Software-ondersteunde kwantitatieve meting van artrose subchondrale botdikte
18 maart 2022
Dit methodologieartikel presenteert een softwarematig kwantitatief meetprotocol om histologische subchondrale botdikte in muriene artrosekniegewrichten en normale kniegewrichten als controles te kwantificeren. Dit protocol is zeer gevoelig voor subtiele verdikking en is geschikt voor het detecteren van vroege artrose subchondrale botveranderingen.
Subchondrale botverdikking, of sclerose, is een van de kenmerken van artrose, zowel in diermodellen als bij mensen. Momenteel wordt de ernst van histologische subchondrale botverdikking meestal bepaald door visuele schatting op basis van semi-kwantitatieve beoordelingssystemen. Deze studie heeft tot doel een reproduceerbaar en gemakkelijk uit te voeren protocol te ontwikkelen om de subchondrale botdikte kwantitatief te meten in een muismodel van knie-artrose geïnduceerd door destabilisatie van de mediale meniscus.
We creëerden een muismodel voor knieartrose door chirurgische destabilisatie van de mediale meniscus die wordt uitgevoerd onder chirurgische microscoop en de steriele toestand. Het histologische proces van muiskniegewrichten omvat weefselfixatie, ontkalking, trimmen, verwerken, inbedding, sectie en kleuring, gevolgd door microscopische beeldvorming. De afbeelding op het scherm toont artrose van de knie van muizen met gewrichtskraakbeenlaesies, osteofytvorming en subchondrale botverdikking Kwantitatieve meting van artrose subchondraal bot met ImageJ-software.
Download ImageJ van imagej.nih.gov/ij. Open ImageJ. Klik op het tabblad Bestand en klik vervolgens op de optie Openen om de histologische afbeelding te openen.
Zoek het adres van de bestandsmap, selecteer het afbeeldingsbestand en klik op Openen. Gebruik het gereedschap rechte lijn om één lengte-eenheid, een micrometer, te schetsen en klik op Analyseren en vervolgens op Schaal instellen. Stel de bekende afstand en de pixelverhouding in op één en klik op Ok.ImageJ kan de pixellengte omzetten naar de eenheidslengte, een micrometer.
Stel de gemeten factor in op gebied. Klik op Analyseren en vervolgens op Meting instellen en schakel het selectievakje Gebied en Limiet tot drempel in onder het nieuwe venster. Met deze stap stelt u ImageJ in om het parametergebied binnen de geselecteerde drempelwaarde te meten.
Gedefinieerd totaal subchondraal botgebied van belang zoals getoond in radio die de subchondrale corticale plaat en een deel van het onderliggende trabeculaire bot naast corticale plaat bedekt. Schets de omtrek van het totale subchondrale botgebied met behulp van het selectiegereedschap onder het hoofdvenster van de afbeelding. De selectietools geven het systeem een drempel om de meting te beperken nadat de drempel is geselecteerd.
Klik op Analyseren en vervolgens op Meten. Er wordt een resultaatvenster met gebiedsmeting geopend. Klik op Bewerken en vervolgens op Buiten wissen om het gebied buiten het totale subchondrale botgebied uit te sluiten.
Alleen het totale subchondrale botgebied is zichtbaar nadat u op de optie Buiten wissen hebt geklikt. Klik op Afbeelding en vervolgens op Aanpassen en vervolgens op Kleurdrempel om het drempelkleurvenster te openen. Klik op Origineel onder aan het drempelkleurvenster om de afbeelding terug te zetten naar de oorspronkelijke status.
Gebruik selectiegereedschappen om een klein vakje in het botsubstantiegebied te tekenen. Klik op Voorbeeldoptie onder aan het venster om het gebied van de botsubstantie te definiëren. Het geselecteerde gebied van de botsubstantie wordt rood.
Klik op Selecteren onder aan het drempelkleurvenster om de drempelwaarde voor gebiedsmeting te maken. Klik op Analyseren en vervolgens op Meten in het hoofdmenu van ImageJ. Het meetresultaat van het botsubstantiegebied wordt weergegeven in het resultaatvenster.
Sla de gegevens van het totale subchondrale botgebied en het botsubstantiegebied op. De inter- en intraobservervariabiliteit en de reproduceerbaarheid werden bepaald door pearson's correlatiecoëfficiëntanalyse. De significantie van het verschil tussen studiegroepen werd bepaald met behulp van Student t-test of one-way ANOVA, gevolgd door post-hoc test.
Deze figuur toont de bovenste en onderste panelen. Het bovenste paneel toont fotomicrografieën van histologische beelden van Sham- en DMM-groepen voor visuele schattingsgebaseerde subchondrale botgradatie. De onderste panelen tonen fotomicrografieën van histologische beelden van Sham- en DMM-groepen voor ImageJ-ondersteunde, kwantitatieve subchondrale botmeting.
De vakken die zijn omlijnd met een gestippelde gele lijn die is gemaakt met Adobe Illustrator, definiëren het totale interessegebied van subchondraal bot. Het gebied van botsubstantie in de dozen is oranje gemarkeerd. Opmerkelijke subchondrale botverdikking in de mediale femorale condylus en het mediale tibiale plateau kan worden gekwantificeerd met behulp van ImageJ-software.
In deze figuur wijzen interobservervariatietests op een hoge reproduceerbaarheid tussen waarnemers voor zowel de eerste als de tweede meting van subchondrale botdikte in het mediale tibiale plateau en de mediale femorale condylusgebieden van belang. In deze figuur wijzen intraobservervariatietests op een hoge reproduceerbaarheid tussen de eerste en tweede subchondrale botdiktemetingen in het mediale tibiale plateau en de mediale femorale condylusgebieden van belang. Tabel 1 toont een vergelijkende analyse van de reproduceerbaarheid tussen de visuele grading en imageJ-geassisteerde kwantitatieve meting van subchondrale botdikte.
Correlatiecoëfficiënttest suggereert dat de kwantitatieve meting relatief reproduceerbaarder was dan het visuele beoordelingssysteem. Deze figuur toont vergelijkende gevoeligheidsanalyse van visuele gradatie en ImageJ-geassisteerde kwantitatieve meting van subchondrale botdikte in de mediale femorale condylus en het mediale tibiale plateau. De histologische beelden voor visuele schattingsgradatie werden verdeeld in drie groepen.
De kwantitatieve subchondrale botdiktewaarde van alle drie de waarnemers voor de DMM-beelden met een visuele score van nul waren significant hoger dan die van de Sham-afbeeldingen met een visuele score van nul, wat aangeeft dat de kwantitatieve meting gevoeliger is dan de visuele gradatie voor milde subchondrale botverdikking. Het nieuw ontwikkelde protocol voor kwantitatieve meting van artrose subchondrale botdikte is gevoeliger voor milde subchondrale botveranderingen dan de veelgebruikte visuele beoordelingssystemen. En dit protocol kan worden gebruikt voor het detecteren van vroege artrose subchondrale botveranderingen en voor het beoordelen van de in vivo werkzaamheid van artrosebehandelingen in combinatie met artrose kraakbeen grading.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit methodologieartikel presenteert een software-ondersteund kwantitatief meetprotocol om de histologische dikte van het subchondrale bot te kwantificeren in artrotische kniegewrichten van muizen en normale kniegewrichten als controles. Het protocol is ontworpen om zeer gevoelig te zijn voor subtiele verdikkingen, waardoor het geschikt is voor het detecteren van vroege artrotische veranderingen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Artroseonderzoek
- Histologie
Achtergrond
- Verdikking van het subchondrale bot is een kenmerk van artrose.
- Huidige methoden zijn afhankelijk van visuele schatting en semi-kwantitatieve gradatie.
- Een reproduceerbaar protocol is noodzakelijk voor een nauwkeurige meting.
- De studie maakt gebruik van een muismodel geïnduceerd door destabilisatie van de mediale meniscus.
Doel van de studie
- Om een kwantitatief meetprotocol te ontwikkelen voor de dikte van het subchondrale bot.
- Om de gevoeligheid voor het detecteren van vroege osteoarthritische veranderingen te verbeteren.
- Om een gestandaardiseerde methode te bieden voor toekomstig onderzoek.
Gebruikte methoden
- Chirurgische destabilisatie van de mediale meniscus bij muizen.
- Histologische processen, waaronder fixatie, decalcificatie en kleuring.
- Microscopische beeldvorming voor analyse.
- Kwantitatieve meting met behulp van ImageJ-software.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle creatie van een muismodel voor knieartrose.
- Demonstratie van gewrichtskraakbeenschade en osteofytvorming.
- Kwantitatieve beoordeling van de verdikking van het subchondrale bot is bereikt.
- Het protocol vertoont een hoge gevoeligheid voor veranderingen in de botdikte.
Conclusies
- Het ontwikkelde protocol maakt een nauwkeurige meting van de dikte van het subchondrale bot mogelijk.
- Deze methode kan het begrip van de progressie van artrose verbeteren.
- Toekomstige studies kunnen dit protocol gebruiken voor verder onderzoek naar artrose.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Kwantitatieve meting van de dikte van het subchondrale bot vult een kritiek gat in de targetvalidatie voor artrose door subjectieve visuele gradering te vervangen door reproduceerbare, software-ondersteunde analyse. Deze aanpak vergroot het voorspellende vertrouwen in preklinische modellen door de detectie mogelijk te maken van vroege, subtiele structurele veranderingen die voorafgaan aan openlijke kraakbeendegradatie. De methode ondersteunt het mechanistische de-risking van therapeutica voor artrose door een gestandaardiseerde, transleerbare biomarker te bieden voor botremodeleringspaden.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken die gericht zijn op biologische processen voor de remodellering van het subchondrale bot bij artrose.
- Operationele waarde: Levert kwantitatieve, reproduceerbare resultaten voor de functionele validatie van targets in murine OA-modellen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de triage van portfolio's door milde botverdikking te detecteren die onzichtbaar is voor visuele graderingssystemen.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid voor analyse: Bereidt gevalideerde histologische monsters voor op gestandaardiseerde high-throughput analyse met behulp van ImageJ.
- Kwantitatieve output: Genereert continue, drempelonafhankelijke metingen van het subchondrale botareaal voor compound-screening.
- Schaalbaarheid: Maakt hergebruik van het platform mogelijk in OA-studies met consistente definities van het region-of-interest in de mediale femorale condyl en het tibiale plateau.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor de ziekte: Komt overeen met de menselijke OA-pathologie, waarbij subchondrale sclerose een kenmerk is van de progressie.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen discovery- en preklinische workflows door een biomarker te bieden die compatibel is met kraakbeengradering.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Ondersteunt go/no-go-criteria op basis van kwantitatieve veranderingen in de botdikte in studies naar behandelingseffectiviteit.
Integratie van Pijplijn & Workflow
Het protocol past binnen het continuüm van artrose-onderzoek, van doelwitvalidatie via lead-optimalisatie tot preklinische effectiviteitsbeoordeling, in het bijzonder wanneer botremodellering een mechanistische focus is.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten van targets die betrokken zijn bij subchondrale bot sclerose en mechanotransductie.
- Screening: Levert assay-klare, reproduceerbare kwantitatieve output voor het evalueren van compound-effecten op de botdikte.
- Analytiek: Maakt statistische vergelijking van de botdikte tussen groepen mogelijk met behulp van de Pearson-correlatie en t-test/ANOVA zoals beschreven.
- Translationeel onderzoek: Verbindt met preklinische validatie door een biomarker aan te bieden die klinische OA-progressiemetrieken weerspiegelt.
- Enterprise-hergebruik: Vestigt een herbruikbare workflow voor histologische analyse die toepasbaar is op meerdere OA-modellen en behandelingsarmen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van het target door ambiguïteit bij de beoordeling van het botfenotype te verminderen.
- Operationele waarde: Standaardiseert metingen tussen verschillende waarnemers en sessies met een lage intra- en intervariabiliteit.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege structurele veranderingen te detecteren die bij semi-kwantitatieve scoring over het hoofd worden gezien.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde voortgang mogelijk op basis van gevoelige, kwantitatieve eindpunten van botremodellering.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in histologische preparatie en drempelwaardeanalyse met ImageJ.
- Afhankelijk van gekalibreerde microscopie en een consistente definitie van het interessegebied.
- Vereist standaardisatie van meetprotocollen tussen teams voor reproduceerbaarheid.
- Overwegingen voor aanpassing omvatten modelspecifieke botanatomie en kleuringsprotocollen.
- Praktische beperking: Handmatige contourering kan variabiliteit introduceren als definities van het interessegebied niet strikt gestandaardiseerd zijn.
