Name: Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntingtons Disease Model gebaseerd op humane primaire huidfibroblasten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Leer microtubuli plus-einddynamica visualiseren in humane primaire huidfibroblasten van Huntington-patiënten met EB3-transfectie. Deze methode onthult hoe mutante huntingtine celtransport beïnvloedt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gefinancierd door het ministerie van Wetenschap en Hoger Onderwijs van de Russische Federatie, subsidie nr. 075-15-2019-1669 (transfectie van fibroblasten), door de Russian Science Foundation, subsidie nr. 19-15-00425 (alle andere werken aan de teelt van fibroblasten in vitro). Het werd gedeeltelijk ondersteund door Lomonosov Moscow State University Development program PNR5.13 (beeldvorming en analyse). De auteurs erkennen de steun van het Nikon Center of Excellence aan het A. N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology. We willen onze speciale dank uitspreken aan Ekaterina Taran voor haar hulp bij stemacteren. De auteurs bedanken ook Pavel Belikov voor zijn hulp bij de videobewerking. Figuren in het manuscript zijn gemaakt met BioRender.com.

Dit protocol volgt de richtlijnen van het Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine van het Federal Medical Biological Agency van 8 september 2015.
OPMERKING: Figuur 1 geeft een overzicht van het protocol.
1. Het verkrijgen van een primaire kweek van menselijke huidfibroblasten (Figuur 2)
<ol><li>Lever de biopsie binnen enkele uren af bij een laboratorium in Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM) medium aangevuld met 50 μg/ml penicilline en 50 U/ml streptomycine. OPMERKING: Een huidbiopsie moet onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd door een arts nadat een patiënt een geïnformeerde toestemming heeft ondertekend.</li>
	<li>Plaats het biopsieweefsel in een petrischaaltje van 6 cm samen met een kleine hoeveelheid van het medium.</li>
	<li>Snijd met behulp van een steriel scalpel het biopsiemonster in stukken van ongeveer 0,5-1 mm groot. Plaats 1-2 verkregen fragmenten in een petrischaaltje van 3,5 cm en plaats een steriele deklap over de biopsiestukken. Voeg langzaam 1,5 ml van een groeimedium toe aan de volgende samenstelling: DMEM, 50 E / ml penicilline-streptomycine en 10% foetaal runderserum (FBS).</li>
	<li>Kweekfibroblasten in het groeimedium in een CO2-incubator op 5% CO2,37 °C, 80% vochtigheid. OPMERKING: Na 4-7 dagen beginnen eerst keratinocyten en vervolgens fibroblasten van het weefsel naar de bodem van de schaal te migreren.</li>
</ol>2. Opslag, invriezen en ontdooien van primaire cultuur
<ol><li>Verwijder cellen uit de kweekschaal (zie de punten 3.2-3.4).</li>
	<li>Breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 x g. Gooi vervolgens het supernatant weg en resuspend de celkorrel in 900 μL gekoeld FBS.</li>
	<li>Breng druppelsgewijs over in een cryopreservatiebuis en voeg 100 μL dimethylsulfoxide (DMSO) toe.</li>
	<li>Plaats de cryoprobe in een lage temperatuur vriezer bij -80 °C. Breng vierentwintig uur later het cryoviale over op vloeibare stikstof (−196 °C) voor langdurige opslag.</li>
	<li>Om de gecryopreserveerde cellen te ontdooien, verwijdert u het cryoviaal uit de stikstofopslag en brengt u binnen 1 minuut 1 ml van de inhoud over in een conische buis van 15 ml met 9 ml van het tot 37 °C voorverwarmde transportmedium.</li>
	<li>Voorzichtig resuspend en vervolgens centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 200 x g. Gooi het supernatant weg, resuspend de celkorrel in het vereiste volume van het groeimedium en plaats ze op een petrischaal met de vereiste diameter.</li>
</ol>3. Celkweek
<ol><li>Bedek de bodem van de schaal met geautoclaveerde 0,1% gelatineoplossing bereid in gedestilleerd water. Incubeer gedurende 15 min. OPMERKING: Voor transfectievisualisatie moeten schotels met glazen bodem (confocale schalen met een glasdikte van 170 μm) worden gebruikt.</li>
	<li>Bereid een kweekmedium met de volgende samenstelling: DMEM aangevuld met 10% FBS, 2 mM L-alanyl-L-glutamine, 50 U/ml penicilline-streptomycine. Meng goed en bewaar bij 4 °C. Verwarm het medium tot 37 °C voordat u het aan de cellen toevoegt.</li>
	<li>Beoordeel de cultuur onder de microscoop. Verwijder het medium en was de fibroblasten met Dulbecco's fosfaatzoutoplossing (DPBS).</li>
	<li>Voeg 1 ml voorverwarmde 0,25% trypsine-oplossing toe aan de cellen. Controleer de cellen onder de microscoop als ze volledig loskomen van het substraat. Deactiveer trypsine met 1 ml van het kweekmedium.</li>
	<li>Breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 ml. Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 200 x g, verwijder het supernatant en resuspend de celkorrel in 1 ml van het kweekmedium.</li>
	<li>Tel het aantal cellen. Bereken het benodigde aantal cellen om ze te zaaien met een dichtheid van 8-15 x10 3/ cm2 en resuspend in 2 ml van het kweekmedium.</li>
	<li>Verwijder de gelatine-oplossing uit de kweekschaal en voeg onmiddellijk 2 ml van de celsuspensie toe. Kweek fibroblasten bij 37 °C in een CO2-incubator.</li>
	<li>Ververs het medium om de 2-4 dagen. OPMERKING: Gebruik voor experimenten de cellen van 4-11 passages.</li>
</ol>4. Transfectie
<ol><li>Vervang het kweekmedium 24 uur voor de transfectie door een vers kweekmedium. OPMERKING: De celconfluentie moet 70-80% zijn.</li>
	<li>Bereid een DNA-lipidencomplex voor op basis van het gebied en de dichtheid van de celzaaiing. Gebruik transfectiemiddel op basis van liposoom. OPMERKING: Gebruik de celzaaidichtheid als 1 x 104 cellen / cm2.</li>
	<li>Voeg 3 μL commercieel transfectiereagens toe aan 125 μL optimaal minimaal essentieel medium (Opti-MEM) dat geen antibiotica bevat, zonder de wanden van de buis aan te raken. Voorzichtig resuspend.</li>
	<li>Verdun plasmide-DNA (GFP-EB3) door 1 μg van het plasmide-DNA toe te voegen aan 125 μL Opti-MEM. Voorzichtig resuspend. OPMERKING: Expressievectorcodering GFP-EB311 werd ontvangen als een vriendelijk geschenk van Dr. I. Kaverina (Vanderbilt University, Nashville) met toestemming van Dr. A. Akhmanova (Erasmus Universiteit, Rotterdam)11.</li>
	<li>Voeg verdund plasmide-DNA toe aan elke buis verdund transfectiereagens (1:1). Incubeer gedurende 30 min.</li>
	<li>Voeg het DNA-lipidencomplex toe aan de 6 cm petrischaal met cellen en meng met een kruisvormige zwaai gedurende 30 s. Incubateer cellen met een transfectiemiddel gedurende 24 uur en verander dan in vers medium. Analyseer de efficiëntie van transfectie na 24 uur en 48 uur. OPMERKING: 24 uur na transfectie was het rendement 10-15% en na 48 uur tot 40%.</li>
</ol>5. Voorbereiding op beeldvorming
<ol><li>Voordat de cellen live worden ingebeeld, moet u het kweekmedium veranderen in een medium zonder pH-indicatorkleurstof om autofluorescentie te verminderen.</li>
	<li>Breng voorzichtig minerale olie aan op het mediumoppervlak om het medium volledig te bedekken en te isoleren van de externe omgeving om de O2-penetratie en de mediumverdamping te verminderen.</li>
	<li>Gebruik een kwiklamp en olie-onderdompeling 60x of 100x objectieflens met een hoog numeriek diafragma om de foto's te maken. OPMERKING: Voor in vivo waarnemingen moet de microscoop zijn uitgerust met een incubator om de noodzakelijke omstandigheden voor de cellen te handhaven, inclusief het verwarmen van de objecttafel en de lens tot +37 °C, een gesloten kamer met CO2-toevoer en ondersteuning van het vochtigheidsniveau. Gebruik dubbel gedestilleerd water om vocht te creëren. Controleer het niveau van dubbel gedestilleerd water voordat u gaat filmen.</li>
	<li>Plaats de confocale schaal met de cellen in de microscoophouder voordat u de afbeelding maakt. Zorg ervoor dat de schotel en de camera stevig aan de houder zijn bevestigd om driften tijdens het maken van foto's te voorkomen.</li>
</ol>6. De beeldparameters instellen
<ol><li>Kies de lage blootstellingswaarden omdat licht celbeschadigende reactieve zuurstofsoorten (ROS) induceert. OPMERKING: Om de dynamiek van microtubuli in menselijke huidfibroblasten te bestuderen, werd een blootstelling van 300 ms geselecteerd.</li>
	<li>Focus op het object van belang. OPMERKING: Gebruik voor langdurige time-lapse-beelden het automatische focusstabilisatiesysteem om een mogelijke verschuiving langs de z-as te compenseren.</li>
	<li>Kies de optimale beeldvormingsomstandigheden afhankelijk van de lichtgevoeligheid van de cellen en de snelheid waarmee het fluorochroom vervaagt. OPMERKING: Aangezien microtubuli zeer dynamische structuren zijn, kan een redelijk kort tijdsinterval worden geselecteerd en moet de framesnelheid voldoende hoog zijn. Om de microtubuledynamiek in huidfibroblasten te onderzoeken, gebruikten we met een frequentie van 1 frame /s gedurende 3-5 minuten.</li>
	<li>Wanneer u het volgende object selecteert om de afbeelding op te halen, gaat u weg van het gebied dat al is afgebeeld. Omdat dit gebied onder invloed van licht was, zal er merkbaar fotobleken zijn. OPMERKING: Omdat een relatief hoge beeldfrequentie werd gebruikt, sloot de sluiter niet tussen de beelden en werd de lamp gedurende de hele beeldperiode verlicht, waardoor de vervaging toenam.</li>
	<li>Kies de optimale video voor het visueel bestuderen van de dynamiek van de microtubuli, rekening houdend met de kwaliteit van transfectie, de kwaliteit van de beelden van de microtubuli (optimale signaal-ruisverhouding) en de afwezigheid van drifting in het geval van de geanalyseerde cel (figuur 3).</li>
	<li>Gebruik de geselecteerde video's om de plus-ends dynamiek van de microtubuli te bestuderen door ze te traceren in het ImageJ- of Fiji-programma(Figuur 4). OPMERKING: Voor instructies voor kwantitatieve analyse, zie aanvullende figuur 2 en aanvullend dossier 1.</li>
</ol>

<ol><li>Engelender, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin-associated+Protein+1+%28HAP1%29+Interacts+with+the+p150+Glued+Bubunit+of+Dynactin%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin.</a> Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).</li>
<li>Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+facilitates+dynein%2Fdynactin-mediated+vesicle+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Huntingtin facilitates dynein/dynactin-mediated vesicle transport.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (24), 10045-10050 (2007).</li>
<li>MacMillan, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+and+clinical+correlations+of+the+Huntington%27s+disease+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis and clinical correlations of the Huntington's disease mutation.</a> The Lancet. 342 (8877), 954-958 (1993).</li>
<li>Proskura, A. L., Vechkapova, S. O., Zapara, T. A., Ratushniak, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions+of+huntingtin+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions of huntingtin in the hippocampus.</a> Molecular Biology. 51 (4), 647-653 (2017).</li>
<li>Steffan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Huntington%27s+disease+protein+interacts+with+p53+and+CREB-binding+protein+and+represses+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The Huntington's disease protein interacts with p53 and CREB-binding protein and represses transcription.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6763-6768 (2000).</li>
<li>Nekrasov, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manifestation+of+Huntington%27s+disease+pathology+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Manifestation of Huntington's disease pathology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons.</a> Molecular Neurodegeneration. 11 (1), 1-15 (2016).</li>
<li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+instability+of+microtubule+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li>
<li>Walker, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+instability+of+individual+microtubules+analyzed+by+video+light+microscopy%3A+rate+constants+and+transition+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies.</a> The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).</li>
<li>Desai, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+polymerization+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule polymerization dynamics.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 13 (1), 83-117 (1997).</li>
<li>Allen, C., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+polarity+and+directional+growth+of+microtubules+of+Chlamydomonas+flagella%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural polarity and directional growth of microtubules of Chlamydomonas flagella.</a> Journal of Molecular Biology. 90 (2), 381-402 (1974).</li>
<li>Stepanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+%28end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).</li>
<li>Shelden, E., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+and+quantification+of+individual+microtubule+behavior+in+vivo%3A+microtubule+dynamics+are+cell-type+specific%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Observation and quantification of individual microtubule behavior in vivo: microtubule dynamics are cell-type specific.</a> Journal of Cell Biology. 120 (4), 935-945 (1993).</li>
<li>O'Brien, E. T., Salmon, E. D., Walker, R. A., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+magnesium+on+the+dynamic+instability+of+individual+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of magnesium on the dynamic instability of individual microtubules.</a> Biochemistry. 29 (28), 6648-6656 (1990).</li>
<li>Drechsel, D. N., Hyman, A. A., Cobb, M. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+dynamic+instability+of+tubulin+assembly+by+the+microtubule-associated+protein+tau%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Modulation of the dynamic instability of tubulin assembly by the microtubule-associated protein tau.</a> Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1141-1154 (1992).</li>
<li>Gildersleeve, R. F., Cross, A. R., Cullen, K. E., Fagen, A. P., Williams, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+grow+and+shorten+at+intrinsically+variable+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microtubules grow and shorten at intrinsically variable rates.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (12), 7995-8006 (1992).</li>
<li>Penazzi, L., Bakota, L., Brandt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+dynamics+in+neuronal+development%2C+plasticity%2C+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule dynamics in neuronal development, plasticity, and neurodegeneration.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 321, 89-169 (2016).</li>
<li>van de Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+plus-end+tracking+proteins+in+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).</li>
<li>Applegate, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((plusTipTracker%3A+Quantitative+image+analysis+software+for+the+measurement+of+microtubule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics.</a> Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).</li>
<li>Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+cycle+of+MTs%3A+persistent+growth+in+the+cell+interior%2C+asymmetric+transition+frequencies+and+effects+of+the+cell+boundary%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Life cycle of MTs: persistent growth in the cell interior, asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary.</a> Journal of Cell Science. 115 (17), 3527-3539 (2002).</li>
<li>Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., vanden Broek, B., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+imaging+conditions+for+demanding+multi-color+super+resolution+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimizing imaging conditions for demanding multi-color super resolution localization microscopy.</a> PLoS One. 11 (7), 0158884(2016).</li>
<li>Dixit, R., Cyr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+damage+and+reactive+oxygen+species+production+induced+by+fluorescence+microscopy%3A+effect+on+mitosis+and+guidelines+for+non-invasive+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy.</a> The Plant Journal. 36 (2), 280-290 (2003).</li>
<li>Grzelak, A., Rychlik, B., Bartosz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-dependent+generation+of+reactive+oxygen+species+in+cell+culture+media%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Light-dependent generation of reactive oxygen species in cell culture media.</a> Free Radical Biology and Medicine. 30 (12), 1418-1425 (2001).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Betere kwaliteitsresultaten voor de dynamische analyse van microtubuli kunnen worden verkregen uit microscopische beelden van hoge kwaliteit. Het is belangrijk om alle noodzakelijke voorwaarden voor time-lapse beeldvorming van levende cellen in acht te nemen en de beeldvormingsparameters correct aan te passen. Het gebruik van speciale celkweekschalen met een glazen bodem (confocale schotels) is belangrijk, omdat glas een andere brekingsindex van licht heeft dan plastic. De dikte van het glas en de uniformiteit ervan over...

De ziekte van Huntington (ZvH) is een ongeneeslijke neurodegeneratieve pathologie veroorzaakt door een mutatie-gen dat codeert voor het kjatingtine-eiwit (HTT). HTT wordt voornamelijk geassocieerd met blaasjes en microtubuli en is waarschijnlijk betrokken bij microtubuli-afhankelijke transportprocessen1,2. Om de invloed van mutant HTT op de microtubuledynamica te bestuderen, gebruikten we in vitro visualisatie van het EB3-eiwit, dat de dynamische eigenschappen van microtubuli reguleert door de groeiende plus-uiteinden te binden en te stabiliseren. Om fluorescerend gelabelde EB3 in menselijke huidfibroblasten te laden, werd plasmidetransfectie toegepast. We gebruikten de primaire fibroblastcultuur verkregen uit de huidbiopsie van de ZvH-patiënten voor deze studie.
De mutatie in het HTT-eiwitgen leidt tot verlenging van het polyglutaminekanaal3. HTT heeft een rol in cellulaire processen zoals endocytose4,celtransport1,2,eiwitafbraak5,enz. Een substantieel deel van deze processen omvat verschillende elementen van het celcytoskelet, waaronder de microtubuli.
Menselijke primaire cellen zijn het beste model om gebeurtenissen die zich in patiëntencellen voordoen zo goed mogelijk te reproduceren. Om dergelijke modellen te maken, moet men cellen isoleren van menselijk biopsiemateriaal (bijvoorbeeld uit chirurgische monsters). De resulterende primaire cellijn is geschikt om pathogenese te bestuderen met behulp van verschillende genetische, biochemische, moleculaire en celbiologische methoden. Ook dienen menselijke primaire celculturen als een voorloper voor het creëren van verschillende transgedifferentieerde en transgene culturen6.
In tegenstelling tot vereeuwigde celculturen is het belangrijke nadeel van primaire cellen echter hun beperkte doorgangscapaciteit. Daarom raden we aan om cellen te gebruiken in de vroege passagefase (tot 15). Oudere culturen degenereren zeer snel en verliezen hun unieke eigenschappen. Daarom moeten de nieuw verkregen primaire cellen bevroren worden gehouden voor langdurige opslag.
Primaire celculturen zijn gevoelig voor kweekomstandigheden. Daarom vereisen ze vaak unieke benaderingen en optimalisatie van groeiomstandigheden. Met name de primaire fibroblasten van de menselijke huid die in onze experimenten worden gebruikt, zijn veeleisend voor het substraat. Daarom gebruikten we verschillende extra coatings (bijv. Gelatine of fibronectine), afhankelijk van het type experiment.
Het celcytoskelet bepaalt de celvorm, mobiliteit en voortbeweging. De dynamiek van het cytoskelet is cruciaal voor veel intracellulaire processen, zowel in de interfase als in mitose. In het bijzonder het cytoskelet gepolymeriseerd uit tubuline, zijn zeer dynamische en polaire structuren, waardoor motoreiwit-gemedieerd gericht intracellulair transport mogelijk is. De uiteinden van de microtubuli zijn in constante herschikking, hun assemblagefasen worden afgewisseld met de demontagefasen en dit gedrag wordt "dynamische instabiliteit" genoemd7,8,9. Verschillende geassocieerde eiwitten verschuiven het evenwicht van de polymerisatiereactie, wat leidt tot de polymeervorming of de eiwitmonomeervorming. De toevoeging van tubuline-subeenheden vindt voornamelijk plaats aan het plus-uiteinde van microtubuli10. De eindbindende (EB) eiwitfamilie bestaat uit drie leden: EB1, EB2 en EB3. Ze dienen als plus-end-tracking eiwitten (+ TIPs) en reguleren de dynamische eigenschappen van microtubuli door hun groeiende plus-ends te binden en te stabiliseren11.
Veel studies gebruiken fluorescerende molecuul-gelabelde tubuline micro-injectie of transfectie met time-lapse beeldvorming en video-analyse om microtubuli in vitrote visualiseren. Deze methoden kunnen invasief zijn en schadelijk voor cellen, vooral primaire menselijke cellen. De meest uitdagende stap is het vinden van voorwaarden voor celtransfectie. We probeerden het hoogst mogelijke niveau van transfectie te bereiken zonder de levensvatbaarheid en de morfologie van inheemse cellen te beïnvloeden. Deze studie past de klassieke methode toe om de verschillen in microtubulidynamiek in huidfibroblasten van gezonde donoren en patiënten met de Ziekte van Huntington te bestuderen.

<table><tbody><tr><td>Instrumentatie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camera iXon DU897 EMCCD</td><td>Andor Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5804 R</td><td>Eppendorf Corporate</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentie filterset HYQ FITC</td><td>Nikon</td><td></td><td>Alternatief: Leica, Olympus, Zeiss</td></tr><tr><td>LUNA-II geautomatiseerde celteller</td><td>Logos Biosystems</td><td>L40002</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop incubator voor levensfilms</td><td>Okolab</td><td>Temperatuurregelaar H301-T-UNIT-BL-PLUS</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Gasregelaar CO2-O2-UNIT-BL</td><td></td></tr><tr><td>Objectief CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13)</td><td>Nikon</td><td></td><td>Alternatief: Leica, Olympus, Zeiss</td></tr><tr><td>Widefield fluorescentie lichtmicroscoop Eclipse Ti-E</td><td>Nikon</td><td></td><td>Alternatief: Leica, Olympus, Zeiss</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji (Image J versie 2.1.0/1.53c)</td><td>Open source beeldverwerkingssoftware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td>Alternatief: Leica, Olympus, Zeiss</td></tr><tr><td>Aanvullende reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mineralolie (Licht witte olie)</td><td>MP</td><td>151694</td><td></td></tr><tr><td>Celcultuurschaal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cel Cultuurschaal</td><td>SPL Lifesciences</td><td>20035</td><td></td></tr><tr><td>Confocale Schaal (glasdikte 170 &micro;m)</td><td>SPL Lifesciences</td><td>211350</td><td>Alternatief: MatTek</td></tr><tr><td>Konieke Centrifugeerbuis</td><td>SPL Lifesciences</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>Cryogene Flacons</td><td>Corning-Costar</td><td>430659</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugebuisje</td><td>Nest</td><td>615001</td><td></td></tr><tr><td>Kweek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Transfectie Reagens</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000001</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>PanEko</td><td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq01.jpg"/>135</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Media)</td><td>PanEko</td><td>C420<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg"/></td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco's fosfaat-zout oplossing)</td><td>PanEko</td><td>P060<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg"/></td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>K053/SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine (rundehuid)</td><td>PanEko</td><td><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq01.jpg"/>070</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM (1x) + Glutamax</td><td>Gibco</td><td>519850026</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine</td><td>PanEko</td><td>A063<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg"/></td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0.25%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Transfectie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmid DNA met EB3-GFP</td><td>Vriendelijk geschenk van Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] met toestemming van Dr. A. Akhmanova [Erasmus University, Rotterdam]</td><td>Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003</td><td></td></tr></tbody></table>

microtubule plus-end dynamics visualization in huntington's disease model gebaseerd op humane primaire huidfibroblasten

Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts

Transfectie met een fluorescerend gelabeld markereiwit van belang in combinatie met time-lapse videomicroscopie is een klassieke methode om de dynamische eigenschappen van het cytoskelet te bestuderen. Dit protocol biedt een techniek voor menselijke primaire fibroblasttransfectie, die moeilijk kan zijn vanwege de specifieke kenmerken van primaire celkweekomstandigheden. Bovendien vereist het onderhoud van de dynamische eigenschap van cytoskeletten een laag niveau van transfectie om een goede signaal-ruisverhouding te verkrijgen zonder microtubulestabilisatie te veroorzaken. Het is belangrijk om maatregelen te nemen om de cellen te beschermen tegen door licht veroorzaakte stress en fluorescerende kleurstofvervaging. In de loop van ons werk hebben we verschillende transfectiemethoden en -protocollen getest, evenals verschillende vectoren om de beste combinatie van aandoeningen te selecteren die geschikt is voor menselijke primaire fibroblaststudies. We analyseerden de resulterende time-lapse-video's en berekenden de microtubule-dynamiek met behulp van ImageJ. De dynamiek van de plus-uiteinden van microtubuli in de verschillende celdelen is niet vergelijkbaar, dus verdeelden we de analyse in subgroepen - het centrosoomgebied, de lamellen en de staart van fibroblasten. Dit protocol kan met name worden gebruikt voor in vitro analyse van cytoskeletdynamica in patiëntmonsters, waardoor de volgende stap kan worden gezet naar het begrijpen van de dynamiek van de verschillende ziekteontwikkelingen.

De resulterende GFP-EB3-films geproduceerd met behulp van het protocol (Figuur 1) illustreren de dynamische eigenschappen van de microtubuli. Microtubuli zijn betrokken bij verschillende celprocessen en hun dynamische eigenschappen beïnvloeden verschillende levenskenmerken van de primaire menselijke celcultuur uit biopsiemateriaal van patiënten(figuur 2).
De volgende parameters bepalen de dynamische instabiliteit van microtubuli: de g...

Dit protocol is gewijd aan de microtubule plus-end visualisatie door EB3-eiwittransfectie om hun dynamische eigenschappen in primaire celkweek te bestuderen. Het protocol werd geïmplementeerd op menselijke primaire huidfibroblasten verkregen van patiënten met de Ziekte van Huntington.

Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model gebaseerd op humane primaire huidfibroblasten

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the ...

De Ziekte van Huntington, de ZvH, is een ongeneeslijke, neurodegeneratieve pathologie veroorzaakt door een mutatie in gen dat codeert voor huntingtine-eiwit. Het huntingtine wordt voornamelijk geassocieerd met blaasjes en microtubuli en is waarschijnlijk betrokken bij microtubule-afhankelijke transportprocessen. Om de invloed van mutant huntingtine op de dynamiek van microtubuli te bestuderen, gebruikten we in vivo visualisatie van EB3-eiwit, dat de dynamische eigenschappen van microtubuli reguleert door de groeiende plus-uiteinden te buigen en te stabiliseren.Om fluorescerend gelabelde EB3 in fibroblasten van de menselijke huid te laden, pasten we plasmidetransfectie toe. We gebruikten de primaire fibroblastcultuur om te verkrijgen uit de huidbiopsie van de EB3-patiënt voor deze studie. Lever de biopsie binnen enkele uren in DMEM-medium aan het laboratorium, aangevuld met 15 microgram per milliliter penicilline en 50 eenheden per milliliter streptomycine.Plaats biopsieweefsel in een petrischaaltje van zes centimeter, samen met een kleine hoeveelheid medium. Snijd met behulp van een steriel scalpel het biopsiemonster in stukken van ongeveer 0,5 tot een millimeter groot. Plaats één, twee, verkregen fragmenten in een petrischaaltje van 3,5 centimeter en plaats een steriele afdekplaat over de biopsiestukken.Voeg langzaam 1,5 milliliter van een groeimedium toe. Kweek fiberblasten in het groeimedium in een CO2 incubator, in 5% CO2 dat is zeven Celsius, 80% vochtigheid. Na vier, zeven dagen beginnen eerst keratinocyten en vervolgens fibroblasten van het weefsel naar de bodem van de schaal te migreren.Celkweek. Voor transfectievisualisatie moeten glazen confocale bordschalen, confocale gerechten worden gebruikt. Bedek de bodem van de schaal met geautoclaveerde 0,1% gelatineoplossing bereid in gedestillaatwater.Incubeer gedurende 15 minuten. Bereid het cultuurmedium voor. Meng grondig, bewaar hoog bij plus 4 Graden Celsius.Verwarm het medium tot plus 37 graden Celsius, voordat je het aan de cellen toevoegt. Beoordeel de cultuur onder de microscoop. Verwijder het medium en was de cellen met een steriele DPBS.Voeg een milliliter voorverwarmde 0,25% trypsine-oplossing toe aan de cellen. Controleer de cellen onder de microscoop als ze volledig loskomen van het substraat. Deactiveer trypsine met één milliliter van het kweekmedium.Breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 milliliter. Centrifugeer de buis gedurende vijf minuten bij 200 G. Verwijder het supernatant, resuspend het cellenpalet in één milliliter van het kweekmedium.Tel het celnummer. Bereken het vereiste aantal cellen. Ontpit ze met een dichtheid van acht tot 15, vermenigvuldigd met 10 tot de kracht van drie, gepasseerd met een centimeter.Dit wordt omgevormd tot milliliters van het cultuurmedium. Verwijder de gelatine-oplossing uit de kweekschaal die is bereid voor inenting en voeg onmiddellijk twee milliliter van de celsuspensie toe. Kweek fibroblasten bij plus 37 graden Celsius in een CO2-incubator.Ververs het medium om de twee, vier dagen. Gebruik voor experimenten de cellen van vier, 11 passages. Tegen de tijd van transfectie mag de samenvloeiing niet meer dan 70 zijn, 80% Vervang het kweekmedium door een nieuw medium 24 uur vóór transfectie.Bereid een DNA-lipidencomplex voor, op basis van het gebied en de dichtheid van de celzaaiing. Liposomaal transfectiemiddel en de dichtheid van de celzaaiing van één, vermenigvuldigd met 10 tot de kracht van vier cellen, gepasseerd door een centimeter werd gebruikt. Voeg drie microliter commercieel reagens toe aan 125 microliter Opti-MEM, die geen antibioticum bevat.Zonder de buiswanden aan te raken, voorzichtig resuspend. Verdun plasmide-DNA, GFP-EB3, en voeg één microgram van het plasmide-DNA toe aan 125 microliter OptiMEM. Voorzichtig resuspend.Voeg verdund plasmide-DNA toe aan elke buis verdund transfectiereagens, één op één verhouding. Incubeer gedurende 30 minuten. Voeg het DNA lipidencomplex toe aan de zes centimeter petrischaal met cellen.Meng met een kruisvormige schommel gedurende 30 seconden. Incubateer cellen met een transfectiemiddel gedurende 24 uur en verander vervolgens het medium in vers. Analyseer de efficiëntie na inspectie in 24 en 48 uur.Voorbereiding op beeldvorming. Voordat levende beeldvorming van cellen plaatsvindt, verandert u het kweekmedium in een medium zonder PH-indicatorkleurstof om autofluorescentie te verminderen. Breng voorzichtig minerale olie aan op de medium celfase om het medium volledig te bedekken, isoleer het van de externe omgeving om de O2-penetratie en de mediumverdamping te verminderen.Gebruik een macrolamp en alle afbeeldingen in een 60-voudige, 100-voudige objectieflens met een hoog numeriek diafragma om een foto te maken. Voor viva-waarnemingen moet de microscoop worden uitgerust met een incubator om de noodzakelijke omstandigheden voor de cellen te handhaven, inclusief het raken van de optische tafel, en de lens om 37 graden Celsius te passeren, een gesloten kamer was CO2-toevoer en ondersteuning van het vochtigheidsniveau. Plaats de confocale schaal met de cellen in de houder van de microscoop voordat u de afbeelding afbeeldt.Zorg ervoor dat de schotel en de camera stevig aan de houder zijn bevestigd om driften tijdens het maken van foto's te voorkomen. De beeldparameters instellen. Kies de lage belichtingswaarden, omdat dia celbeschadiging induceert, reageert met zuurstofruimten.Om de dynamiek van microtubuli in menselijke huidfibroblasten te bestuderen, selecteerden we een blootstelling van 300 milliseconden. Focus op het object van belang. Voor langdurige, time-lapse beeldvorming is het automatische focusstabilisatiesysteem, perfect focussysteem noodzakelijk, omdat er een verschuiving langs de ingestelde as kan zijn en het object van belang dus onscherp zal zijn.Kies de optimale beeldomstandigheden, afhankelijk van de lichtgevoeligheid van de cel en de snelheid waarmee het overstralingschrome vervagen. Omdat microtubuli zeer dynamische structuren zijn, kan op zijn beurt redelijk korte tijd worden geselecteerd en moet de framesnelheid voldoende hoog zijn. Om de microtubulidynamiek in huidfibroblasten te onderzoeken, gebruikten we een frequentie van één frame per seconde, gedurende drie, vijf minuten.Bij het selecteren van het volgende object om beeld te krijgen, ga weg van het reeds afgebeelde gebied, omdat er onder invloed van licht een lapbare fotobloeding is. Omdat we een relatief hoge beeldfrequentie gebruikten, sloot de sluiter niet tussen de beelden en was de lamp de hele beeldperiode te laat, wat steeds meer vervaagt. Kies de optimale video's voor het visueel bestuderen van de microtubule-dynamiek, rekening houdend met de kwaliteit van transfectie, de kwaliteit van de beelden van de microtubuli, optimale signaal-ruisverhouding en de afwezigheid van drifting van geanalyseerde cellen.Gebruik de geselecteerde video's om de dynamiek van de microtubuli plus-ends te bestuderen, door ze in het Fiji-programma te knippen. De meest kritische stap in het protocol is transfectie, het zorgen voor voldoende eiwitexpressie. Een goede signaal-ruisverhouding, geen fotobleaching van microtubuli en afwezigheid van celdrift zijn van cruciaal belang voor beeldvorming.In vivo visualisatie van microtubule dynamica levert essentiële informatie over de eigenschappen van mutant huntingtine. Ons protocol kan worden toegepast op studies van andere ziekten, waarvan de pathologie dynamische eigenschappen van cytoskelet impliceert.

microtubule-plus-end-dynamics-visualization-huntington-s-disease

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Fibroblasten van patiënten die mutaties in Parkinson's ziekte-veroorzakende genen vormen een gemakkelijk...

Het gebruik van primaire menselijke fibroblasten voor de monitoring van Mitochondriale fenotypes op het gebied van de ziekte van Parkinson

De MATLAB-gebaseerde, open source software pakket, plusTipTracker, kan worden gebruikt voor het analyseren afbeelding reeks van fluorescent gelabelde + tips om dynamiek van microtubuli kwantificeren.

Met behulp plusTipTracker Software om dynamiek van microtubuli Meet in Xenopus laevis Groei Kegels

Protocollen voor de kweek van humane navelstrengveneuze endotheelcellen (HUVEC), tijdelijke transfectie van fluorescerend gelabelde markers van microtubulusgroei, beeldvorming van levende cellen en geautomatiseerde analyse van interfase-microtubulusgroeidynamiek worden gedetailleerd beschreven.

Hoge-resolutie time-lapse beeldvorming en geautomatiseerde analyse van de dynamiek van microtubuli in Living humane navelstreng endotheelcellen

Gist is een voordelige model voor het bestuderen van de dynamica van microtubuli in vivo vanwege de krachtige genetica en de eenvoud van het microtubule-cytoskelet. Het volgende protocol wordt beschreven hoe om te transformeren en cultuur gistcellen, verwerven confocale microscopie afbeeldingen en kwantitatief te analyseren dynamiek van microtubuli in levende gistcellen.

Hoge-resolutie beeldvorming en analyse van individuele Astral dynamiek van microtubuli in gist

Hier presenteren we een robuuste en gedetailleerde methode van microtubulus dynamica analyse in cellen gesynchroniseerd in tijdens met behulp van Live-cel spinnen schijf confocale microscopie en MATLAB gebaseerde beeldverwerking.

Meting van de microtubulus dynamiek door draaiende schijf microscopie in monopolaire mitotische spindels

Een protocol voor het in beeld brengen van de dynamische microtubuli in vivo met behulp van fluorescerend gelabeld Eindbindend eiwit is gepresenteerd. We beschreven de methoden om de dynamische microtubuli in het posterieure laterale microtubuli (PLM) neuron van C. elegans te labelen,in beeld te geven en te analyseren .

In vivo Beoordeling van microtubule dynamica en oriëntatie in Caenorhabditis elegans neuronen

Hier wordt een op TIRF-microscopie gebaseerde in vitro reconstitutietest gepresenteerd om tegelijkertijd de dynamiek van twee microtubulipopulaties te kwantificeren en te vergelijken. Er wordt een methode beschreven om tegelijkertijd de collectieve activiteit van meerdere microtubule-geassocieerde eiwitten op verknoopte microtubulibundels en enkele microtubuli te bekijken.

Gelijktijdige visualisatie van de dynamica van crosslinked en enkele microtubuli in vitro door TIRF-microscopie

In dit artikel presenteren we een protocol om microtubule-geladen oligodendrocyten te detecteren in een model van tubulinopathie door middel van een eenvoudige, innovatieve tweede harmonische generatie microscopiebenadering.

Labelvrije niet-lineaire optica voor de studie van tubuline-afhankelijke defecten in centrale myeline

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om de microtubuli-netwerken in neuromusculaire knooppunten en spiercellen te visualiseren. In combinatie met de krachtige genetische hulpmiddelen van Drosophila melanogaster, vergemakkelijkt dit protocol de genetische screening en de analyse van de microtubuli-dynamiek aanzienlijk voor de rol van regulerende eiwitten van het microtubuli-netwerk in het zenuwstelsel.

Drosophila-larvale neuromusculaire junctie en spiercellen gebruiken om het netwerk van microtubuli te visualiseren

In dit rapport beschrijven we de drie-dimensionale huid te reconstrueren model dat de menselijke huid nabootst in de architectuur en compositie. Melanocyt fysiologie, melanoomprogressie en het lot van dermale stamcellen zijn onderzocht met behulp van de huid te reconstrueren model. Het model is ook bruikbaar als een preklinische hulpmiddel voor drugs beoordeling.

De driedimensionale menselijke huid Reconstrueer model: een instrument om de normale huid en melanoomprogressie Study

Leer microtubuli plus-einddynamica visualiseren in humane primaire huidfibroblasten van Huntington-patiënten met EB3-transfectie. Deze methode onthult hoe mutante huntingtine celtransport beïnvloedt.

Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model gebaseerd op humane primaire huidfibroblasten

Meer video's verkennen