laboratoriumsessie. Verdun elk virusmonster dat in PBS wordt geplakt serieel. Gebruik meestal 10-voudige verdunningen voor de meest nauwkeurige tracking.Bewaar alle virale verdunningen op ijs totdat ze klaar zijn om deze verdunde virusmonsters aan de cellen toe te voegen. Verwijder het celkweekmedium uit een of twee putjes met een pipet. Voeg het verdunde virusmonster voorzichtig druppelsgewijs toe aan elke monolaag cellen druppelsgewijs door de zijkant van elke put.Herhaal het proces voor elke één of twee putten totdat de hele plaat is gevuld met de virusmonsters die worden geplakt. Wieg het hele bord voorzichtig met de hand. Incubeer vervolgens de plaat bij 37 graden Celsius gedurende een uur om de virusadsorptie mogelijk te maken.Verwijder na elke 10 minuten de plaat uit de couveuse, schommel hem voorzichtig opnieuw om het virus gelijkmatiger over elke put te verspreiden en plaats hem vervolgens terug in de couveuse. Om de mogelijkheid te verkleinen dat niet-geabsorbeerd entmateriaal per ongeluk wordt geteld, verwijdert u het virusmonster uit de putten met behulp van een pipetpunt van 1000 microliter en gooit u het monster weg in een afvalbeker. Plaats 2,5 milliliter van een methylcellulose-overlay op de plaat en plaats deze terug in de incubator.Desinfecteer het afvalbeker, meestal met de toevoeging van bleekmiddel, een jodofor of een vergelijkbaar virucide, voordat u het uit de bioveiligheidskast verwijdert. Verwijder na de incubatietijd van twee dagen de methylcellulose-overlay uit een of twee putten tegelijk met behulp van een pipet en plaats deze in een afvalbeker. Voeg ongeveer twee milliliter 1% kristalviolet in 50% ethanol toe aan elke put.Incubeer de plaat met alle putjes gevuld met de vlek gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Desinfecteer op dit punt het afvalbeker zoals eerder aangetoond. Was de borden krachtig met kraanwater totdat de afvoer helder is.Zorg ervoor dat er ongeveer 10-voudige verschillen zijn in het aantal plaques in elke verdunningsreeks. De figuur toont een 10-voudige afname van plaquetellingen waarbij het telbare aantal plaques daalde in het bereik van 10 tot min vier voor alle drie de replicaties. De eerste drie afbeeldingen in de figuur tonen plaquettes in de verdunning van 10 tot min drie.De onderste rij toont echter resultaten wanneer een plaquetest niet goed wordt uitgevoerd. Er zijn zeer weinig plaques zichtbaar van enige verdunning in de zichtbare gebieden rond de bovenkant waar de Vero-cellen volledig uit het substraat zijn opgetild. Evenzo toont deze figuur problemen met cellen die uitdrogen of verkeerd worden behandeld tijdens de plaquetest.Dit cijfer toont echter kritisch slechte Vero-celzaaiing. Elke put vertoont donkerdere paarse vlekken, wat wijst op cellen die zich niet goed over de put verspreiden en in clusters op elkaar zijn gestapeld. Voor de beste resultaten, zorg ervoor dat het virus gelijkmatig over de plaat wordt verspreid om samengeklonterde plaques te voorkomen Plaque-assays zijn effectiever dan andere kwantitatieve methoden omdat het alleen levend virus telt.Op die manier kan een echte antivirale werkzaamheid worden vastgesteld. Bovendien heeft deze techniek ons in staat gesteld om de virale aanwezigheid op fomites te kwantificeren en de effectiviteit van medicijnafgifte van nieuwe medische hulpmiddelen binnen onze sector van herpesvirusonderzoek te onderzoeken.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In deze video artikel beschrijven we het gebruik van een...

Ex Vivo Organotypische Corneal model van acute Epitheliale Herpes Simplex Virus Type I infectie

Het protocol beschrijft een efficiënt en reproduceerbaar modelsysteem om te studeren herpes simplex virus type 1 (HSV-1) latentie en reactivatie. De test maakt gebruik van homogene sympathiek neuron culturen en maakt het mogelijk om moleculaire dissectie van virus-neuron interacties met behulp van een scala aan hulpmiddelen met inbegrip van RNA-interferentie en expressie van recombinante eiwitten.

Een primaire Neuron Cultuurstelsel voor de Studie van Herpes Simplex Virus latentie en reactivatie

De meeste studies van de herpes ziekte van het hoornvlies gebruik maken van een primaire infectie model. Echter, primaire infectie met HSV-1 gewoonlijk niet tot menselijke ziekte. Hier beschrijven we een terugkerende herpes model van ziekte van het hoornvlies, die beter nabootst menselijke ziekte.

Terugkerende Herpetische Stroma Keratitis in Muizen, een model voor het bestuderen van de Mens HSK

This video describes the virus plaque assay of the infectious herpes simplex virus or HSV. The diluted viral particles are inoculated to the monolayer of epithelial cells. Upon incubation, the virus forms plaques and is counted visually to determine the infectious virus titer.

Virus Plaque Assay: A Technique to Measure Infectious Herpes Simplex Virus via Quantification of Plaques Formed in Monolayer of Virus-Infected Cells

This video demonstrates the method to perform a plaque assay using a virus obtained from infected porcine cornea. The porcine cornea is used to test the antiviral efficacy of experimental drugs.

Determining Antiviral Efficacy of Experimental Drugs Through a Plaque Assay

We hebben een fluorescente in situ hybridisatie protocol voor de detectie van een persistente DNA virusgenoom in weefselcoupes van diermodellen. Dit protocol maakt het bestuderen infectie proces codetection van het virale genoom, zijn RNA producten en virale of cellulaire eiwitten in enkele cellen.

Detectie van het genoom en de transcripties van een persistente DNA Virus in neuronale weefsels door Fluorescent In situ Hybridisatie Gecombineerd met Immunokleuring

De huid is een doelwitweefsel van het humane pathogeen herpes simplex-virus type 1 (HSV-1). Om de invasieroute van HSV-1 in weefsel te onderzoeken, hebben we een ex vivo infectiemodel opgezet van muis-epidermale vellen die de buitenste laag van de huid vertegenwoordigen.

Ex Vivo Infectie van Muizen Epidermis met Herpes simplex virus type 1

We beschrijven het gebruik van een varkenshoornvlies om de antivirale werkzaamheid van experimentele geneesmiddelen te testen.

Porcine Corneal Tissue Explant om de werkzaamheid van Herpes Simplex Virus-1 Antivirale middelen te bestuderen

In dit manuscript beschrijven we een eenvoudige methode van groei, zuivering en titratie van het oncolytische herpes simplex-virus voor preklinisch gebruik.

Groei, zuivering en titratie van oncolytisch herpes simplexvirus

In dit artikel beschrijft de stappen die nodig zijn om te isoleren en te karakteriseren RNA polymerase trouw varianten van RNA-virussen en hoe je mutatiefrequentie gegevens gebruiken om trouw veranderingen in weefselkweek te bevestigen.

Isolatie van Fidelity Varianten van RNA-virussen en Karakterisering van mutatie van de virussen Frequency

Leer het plaquing-protocol voor herpes simplex virussen om virale titers betrouwbaar te kwantificeren. Deze methode biedt inzicht in de effectiviteit van antivirale behandelingen en vereist zorgvuldige uitvoering.

Plaquing van Herpes Simplex Virussen

Meer video's verkennen