Name: Magnetische isolatie van microgliale cellen van neonate muis voor primaire celculturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Leer magnetische isolatie van microglia uit neonatale muizenhersenen voor primaire celculturen. Deze methode waarborgt hoge zuiverheid en levensvatbaarheid, essentieel voor neuro-inflammatieonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Figuren zijn gemaakt met Behulp van BioRender. Onderzoek wordt gefinancierd door Inserm, Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco, en een aanvullende subsidie van Investissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS en Investissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.

Het protocol werd goedgekeurd en alle dieren werden behandeld volgens de institutionele richtlijnen van Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique (Inserm, Frankrijk). Magnetische isolatie van microglia uit de hersenen van 24 OF1 muisjongen (zowel mannelijk als vrouwelijk) op P8, verdeeld in 6-well, 12-well of 96-well platen, worden gepresenteerd. Het experimentele werk werd uitgevoerd onder een kap om steriele omstandigheden te behouden.
1. Bereiding van steriele oplossingen voor isolatie en celkweek
<ol><li>Bereid 50 ml 1x Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) zonder Ca2+ en Mg2+ (HBSS-/-) uit de in de handel verkrijgbare 10x-oplossing (zie Materiaal tabel).</li>
	<li>Bereid het dissociatiemengsel volgens de samenstelling in tabel 1 met behulp van een in de handel verkrijgbare weefseldissociatiekit (zie materiaaltabel).</li>
	<li>Bereid 200 ml 1x HBSS met Ca2+ en Mg2+ (HBSS+/+) uit de in de handel verkrijgbare 10x oplossing.</li>
	<li>Bereid 200 ml 1x PBS + 0,5% BSA (celsorteerbuffer genoemd).</li>
	<li>Bereid CD11b-microbeads volgens tabel 2.</li>
	<li>Bereid 500 ml macrofaag serumvrij kweekmedium (SFM) + 1% penicilline-streptomycine (P / S). Maak aliquots van buizen van 50 ml en bewaar ze bij 4 °C. Dit wordt later in de tekst het microgliamedium genoemd. OPMERKING: Alle isolatieoplossingen moeten vers worden bereid onder steriele omstandigheden op de experimenteerdag en op ijs worden bewaard. Microglia celkweekmedium kan worden bereid, gealiquoteerd in buizen van 50 ml en bewaard op 4 °C voor toekomstig gebruik. Filtratie is niet nodig.</li>
</ol>2. Hersendissectie
<ol><li>Onthoofd het hoofd van de pup met een grote schaar zonder voorafgaande algemene anesthesie.</li>
	<li>Knip de huid van de nek tot de neus na de sagittale hechting (15-20 mm) met een kleine schaar (figuur 1A-C).</li>
	<li>Steek de uiteinden van een kleine schaar in het Foramen magnum parallel aan de schedel. Snijd van elke kant voorzichtig naar de ogen (figuur 1D, E).</li>
	<li>Knip tussen de ogen met een kleine schaar om de schedel en de hersenen los te maken van het hoofd (figuur 1F).</li>
	<li>Pak met twee tangen de schedel dicht bij de olfactorische bollen en scheur de schedel voorzichtig, waarbij je ervoor zorgt dat de onderliggende hersenen niet worden beschadigd (figuur 1G-I).</li>
	<li>Verwijder cerebellum en reukbol met een scheermesje en snijd de hersenen in twee stukken (figuur 1J).</li>
	<li>Plaats de hersenstukken in een petrischaaltje met 30-40 ml HBSS-/- (figuur 1K).</li>
</ol>3. Hersendissociatie en magnetische microgliale isolatie
OPMERKING: Alle celmanipulaties en resuspensaties moeten met grote voorzichtigheid worden uitgevoerd met een pipet van 1.000 μL. Het toepassen van een hoge mechanische actie kan microgliacellen activeren of doden.
<ol><li>Breng 12 hersenstukken (~1,2 g) per dissociatiebuis met dissociatiemengsel volgens tabel 1. Voor 24 pups waren vier C-Tubes nodig (figuur 2A-B).</li>
	<li>Plaats C-Tubes op de dissociator (met de verwarmingsmodus). Start het geoptimaliseerde NTDK-programma in de apparatuur volgens de instructies van de fabrikant (figuur 2D).</li>
	<li>Centrifugeer bij 300 x g gedurende 20 s (bij 4 °C) om alle cellen te verzamelen. Voltooi de mechanische dissociatie door drie keer op en neer te pipetteren met een pipet van 1.000 μL (figuur 2E).</li>
	<li>Breng de cellen over naar vier buizen van 15 ml + zeven. Spoel de zeven af met 10 ml HBSS+/+ (figuur 2F).</li>
	<li>Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten (bij 4 °C) en verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet voorzichtig met 10 ml HBSS+/+ (figuur 2G).</li>
	<li>Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten (bij 4 °C) en verwijder het supernatant. Resuspeneer de pellet voorzichtig met 6 ml sorteerbuffer (stap 1.4) (figuur 2H).</li>
	<li>Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten (bij 4 °C) en verwijder het supernatant. Voeg 200 μL CD11b-microbead-oplossing (stap 1.5) per buis toe en resuspenseer voorzichtig (figuur 2I).</li>
	<li>Incubeer de buizen gedurende 15-20 min bij 4 °C. Resuspeneer de pellet voorzichtig met 6 ml sorteerbuffer (figuur 2I-J).</li>
	<li>Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten (bij 4 °C) en verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet voorzichtig met 8 ml sorteerbuffer (figuur 2K).</li>
	<li>Volg het POSSEL-programma op de separator (zie Materiaaltabel) om acht kolommen voor te bereiden. Breng cellen 1 ml bij 1 ml over op de kolom. Wacht tot alle cellen zijn doorgegeven voordat u nog een ml toevoegt. Elute CD11b+ cellen op steriele elutieplaat met 1 ml sorteerbuffer (figuur 2L).</li>
	<li>Pool CD11b+ cellen in een nieuwe buis van 50 ml (figuur 2M).</li>
	<li>Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten (bij 4 °C) en verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet voorzichtig met 10 ml koud microgliamedium (stap 1.6) (figuur 2N).</li>
	<li>Tel de CD11b+-cellen. Bij P8 zou men ~650.000 cellen per brein moeten verkrijgen. OPMERKING: In het huidige protocol werden de cellen geteld met behulp van een geautomatiseerde celteller (zie Tabel van materialen).</li>
	<li>Resuspensieer de cellen in koud microglia medium tot een eindconcentratie van 650.000-700.000 cellen/ml en dispense in celkweekplaten. OPMERKING: De 6-well platen zijn voor Western Blot (2 ml per put); de 12-well platen zijn voor RT-qPCR-analyse (1 ml per put) en de 96-well platen zijn voor fagocytische assay (250 μL per put); alle drie werden ze voor dit werk gebruikt. In dit manuscript worden de resultaten van de Western Blot-analyse echter niet getoond, maar het is mogelijk om met dit protocol te presteren.</li>
	<li>Zet de borden een nacht op 37 °C met 5% CO2. Vervang het medium voorzichtig met een pipet van 1.000 μL met voorverwarmd microgliamedium.</li>
	<li>Plaats de platen op 37 °C met 5% CO2 een nacht voor stimulatie. OPMERKING: Het isoleren van microglia van meer dan 36 pups en na P9 worden niet aanbevolen. Dit verhoogt het risico op besmetting en ophoping van celresten om microglia te activeren.</li>
</ol>4. Celstimulaties
<ol><li>Bereid stimulatiereagentia volgens tabel 3 met behulp van de in de handel verkrijgbare reagentia (zie materiaaltabel).</li>
	<li>Voeg het juiste volume toe aan elke gestimuleerde put. OPMERKING: Het juiste volume hangt af van de concentratie van de stimulus en de grootte van de put.</li>
	<li>Plaats de platen op 37 °C met 5% CO2tot het einde van de stimulatie op 6 h, 24 h of 48 h.</li>
	<li>Voor de Western Blot-analyse aspirateer je het supernatant en voeg je 50 μL eiwitlysisbuffer (zie Materiaaltabel) toe met een pipet. Kras met behulp van tips de onderkant van de plaat om de gelyseerde cellen los te maken en breng ze over naar buizen van 1,5 ml. Bewaren bij -80 °C. OPMERKING: De kweekplaten kunnen jarenlang bij -80 °C worden bewaard als het supernatant correct wordt aangezogen.</li>
	<li>Voor RT-qPCR-analyse 6,31 ademt u het supernatant op en slaat u de kweekplaten direct op bij -80 °C tot mRNA-extractie (stap 5).</li>
	<li>Voor de fagocytische test, zie stap 6.</li>
</ol>5. mRNA-extractie en RT-qPCR-analyse
<ol><li>Voer RNA-extractie, RT-PCR en RT-qPCR uit volgens het protocol van de fabrikant (zie materiaaltabel). Zie tabel 4 voor de primerreeksen 5,6,31.</li>
	<li>Voer rt-qPCR-analyse uit door het eerder gepubliceerde rapportte volgen 5.</li>
</ol>6. Fagocytische test
<ol><li>Stimuleer de cellen en voer fagocytische testen uit tijdens de laatste 3 uur van de stimulatie. Bijvoorbeeld, voor stimulatie van 6 uur, start de fagocytische assay na 3 h stimulatie; en voor stimulatie van 12 uur, start de fagocytische test 9 uur na het begin van de stimulatie.</li>
	<li>Bereken het aantal kralen dat nodig is om te bereiden, rekening houdend met de verhouding (1 cel: 50 kralen). Voor één put van de 96-well plaat zijn 8,1 x 106 kralen nodig. Bereid het kralenmengsel volgens tabel 5. OPMERKING: Vortex de voorraadflacon van de kralen voorzichtig voordat u deze aan het PBS / FBS-mengsel toevoegt.</li>
	<li>Incubeer gedurende 1 uur in een waterbad bij 37 °C. Vortex elke 10 min.</li>
	<li>Bereken het oplossingsvolume dat aan elke put moet worden toegevoegd. Voeg de oplossing toe en incubeer gedurende 3 uur.</li>
	<li>Spoel de putjes drie keer af met 1x PBS. Lees de fluorescentie-emissie bij 550 nm (Cy3-emissiegolflengte).</li>
</ol>7. Zuiverheid kwaliteitscontrole
<ol><li>Evalueer de zuiverheid van CD11b magnetische isolatie door flowcytometrie (FACS) (voor en na celsortering) en voer vervolgens de RT-qPCR uit.<ol><li>Tel de cellen en resuspendeer in FACS-buffer (PBS + 2 mM EDTA + 0,5% runderserumalbumine) om een verdunning van 10 x 106 cellen / ml te verkrijgen na stap 3,5 en stap 3,14.</li>
		<li>Na 15 minuten van de conventionele Fc-blokkeringvan 32,33, incubeer de cellen gedurende 15 minuten met levensvatbaarheidsonde (FVS780) en fluorofoor-geconjugeerde antilichamen tegen muis CD45, CD11b, CX3CR1, ACSA-2, O4 of hun overeenkomstige controle-isotypen32,33 in de door de fabrikanten aanbevolen concentratie (zie materiaaltabel).</li>
		<li>Was de cellen met FACS-buffer, fixeer en permeabiliseer met een in de handel verkrijgbare permeabilisatiekit (zie Materiaaltabel).</li>
		<li>Voer fc-blokkering opnieuw uit op de gepermeabiliseerde cellen en incubeer vervolgens met fluorofoor-geconjugeerd antilichaam tegen NeuN (zie materiaaltabel) of het controle-isotype gedurende 15 minuten.</li>
		<li>Voer FACS-analyse uit na het wassen met FACS-buffer.</li>
		<li>Na uitsluiting van de doubletten en de dode cellen op basis van respectievelijk morfologische parameters en FVS780-kleuring, selecteert u de gatingstrategie voor de oppervlakteexpressie van CX3CR1 (microglia), ACSA-2 (astrocyten), O4 (oligodendrocyten) en intracellulaire aanwezigheid van NeuN (neuronen) voor de analyse van het percentage positieve cellen.</li>
	</ol></li>
	<li>Na stap 5, extraheer mRNA en voer RT-qPCR uit om Itgam (CD11b), Cx3cr1, Olig2, Synaptophysin en Gfap mRNA te kwantificeren. Normaliseer Cq met Rpl13a-mRNA als reporter en voer een relatieve expressie uit voor Itgam-mRNA .</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Het huidige werk presenteert een primaire microgliale celcultuur met behulp van magnetisch gesorteerde CD11b + -cellen. Naast de microgliale functionele evaluatie (RT-qPCR en fagocytische assays) werd ook de microgliale cultuurzuiverheid bepaald.
Klassieke microgliacelculturen worden vaak gegenereerd uit P1- of P2-knaagdierneaatheren en co-cultuur met astrocyten gedurende ten minste 10 dagen. Microglia worden vervolgens mechanisch gescheiden met behulp van een orbitale shaker. De methode om mi...

Microglia zijn de macrofaagachtige cellen van het centrale zenuwstelsel die zijn afgeleid van erytropoëtische voorlopers van de dooierzak die migreren naar het neuro-epitheel tijdens de vroege embryonale ontwikkeling1. Afgezien van hun immuniteitsfuncties, spelen ze ook een belangrijke rol tijdens de neurologische ontwikkeling, met name voor synaptogenese, neuronale homeostase en myelinisatie2. Op volwassen leeftijd ontwikkelen microglia lange cellulaire processen om de omgeving continu te scannen. In het geval van homeostaserupturen zoals hersenletsel of hersenziekte, kunnen microglia hun morfologische uiterlijk veranderen om een amoeboïde vorm aan te nemen, naar het gewonde gebied te migreren, veel cytoprotectieve of cytotoxische factoren te verhogen en vrij te geven. Microglia hebben heterogene activeringstoestanden, afhankelijk van hun ontwikkelingsstadium en het type opgelopen letsel 3,4,5. In deze studie worden deze activeringstoestanden grofweg ingedeeld in drie verschillende fenotypen: pro-inflammatoire / fagocytische, ontstekingsremmende en immunoregulerende, rekening houdend met het feit dat de situatie in werkelijkheid waarschijnlijk complexer is6.
Het bestuderen van in vivo microgliale activering en screening op neuroprotectieve strategieën in vroege stadia van de ontwikkeling van de hersenen kan een uitdaging zijn vanwege (1) de kwetsbaarheid van dieren vóór het spenen en (2) het lage aantal microgliale cellen. Daarom worden in vitro studies op microglia veel gebruikt voor toxiciteit 7,8,9, neuroprotectieve strategieën 5,10,11,12,13,14 en co-culturen 15,16,17,18,19,20,21 . In vitro studies kunnen microgliale cellijnen, van stamcellen afgeleide microglia of primaire microgliacultuur gebruiken. Al deze benaderingen hebben voor- en nadelen en de keuze hangt af van de initiële biologische vraag. De voordelen van het gebruik van primaire microgliaculturen zijn de homogene genetische achtergrond, pathogeenvrije geschiedenis en controle van de tijd waarin de microglia worden gestimuleerd na de dood van het dier22.
In de loop der jaren werden verschillende methoden (flowcytometrie, schudden of magnetisch labelen) ontwikkeld voor het kweken van primaire microglia van knaagdieren, zowel pasgeborenen als volwassen 23,24,25,26,27,28,29. In het huidige werk wordt microglia-isolatie van muisneaatpups uitgevoerd met behulp van eerder beschreven magnetisch geactiveerde celsorteertechnologie met behulp van microbead-gecoate anti-muis CD11b 25,27,29. CD11b is een integrine-receptor die tot expressie komt aan het oppervlak van myeloïde cellen, waaronder microglia. Wanneer er geen ontstekingsuitdaging in de hersenen is, zijn bijna alle CD11b + -cellen microglia30. Vergeleken met andere eerder gepubliceerde methoden 23,24,25,26,27,28,29, balanceert het huidige protocol onmiddellijke ex vivo microgliale activeringsanalyses en gemeenschappelijke in vitro primaire microgliale cultuur. Microglia worden dus (1) geïsoleerd op postnatale dag (P)8 zonder myelineverwijdering, (2) gekweekt zonder serum en (3) blootgesteld aan siRNA, miRNA, farmacologische verbinding en/of ontstekingsprikkels slechts 48 uur na hersenisolatie. Elk van deze drie aspecten maakt het huidige protocol relevant en snel. Allereerst maakt het gebruik van pediatrische microglia het mogelijk om dynamische en reactieve levensvatbare cellen in cultuur te verkrijgen zonder dat een extra demyelinisatiestap nodig is die mogelijk de microgliale reactiviteit in vitro zou kunnen wijzigen. Het huidige protocol heeft als doel om zo dicht mogelijk bij de fysiologische omgeving van microglia te komen. Inderdaad, microglia komen nooit serum tegen, en dit protocol vereist ook niet het gebruik van serum. Bovendien voorkomt het blootstellen van microglia al 48 uur na het kweken dat ze hun fysiologische vermogens verliezen.

<table><tbody><tr><td>Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-116-246</td><td></td></tr><tr><td>Anti mouse CD11b BV421</td><td>Sony Biotechnology</td><td>1106255</td><td></td></tr><tr><td>Anti mouse CD45 BV510</td><td>Sony Biotechnology</td><td>1115690</td><td></td></tr><tr><td>Anti mouse CX3CR1 PE Cy7</td><td>Sony Biotechnology</td><td>1345075</td><td></td></tr><tr><td>Anti mouse NeuN PE</td><td>Milli-Mark</td><td>FCMAB317PE</td><td></td></tr><tr><td>anti mouse O4 Vio Bright B515</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-120-016</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm permeabilisatiekit</td><td>BD Biosciences</td><td>554655</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-634</td><td></td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td>Leica TCS SP8</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (10x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>14200067</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1644</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Celcultuur 12-well plaat, platte bodem + deksel</td><td>Dutscher</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Celcultuur 96-well plaat, platte bodem + deksel</td><td>Dutscher</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Falcon buizen 50 mL</td><td>Dutscher</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Fc blokkeringsreagens (Mouse CD16/32)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentie microscoop</td><td>Nikon ECLIPSE TE300</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Octo Dissociator met verwarmers</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x</td><td>Thermo Scientific</td><td>14065049</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x</td><td>Thermo Scientific</td><td>14185045</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR&nbsp;Green Supermix</td><td>Bio-rad</td><td>1725006CUST</td><td></td></tr><tr><td>Iscript c-DNA synthese</td><td>Bio-rad</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>Latex kralen, amine-gemodificeerd polystyreen, fluorescent rood</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2776-1mL</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysacchariden (LPS) uit&nbsp;Escherichia coli&nbsp;O55:B5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2880</td><td></td></tr><tr><td>Macrophage-SFM serum-vrij medium</td><td>Thermo Scientific</td><td>12065074</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA Stockoplossing</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers (70 &mu;m), 4 x 25 stuks</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-916</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG1 PE</td><td>Millipore</td><td>MABC002H</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG2a PE Cy7</td><td>Sony Biotechnology</td><td>2601265</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL1 beta</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-101-684</td><td></td></tr><tr><td>Multi-24 Column Blocks</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-691</td><td></td></tr><tr><td>MultiMACS Cell24 Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neural Tissue Dissociatie Kit - Papain</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>Nucleocounter NC-200</td><td>Chemometec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin RNA Plus XS</td><td>Macherey Nagel</td><td>740990.5</td><td></td></tr><tr><td>Nun EZFlip Top Conische Centrifugeerbuizen</td><td>Thermo Scientific</td><td>362694</td><td></td></tr><tr><td>OPTILUX Petri schotel - 100 x 20 mm</td><td>Dutscher</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>P&eacute;nicilline-streptomycine (10 000 U/mL)</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2b, k BV421</td><td>BD Biosciences</td><td>562603</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2b, k BV510</td><td>Sony Biotechnology</td><td>2603230</td><td></td></tr><tr><td>REA control (S) PE vio 615</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-616</td><td></td></tr><tr><td>REA control (S) Vio Bright B515</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-113-445</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse IFN-gamma Proteïne</td><td>R&amp;D System</td><td>485-MI</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse IL-10 Proteïne</td><td>R&amp;D System</td><td>417-ML</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse IL-4 Proteïne</td><td>R&amp;D System</td><td>404-ML</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>Viability probe (FVS780)</td><td>BD Biosciences</td><td>565388</td><td></td></tr></tbody></table>

magnetische isolatie van microgliale cellen van neonate muis voor primaire celculturen

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Microglia, als hersenbewoner macrofagen, zijn fundamenteel voor verschillende functies, waaronder reactie op omgevingsstress en hersenhomeostase. Microglia kunnen een groot spectrum van activeringsfenotypen aannemen. Bovendien worden microglia die het pro-inflammatoire fenotype ondersteunen geassocieerd met zowel neurologische als neurodegeneratieve aandoeningen. In vitro studies worden veel gebruikt in onderzoek om potentiële therapeutische strategieën in specifieke celtypen te evalueren. In deze context is het bestuderen van microgliale activering en neuro-inflammatie in vitro met behulp van primaire microgliale culturen relevanter dan microgliale cellijnen of van stamcellen afgeleide microglia. Het gebruik van sommige primaire culturen kan echter lijden aan een gebrek aan reproduceerbaarheid. Dit protocol stelt een reproduceerbare en relevante methode voor om microglia magnetisch te isoleren van pasgeboren pups. Microgliale activering met behulp van verschillende stimuli na 4 h en 24 h door mRNA-expressiekwantificering en een Cy3-kraal fagocytische assay wordt hier gedemonstreerd. Het huidige werk zal naar verwachting een gemakkelijk reproduceerbare techniek bieden voor het isoleren van fysiologisch relevante microglia uit juveniele ontwikkelingsstadia.

Microglia is de in het CZS verblijvende macrofaag die wordt geactiveerd wanneer deze wordt blootgesteld aan milieu-uitdagingen (trauma, toxische moleculen, ontsteking)4,5,6,34 (figuur 3A). In vitro studies op microglia worden vaak gebruikt om cel-autonome mechanismen gerelateerd aan die omgevingsuitdagingen te evalueren en de activeringstoestand na farmaco...

Primaire microgliaculturen worden vaak gebruikt om nieuwe ontstekingsremmende moleculen te evalueren. Het huidige protocol beschrijft een reproduceerbare en relevante methode om microglia magnetisch te isoleren van pasgeboren pups.

Magnetische isolatie van microgliale cellen van neonate muis voor primaire celculturen

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

Dit protocol stelt ons in staat om microglia te kweken in omstandigheden die de in vivo kenmerken nauw nabootsen. Met behulp van magnetische celsorteertechnologie stelt ons protocol ons in staat om microglia slechts twee dagen in vitro te stimuleren, zonder serum in het kweekmedium te gebruiken. Gebruik om te beginnen een kleine schaar om de huid van de nek naar de neus te knippen, volgens de sagittale hechting van 15 tot 20 millimeter.Plaats de uiteinden met het foramen magnum parallel aan de schedel. Snijd van elke kant naar de ogen. Knip tussen de ogen met een kleine schaar om de schedel en de hersenen van het hoofd los te maken.Pak met twee tangen de schedel dicht bij de olfactorische bollen en scheur voorzichtig de schedel. Verwijder met een scheermesje het cerebellum en de reukbol en snijd de hersenen in twee stukken. Plaats de hersenstukken in een petrischaaltje met 40 milliliter HBSS zonder calcium en magnesium.Bereid dissociatiemengsel volgens deze tabel. Breng 12 hersenstukken over in een C-buis voor een totaal gewicht van 1,2 gram per dissociatiebuis. Plaats vervolgens C-buizen op de dissociater met verwarming.Start het geoptimaliseerde NTDK-programma in de dissociater. Centrifugeer gedurende 20 seconden. Voltooi de mechanische dissociatie door drie keer te pipetteren.Breng de cellen over naar vier buizen van 15 milliliter met bevestigde zeven. Spoel de zeven af met 10 milliliter HBSS met calcium en magnesium. Centrifugeer gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant met een pipet van 10 milliliter.Voeg voorzichtig 10 milliliter HBSS toe met calcium en magnesium en suspensie de pellet opnieuw. Nogmaals, centrifugeer en verwijder het supernatant. Suspensie de pellet opnieuw met zes milliliter sorteerbuffer.Herhaal de centrifugatie en gooi het supernatant weg. Voeg vervolgens 200 microliter CD11b microbead-oplossing toe en incubeer de buizen gedurende 15 tot 20 minuten bij vier graden Celsius. Na incubatie wordt de pellet opnieuw gesuspendeerd met zes milliliter sorteerbuffer.Herhaal de centrifugatie en suspensie de pellet opnieuw met acht milliliter sorteerbuffer. Volg vervolgens het Possel-programma op het scheidingsteken om acht kolommen voor te bereiden. Laat de cellen door de kolom lopen door één milliliter celsuspensie per keer toe te voegen.Eluteer met één milliliter sorteerbuffer CD11b-positieve cellen op een steriele elutieplaat. Pool de cellen in een buis van 50 milliliter. Centrifugeer en suspensie de pellet opnieuw met 10 milliliter koud microgliamedium.Tel de CD11b-positieve cellen. Suspensieer de cellen opnieuw in koud microgliamedium om een uiteindelijke concentratie van 650.000 tot 700.000 cellen per milliliter te krijgen. Doseer de suspensie in celkweekplaten.Incubeer de platen een nacht bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Vervang de volgende dag het medium door voorverwarmd microgliamedium en herhaal de nachtelijke incubatie. Stimuleer de cellen vóór deze stap en voer fagocytische testen uit tijdens de laatste drie uur van de stimulatie.Bereken het aantal kralen volgens deze tabel in een verhouding van 50 kralen per cel. Bereid het kralenmengsel. Incubeer de buis gedurende een uur in een waterbad bij 37 graden Celsius.Vortex elke 10 minuten. Voeg aan elke put het berekende volume van de kraaloplossing toe en incubeer gedurende drie uur. Met behulp van deze aanpak werd de fagocytische activiteit van microglia geëvalueerd na stimulatie door pro-inflammatoire factoren, zoals interleukine-1 bèta, plus interferon gamma of lipopolysacchariden.Na stimulatie gedurende zes tot 24 uur werden fluorescerende Cy3 microglia-kralen geanalyseerd met een confocale microscoop. Na zes uur beginnen microglia cy3-kralen alleen te fagocyteren onder interleukine-1 bèta plus interferon gamma conditie. Na 24 uur was er een toename van Cy3-fluorescentie voor beide soorten stimulatie, wat een verhoogde fagocytische activiteit benadrukte.De zuiverheid van microgliale cultuur werd verhoogd door flowcytometrie, die een toename van de levensvatbaarheid van cellen na sortering liet zien. Met behulp van flowcytometrie en RT-qPCR werden celpopulatiemarkers geanalyseerd voor en na het sorteren van CD11b-positieve cellen uit muizenhersenen op postnatale dag acht. Deze analyses onderscheidden verschillende hersencelpopulaties, zoals CX3CR135 voor microglia, O4 of OLIG2 voor oligodendrocyten, NeuN of synaptofysine, voor neuronen en ACSA-2, of GFAP voor astrocyten.Na celsortering met behulp van CD11b-antilichaam werden alleen microglia verkregen. Het is belangrijk om heel voorzichtig te pipetteren tijdens het toevoegen van de suspensie aan de kolom om verstopping te voorkomen en mechanische celdood te voorkomen. Na deze methode kunnen transcriptomische proteomics, zoals westers bloed of Luminex, en zelfs immunochemie worden uitgevoerd om het effect van microgliale stimulatie te zien.

magnetic-isolation-microglial-cells-from-neonate-mouse-for-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Het isoleren van primaire microglia van de cellulaire heterogeniteit van de hersenen is essentieel om hun rol te onderzoeken in zowel fysiologische en pathologische omstandigheden. Dit protocol beschrijft een mechanische isolatie en gemengde celkweek techniek die hoge opbrengst en een hoge zuiverheid, levensvatbare primaire microgliale cellen...

Primaire Microglia Isolatie van Mixed gliale celculturen van neonatale rat hersenweefsel

In this video, we describe a protocol for isolating CD11b cells, including microglia, from mouse pup brains using magnetic-activated cell sorting. The brain tissues are homogenized to obtain single-cell suspensions, which are incubated with anti-CD11b antibody-coated microbeads, followed by a magnetic column-based separation to purify the CD11b+ cell population.

Magnetic Isolation of Microglia from Mouse Pup Brains

This video demonstrates a protocol for extracting microglial cells from demyelinating lesions in mouse brains using magnetic cell sorting. The protocol involves dissecting the lesioned brain tissue containing microglial cells, treating the tissue with specific enzymes to obtain a single-cell suspension, and utilizing microglial receptor-specific magnetic beads to isolate the microglial cells.

Isolating Microglia from Mouse Brain Demyelinating Lesions Using Magnetic Activated Cell Sorting

The video demonstrated the method of isolating and culturing cells from a neonatal mouse brain. It involved enzymatic and mechanical dissociation of the brain, followed by culturing in growth media lacking neuronal growth factor to obtain a mixed glial population.

Obtaining a Mixed Glial Cell Culture from a Neonatal Mouse Brain

Een sleutel tot succesvolle onderzoek van microglia biologie is het behoud van microglia immunofunction ex vivo tijdens isolatie van CZS-weefsel. Isoleren microglia via roterende schudden resulteert in zeer zuivere en immunofunctional celculturen zoals beoordeeld door fluorescerende beeldvorming, immunocytochemie, en ELISA na microglia-activatie met de pro-inflammatoire stimuli lipopolysaccharide (LPS) en Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolatie van corticale Microglia met Conserven immunofenotype en functionaliteit van Muriene Pasgeborenen

Hier presenteren we een protocol microglia van postnatale muizen pups isolaat (dag 1) voor in vitro experimenten. Deze geïmproviseerde winmethode genereert zowel hoge opbrengst en zuiverheid, een significant voordeel boven alternatieve werkwijzen die breed experimenten met het oog op toelichting van microgliale biologie maakt.

Snelle en Geraffineerde CD11b magnetische Isolatie van Primary Microglia met verbeterde zuiverheid en veelzijdigheid

Een protocol voor de isolatie van primaire microglia vanuit lymfkliertest brains wordt gepresenteerd. Deze techniek helpt bij het bevorderen van het huidige begrip van neurologische aandoeningen. Dichtheid kleurovergang centrifugeren en magnetische scheiding worden gecombineerd om voldoende opbrengst van een zeer zuivere monster. Voorts schetsen we de stappen voor de karakterisering van microglia.

Karakterisering en isolatie van de primaire Microglia muis door dichtheid kleurovergang centrifugeren

Inspanningen om microglial functie in detail te begrijpen hebben belemmerd door het ontbreken van microglial cultuur modellen die de eigenschappen van volwassen in vivo microglia recapituleren. Dit protocol beschrijft een aanpak van het isolement en cultuur ontworpen om robuust voortbestaan van zeer vertakte volwassen rat microglia voorwaarden gedefinieerd-medium.

Isolatie en cultuur van knaagdier Microglia ter bevordering van een dynamische vertakt morfologie in serumvrij Medium

Hier presenteren we een protocol om primaire microglia te isoleren en te zuiveren in diermodellen van demyeliniserende ziekten, met behulp van kolomvormige magnetisch geactiveerde celsortering.

Isolatie van primaire microglia van muizen door magnetisch geactiveerde celsortering in diermodellen van demyelinisatie

We beschrijven een protocol voor het isoleren van microgliacellen uit de hypothalamus van de muis (of gelijkwaardige kleine hersenstructuren) met behulp van magnetisch geactiveerde celsortering (MACS), in een relatief korte tijd. De MACS-gesorteerde hypothalamische microglia kunnen worden gebruikt voor ex vivo-analyse en kunnen worden geplateerd om in vitro-assays uit te voeren.

Isolatie van hypothalamische microglia uit vers doorbloede volwassen muizenhersenen door magnetisch geactiveerde celsortering  

Leer magnetische isolatie van microglia uit neonatale muizenhersenen voor primaire celculturen. Deze methode waarborgt hoge zuiverheid en levensvatbaarheid, essentieel voor neuro-inflammatieonderzoek.

Magnetische isolatie van microgliale cellen van neonate muis voor primaire celculturen

Meer video's verkennen