Magnetische isolatie van microgliale cellen van neonate muis voor primaire celculturen
25 juli 2022
Primaire microgliaculturen worden vaak gebruikt om nieuwe ontstekingsremmende moleculen te evalueren. Het huidige protocol beschrijft een reproduceerbare en relevante methode om microglia magnetisch te isoleren van pasgeboren pups.
Dit protocol stelt ons in staat om microglia te kweken in omstandigheden die de in vivo kenmerken nauw nabootsen. Met behulp van magnetische celsorteertechnologie stelt ons protocol ons in staat om microglia slechts twee dagen in vitro te stimuleren, zonder serum in het kweekmedium te gebruiken. Gebruik om te beginnen een kleine schaar om de huid van de nek naar de neus te knippen, volgens de sagittale hechting van 15 tot 20 millimeter.
Plaats de uiteinden met het foramen magnum parallel aan de schedel. Snijd van elke kant naar de ogen. Knip tussen de ogen met een kleine schaar om de schedel en de hersenen van het hoofd los te maken.
Pak met twee tangen de schedel dicht bij de olfactorische bollen en scheur voorzichtig de schedel. Verwijder met een scheermesje het cerebellum en de reukbol en snijd de hersenen in twee stukken. Plaats de hersenstukken in een petrischaaltje met 40 milliliter HBSS zonder calcium en magnesium.
Bereid dissociatiemengsel volgens deze tabel. Breng 12 hersenstukken over in een C-buis voor een totaal gewicht van 1,2 gram per dissociatiebuis. Plaats vervolgens C-buizen op de dissociater met verwarming.
Start het geoptimaliseerde NTDK-programma in de dissociater. Centrifugeer gedurende 20 seconden. Voltooi de mechanische dissociatie door drie keer te pipetteren.
Breng de cellen over naar vier buizen van 15 milliliter met bevestigde zeven. Spoel de zeven af met 10 milliliter HBSS met calcium en magnesium. Centrifugeer gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant met een pipet van 10 milliliter.
Voeg voorzichtig 10 milliliter HBSS toe met calcium en magnesium en suspensie de pellet opnieuw. Nogmaals, centrifugeer en verwijder het supernatant. Suspensie de pellet opnieuw met zes milliliter sorteerbuffer.
Herhaal de centrifugatie en gooi het supernatant weg. Voeg vervolgens 200 microliter CD11b microbead-oplossing toe en incubeer de buizen gedurende 15 tot 20 minuten bij vier graden Celsius. Na incubatie wordt de pellet opnieuw gesuspendeerd met zes milliliter sorteerbuffer.
Herhaal de centrifugatie en suspensie de pellet opnieuw met acht milliliter sorteerbuffer. Volg vervolgens het Possel-programma op het scheidingsteken om acht kolommen voor te bereiden. Laat de cellen door de kolom lopen door één milliliter celsuspensie per keer toe te voegen.
Eluteer met één milliliter sorteerbuffer CD11b-positieve cellen op een steriele elutieplaat. Pool de cellen in een buis van 50 milliliter. Centrifugeer en suspensie de pellet opnieuw met 10 milliliter koud microgliamedium.
Tel de CD11b-positieve cellen. Suspensieer de cellen opnieuw in koud microgliamedium om een uiteindelijke concentratie van 650.000 tot 700.000 cellen per milliliter te krijgen. Doseer de suspensie in celkweekplaten.
Incubeer de platen een nacht bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Vervang de volgende dag het medium door voorverwarmd microgliamedium en herhaal de nachtelijke incubatie. Stimuleer de cellen vóór deze stap en voer fagocytische testen uit tijdens de laatste drie uur van de stimulatie.
Bereken het aantal kralen volgens deze tabel in een verhouding van 50 kralen per cel. Bereid het kralenmengsel. Incubeer de buis gedurende een uur in een waterbad bij 37 graden Celsius.
Vortex elke 10 minuten. Voeg aan elke put het berekende volume van de kraaloplossing toe en incubeer gedurende drie uur. Met behulp van deze aanpak werd de fagocytische activiteit van microglia geëvalueerd na stimulatie door pro-inflammatoire factoren, zoals interleukine-1 bèta, plus interferon gamma of lipopolysacchariden.
Na stimulatie gedurende zes tot 24 uur werden fluorescerende Cy3 microglia-kralen geanalyseerd met een confocale microscoop. Na zes uur beginnen microglia cy3-kralen alleen te fagocyteren onder interleukine-1 bèta plus interferon gamma conditie. Na 24 uur was er een toename van Cy3-fluorescentie voor beide soorten stimulatie, wat een verhoogde fagocytische activiteit benadrukte.
De zuiverheid van microgliale cultuur werd verhoogd door flowcytometrie, die een toename van de levensvatbaarheid van cellen na sortering liet zien. Met behulp van flowcytometrie en RT-qPCR werden celpopulatiemarkers geanalyseerd voor en na het sorteren van CD11b-positieve cellen uit muizenhersenen op postnatale dag acht. Deze analyses onderscheidden verschillende hersencelpopulaties, zoals CX3CR135 voor microglia, O4 of OLIG2 voor oligodendrocyten, NeuN of synaptofysine, voor neuronen en ACSA-2, of GFAP voor astrocyten.
Na celsortering met behulp van CD11b-antilichaam werden alleen microglia verkregen. Het is belangrijk om heel voorzichtig te pipetteren tijdens het toevoegen van de suspensie aan de kolom om verstopping te voorkomen en mechanische celdood te voorkomen. Na deze methode kunnen transcriptomische proteomics, zoals westers bloed of Luminex, en zelfs immunochemie worden uitgevoerd om het effect van microgliale stimulatie te zien.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een reproduceerbaar protocol voor het isoleren van primaire microglia uit neonatale muizen, met behulp van magnetische sorteertechnologie. De methodologie maakt het mogelijk om microglia te kweken onder omstandigheden die de in vivo kenmerken nauwkeurig nabootsen, wat inzicht biedt in hun fagocytische activiteit.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Microglia-onderzoek
Achtergrond
- Microglia spelen een cruciale rol in het centrale zenuwstelsel.
- Het begrijpen van de microgliële reacties op stimuli is belangrijk voor onderzoek naar neuroinflammatie.
- Magnetische celisolatie biedt een levensvatbare strategie voor het isoleren van microglia.
- Eerdere protocollen kunnen tekortschieten in reproduceerbaarheid of relevantie voor in vivo condities.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een protocol voor het efficiënt isoleren en kweken van primaire microglia.
- Het mogelijk maken van de beoordeling van microgliale reacties op inflammatoire stimuli.
- Het evalueren van de zuiverheid en levensvatbaarheid van geïsoleerde microglia.
Gebruikte methoden
- Celkweekmethode die gebruikmaakt van magnetische sortering om microglia te isoleren uit pasgeboren muizen.
- Het biologische model omvat corticale microglia van pasgeboren pups.
- Immunochemie en flowcytometrie werden aangewend om de celzuiverheid te beoordelen.
- Belangrijke stappen omvatten dissectie, enzymatische dissociatie en sortering met behulp van CD11b-microbeads.
- Fagocytose-assays evalueerden de microgliële activiteit als reactie op pro-inflammatoire factoren.
Belangrijkste resultaten
- Microglia vertoonden een verhoogde fagocytische activiteit als reactie op specifieke inflammatoire condities.
- Een verhoogde celviabiliteit en zuiverheid werden bevestigd via flowcytometrie na sortering.
- Confocale microscopie bracht uitgesproken verschillen in fagocytische activiteit in kaart op basis van de duur van de stimulatie.
- De methode verduidelijkte de verschillen tussen diverse hersencelpopulaties.
Conclusies
- Deze studie stelt een betrouwbare methode vast voor het isoleren van microglia uit muizen voor in vitro experimenten.
- De bevindingen verbeteren het begrip van de functies van microglia en hun reacties op inflammatie.
- Dit protocol dient als basis voor verdere onderzoeken naar neuroinflammatoire processen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Dit protocol biedt een reproduceerbare methode voor het isoleren van primaire microglia uit neonatale muizen, wat fysiologisch relevante in vitro modellen mogelijk maakt voor neuro-inflammatoir onderzoek. Door een hoge zuiverheid en viabiliteit te bereiken via magnetische CD11b-gebaseerde sortering, ondersteunt deze aanpak mechanistische risicoreductie bij doelwitvalidatie en assayontwikkeling voor aandoeningen van het centraal zenuwstelsel. De methode verhoogt het voorspellend vertrouwen bij preklinische screening door de microgliale functionaliteit en activatietoestanden te behouden die nauw aansluiten bij in vivo condities.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar microgliële activatiefenotypes en pro-inflammatoire responsen die relevant zijn voor hypothesen over neuro-ontwikkelingsstoornissen en neurodegeneratieve ziekten.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerd, serumvrij culturesysteem dat de biologische variabiliteit vermindert en consistente studies naar target engagement ondersteunt.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatief beoordeelbare fagocytische en transcriptionele outputs voor het screenen van modulerende verbindingen in inflammatoire pathways.
- Operationele waarde: Levert een schaalbare, reproduceerbare isolatieworkflow die compatibel is met multi-well plating en tijdreeksstimulatie-assays.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt ziekterelevante modellering door het behoud van microgliële identiteitsmarkers (bijv. CX3CR1) en functionele responsen op stimuli zoals IL-1β/IFN-γ en LPS.
- Operationele waarde: Faciliteert translationele continuïteit van ontdekking naar preklinische validatie via gestandaardiseerde zuivering en functionele validatie middels flowcytometrie en confocale microscopie.
Integratie van pipeline & workflow
De methode past binnen het continuüm van de vroege ontdekkingsfase en levert gevalideerde primaire cellen voor hypotheseonderzoek, assay-gereedheid en datageneratie die bijdragen aan de identificatie van lead-verbindingen en preklinische risicobeoordeling.
- Discovery Biology: Maakt mechanistische risicoreductie mogelijk door microglia te isoleren om de betrokkenheid van signaalpaden bij neuroinflammatoire processen te verduidelijken.
- Screening: Levert assay-klare cellen met kwantificeerbare fagocytische en mRNA-readouts voor compound-screening en studies naar target-modulatie.
- Analytics: Ondersteunt kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen, waaronder fagocytische activiteit (opname van Cy3-beads) en genexpressie (RT-qPCR) voor comparatieve analyse van condities.
- Translationeel Onderzoek: Handhaaft fenotypische getrouwheid en marker-expressie, wat bijdraagt aan biomarker-afstemming en continuïteit in preklinische validatie.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar isolatieplatform dat toepasbaar is op meerdere projecten die microglia-functies in CZS-ziektemodellen bestuderen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van targets door mechanistische ambiguïteit te verminderen via fysiologisch relevante microgliamodellen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie via magnetische sortering en gedefinieerde kweekcondities, waardoor batch-to-batch variabiliteit wordt geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming door betrouwbare preklinische gegevens te leveren over targetmodulatie en inflammatoire respons-profielen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van CNS-targets mogelijk op basis van gevalideerde microglia-interactie en functionele outputgegevens.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in neonatale weefseldissectie, enzymatische dissociatie en magnetische cel-sorteertechnieken.
- Afhankelijk van toegang tot cel-sorters (bijv. MACS), centrifuges en een steriele infrastructuur voor celkweek.
- Vereist gestandaardiseerde bereiding van reagentia en incubatietijden om een consistente opbrengst en levensvatbaarheid van CD11b-positieve cellen te waarborgen.
- Aanpassing aan andere modelsystemen of ontwikkelingsstadia kan optimalisatie van de dissociatie- en sorteerparameters vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten mechanische gevoeligheid tijdens de passage door de kolom, wat voorzichtig pipetteren noodzakelijk maakt om verstoppingen en celbeschadiging te voorkomen.
