Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model gebaseerd op humane primaire huidfibroblasten

De Ziekte van Huntington, de ZvH, is een ongeneeslijke, neurodegeneratieve pathologie veroorzaakt door een mutatie in gen dat codeert voor huntingtine-eiwit. Het huntingtine wordt voornamelijk geassocieerd met blaasjes en microtubuli en is waarschijnlijk betrokken bij microtubule-afhankelijke transportprocessen. Om de invloed van mutant huntingtine op de dynamiek van microtubuli te bestuderen, gebruikten we in vivo visualisatie van EB3-eiwit, dat de dynamische eigenschappen van microtubuli reguleert door de groeiende plus-uiteinden te buigen en te stabiliseren.

Om fluorescerend gelabelde EB3 in fibroblasten van de menselijke huid te laden, pasten we plasmidetransfectie toe. We gebruikten de primaire fibroblastcultuur om te verkrijgen uit de huidbiopsie van de EB3-patiënt voor deze studie. Lever de biopsie binnen enkele uren in DMEM-medium aan het laboratorium, aangevuld met 15 microgram per milliliter penicilline en 50 eenheden per milliliter streptomycine.

Plaats biopsieweefsel in een petrischaaltje van zes centimeter, samen met een kleine hoeveelheid medium. Snijd met behulp van een steriel scalpel het biopsiemonster in stukken van ongeveer 0,5 tot een millimeter groot. Plaats één, twee, verkregen fragmenten in een petrischaaltje van 3,5 centimeter en plaats een steriele afdekplaat over de biopsiestukken.

Voeg langzaam 1,5 milliliter van een groeimedium toe. Kweek fiberblasten in het groeimedium in een CO2 incubator, in 5% CO2 dat is zeven Celsius, 80% vochtigheid. Na vier, zeven dagen beginnen eerst keratinocyten en vervolgens fibroblasten van het weefsel naar de bodem van de schaal te migreren.

Celkweek. Voor transfectievisualisatie moeten glazen confocale bordschalen, confocale gerechten worden gebruikt. Bedek de bodem van de schaal met geautoclaveerde 0,1% gelatineoplossing bereid in gedestillaatwater.

Incubeer gedurende 15 minuten. Bereid het cultuurmedium voor. Meng grondig, bewaar hoog bij plus 4 Graden Celsius.

Verwarm het medium tot plus 37 graden Celsius, voordat je het aan de cellen toevoegt. Beoordeel de cultuur onder de microscoop. Verwijder het medium en was de cellen met een steriele DPBS.

Voeg een milliliter voorverwarmde 0,25% trypsine-oplossing toe aan de cellen. Controleer de cellen onder de microscoop als ze volledig loskomen van het substraat. Deactiveer trypsine met één milliliter van het kweekmedium.

Breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 milliliter. Centrifugeer de buis gedurende vijf minuten bij 200 G. Verwijder het supernatant, resuspend het cellenpalet in één milliliter van het kweekmedium.

Tel het celnummer. Bereken het vereiste aantal cellen. Ontpit ze met een dichtheid van acht tot 15, vermenigvuldigd met 10 tot de kracht van drie, gepasseerd met een centimeter.

Dit wordt omgevormd tot milliliters van het cultuurmedium. Verwijder de gelatine-oplossing uit de kweekschaal die is bereid voor inenting en voeg onmiddellijk twee milliliter van de celsuspensie toe. Kweek fibroblasten bij plus 37 graden Celsius in een CO2-incubator.

Ververs het medium om de twee, vier dagen. Gebruik voor experimenten de cellen van vier, 11 passages. Tegen de tijd van transfectie mag de samenvloeiing niet meer dan 70 zijn, 80% Vervang het kweekmedium door een nieuw medium 24 uur vóór transfectie.

Bereid een DNA-lipidencomplex voor, op basis van het gebied en de dichtheid van de celzaaiing. Liposomaal transfectiemiddel en de dichtheid van de celzaaiing van één, vermenigvuldigd met 10 tot de kracht van vier cellen, gepasseerd door een centimeter werd gebruikt. Voeg drie microliter commercieel reagens toe aan 125 microliter Opti-MEM, die geen antibioticum bevat.

Zonder de buiswanden aan te raken, voorzichtig resuspend. Verdun plasmide-DNA, GFP-EB3, en voeg één microgram van het plasmide-DNA toe aan 125 microliter OptiMEM. Voorzichtig resuspend.

Voeg verdund plasmide-DNA toe aan elke buis verdund transfectiereagens, één op één verhouding. Incubeer gedurende 30 minuten. Voeg het DNA lipidencomplex toe aan de zes centimeter petrischaal met cellen.

Meng met een kruisvormige schommel gedurende 30 seconden. Incubateer cellen met een transfectiemiddel gedurende 24 uur en verander vervolgens het medium in vers. Analyseer de efficiëntie na inspectie in 24 en 48 uur.

Voorbereiding op beeldvorming. Voordat levende beeldvorming van cellen plaatsvindt, verandert u het kweekmedium in een medium zonder PH-indicatorkleurstof om autofluorescentie te verminderen. Breng voorzichtig minerale olie aan op de medium celfase om het medium volledig te bedekken, isoleer het van de externe omgeving om de O2-penetratie en de mediumverdamping te verminderen.

Gebruik een macrolamp en alle afbeeldingen in een 60-voudige, 100-voudige objectieflens met een hoog numeriek diafragma om een foto te maken. Voor viva-waarnemingen moet de microscoop worden uitgerust met een incubator om de noodzakelijke omstandigheden voor de cellen te handhaven, inclusief het raken van de optische tafel, en de lens om 37 graden Celsius te passeren, een gesloten kamer was CO2-toevoer en ondersteuning van het vochtigheidsniveau. Plaats de confocale schaal met de cellen in de houder van de microscoop voordat u de afbeelding afbeeldt.

Zorg ervoor dat de schotel en de camera stevig aan de houder zijn bevestigd om driften tijdens het maken van foto's te voorkomen. De beeldparameters instellen. Kies de lage belichtingswaarden, omdat dia celbeschadiging induceert, reageert met zuurstofruimten.

Om de dynamiek van microtubuli in menselijke huidfibroblasten te bestuderen, selecteerden we een blootstelling van 300 milliseconden. Focus op het object van belang. Voor langdurige, time-lapse beeldvorming is het automatische focusstabilisatiesysteem, perfect focussysteem noodzakelijk, omdat er een verschuiving langs de ingestelde as kan zijn en het object van belang dus onscherp zal zijn.

Kies de optimale beeldomstandigheden, afhankelijk van de lichtgevoeligheid van de cel en de snelheid waarmee het overstralingschrome vervagen. Omdat microtubuli zeer dynamische structuren zijn, kan op zijn beurt redelijk korte tijd worden geselecteerd en moet de framesnelheid voldoende hoog zijn. Om de microtubulidynamiek in huidfibroblasten te onderzoeken, gebruikten we een frequentie van één frame per seconde, gedurende drie, vijf minuten.

Bij het selecteren van het volgende object om beeld te krijgen, ga weg van het reeds afgebeelde gebied, omdat er onder invloed van licht een lapbare fotobloeding is. Omdat we een relatief hoge beeldfrequentie gebruikten, sloot de sluiter niet tussen de beelden en was de lamp de hele beeldperiode te laat, wat steeds meer vervaagt. Kies de optimale video's voor het visueel bestuderen van de microtubule-dynamiek, rekening houdend met de kwaliteit van transfectie, de kwaliteit van de beelden van de microtubuli, optimale signaal-ruisverhouding en de afwezigheid van drifting van geanalyseerde cellen.

Gebruik de geselecteerde video's om de dynamiek van de microtubuli plus-ends te bestuderen, door ze in het Fiji-programma te knippen. De meest kritische stap in het protocol is transfectie, het zorgen voor voldoende eiwitexpressie. Een goede signaal-ruisverhouding, geen fotobleaching van microtubuli en afwezigheid van celdrift zijn van cruciaal belang voor beeldvorming.

In vivo visualisatie van microtubule dynamica levert essentiële informatie over de eigenschappen van mutant huntingtine. Ons protocol kan worden toegepast op studies van andere ziekten, waarvan de pathologie dynamische eigenschappen van cytoskelet impliceert.