Een explantatiesysteem voor time-lapse beeldvormingsstudies van olfactorische circuitassemblage in Drosophila

Dit protocol presenteert een methode om live beeld te geven, olfactorische circuitassemblage op enkel axonniveau uit een zich ontwikkelend brein. dissectie om het weefsel te reinigen dat de zich ontwikkelende hersenen bedekt, kunnen we beelden van hoge kwaliteit van de interne hersenen verzamelen. Deze methode levert waardevolle inzichten op in de celbiologische basis van circuitontwikkeling.

Het kan gemakkelijk worden aangepast om ook de ontwikkeling van andere circuits te bestuderen. Het duurt enige tijd voordat een persoon stabiele handcontrole uitvoert bij microdissectie. Meer oefening zal nuttig zijn.

Bereid om te beginnen de kweekschaal voor op het mobiliseren van de explant tijdens time-lapse-beeldvorming door 0,5 centimeter dikke Sylgard op het bodemoppervlak van een petrischaal te leggen en deze 48 uur bij kamertemperatuur te laten uitharden. Om micropennen voor te bereiden voor het immobiliseren van de explant op deze plaat met behulp van een tang, plakt u meerdere micropennen op een tape met de scherpe uiteinden aan één kant uitgelijnd en knipt u twee millimeter scherpe uiteinden met een schaar. Steek vervolgens met behulp van de tang de gesneden micropennen in de Sylgard-laag van een vooraf gemaakte Sylgard-plaat.

Verzamel met behulp van een borstel witte poppen, die binnen een uur puparium vormen en breng ze over naar een nieuwe injectieflacon. Incubeer de poppen in het waterbad getemperd op 37 graden Celsius gedurende 40 minuten om schaarse ORN-klonen van willekeurige typen te induceren. Plaats de injectieflacon na een hitteschok gedurende 30 uur op 25 graden Celsius, wat resulteert in poppen die 30 uur na de vorming van het poparium oud zijn.

Bereid vervolgens het kweekmedium voor op explant zoals beschreven in het teksthandschrift en bewaar het bij vier graden Celsius. Voeg op de dag van beeldvorming foetaal runderserum, humane insulinestockoplossing en 20 hydroxyecdyson-stamoplossing oplossen in ethanol toe aan een injectieflacon van 50 milliliter met 45 milliliter Drosophila-medium van Schneider. Meng goed en breng 15 milliliter van het volledige medium over in een nieuwe conische buis van 50 milliliter en bewaar de rest van het volledige medium een week lang bij vier graden Celsius.

Bedek vervolgens de buisopening met volledig medium met paraffinefilm en oxygeneer het medium door zuurstofbellen onder het vloeistofoppervlak te pompen door een steriele pipetpunt van vijf milliliter met een snelheid van één bel per seconde gedurende 20 tot 30 minuten. Steriliseer vervolgens het oppervlak van de dissectieput en bereide sylgardplaat vooraf met 70% ethanol en laat ze drogen voor gebruik. Gebruik een borstel om 30 uur APF-pop over te brengen op een tissuepapier om het buitenoppervlak van de pop gedurende vijf minuten te drogen.

Na het aanbrengen van dubbelzijdige tape op een glazen dia, bevestigt u de gedroogde pop voorzichtig aan het kleverige oppervlak van de tape met de dorsale kant naar boven gericht. Druk de pop voorzichtig aan met een borstel om de ventrale kant goed aan de tape te bevestigen zonder de pop te beschadigen. Steek een scherpe punt van de tang tussen de bruine pop en de pop vanaf de zijkant en breek voorzichtig de bruine pop door een lijn naar het achterste uiteinde van de pop.

Zodra de bruine popbehuizing is geopend, houdt u met behulp van de tang de pop voorzichtig vast en brengt u deze over naar de dissectieput met één milliliter zuurstofrijk vol medium. Dompel de pop onder in het medium om hem naar de bodem van de put te laten zinken. Om de antennehersenexplant van de pop te ontleden, houdt u de pop voorzichtig vast met een tang met één hand en met behulp van een paar microscisors, maakt u een klein gaatje van de achterste kant van de pop, dat hoge druk in de pop loslaat.

Vanaf het gat snijdt u door de ventrale middellijn tot aan de nek en snijdt u vervolgens door de omtrek van de nek om het hoofd los te maken van het lichaam van de pop en plaatst u het lichaam in een andere put. Snijd vervolgens de transparante cuticula die de dorsale kant van de hersenen bedekt om het vetlichaam bovenop de hersenen bloot te leggen, zorg ervoor dat de nagelriem waaraan het netvlies en de antenne zich hechten behouden en snijd op dezelfde manier de cuticula van de ventrale kant van de hersenen. Pipetteer het medium naar de open gebieden aan de dorsale en ventrale zijden van het hoofd met behulp van een P10-pipet om het vetlichaam dat de hersenen en antenne bedekt voorzichtig uit te spoelen.

Om de interactie van bilaterale ORN-axonen of ORN-axonen met PN-dendriet-targeting te bestuderen, snijdt u de antennezenuw tijdens het stadium door de messen van de microscisors zorgvuldig tussen de cuticula en de hersenen te plaatsen en de geïnteresseerde antennezenuw te verbreken. Voor het overbrengen van de ontlede explant naar de Sylgard-plaat, plaatst u ongeveer 200 microliter druppel van het zuurstofrijke volledige medium op het Sylgard-oppervlak. Pipetteer het vetlichaam afgeleid van de ontleedde stam meerdere keren door een pipetpunt van 200 microliter om het binnenoppervlak te coaten om te voorkomen dat de explantaten aan de pipetpunt blijven plakken tijdens de overdracht van de dissectieput naar de mediumdruppel op de Sylgard-plaat.

Gebruik de tang om de explant op de Sylgard-laag in de twee optische lobben te pinnen, plaats vervolgens voorzichtig de Sylgard-plaat op het beeldvormingsstation, immobiliseer de plaat met tapes en voeg langzaam 10 milliliter van het zuurstofrijke volledige medium toe aan de Sylgard-plaat met behulp van een P1000-pipet. De ORN-axonen komen tussen 18 uur en 36 uur APF bij de antennelob en navigeren vervolgens door de antennelob, passeren de middellijn en innoveren de glomeruli. Vóór de registratie vertoonden de axonen enige laterale drifting naarmate de hersenen zich ontwikkelden, en na registratie werd het driften gecorrigeerd.

De glomerulaire identiteiten van de geëxtraheerde ORN-axonen werden onthuld door immunostaining van een neuropilmarker en cadherine. Door te vergelijken met de interne kwabkaart kon de identiteit van elke glomerulus worden bepaald. Tijdens ex vivo kweek veroorzaakt bacteriegroei meestal een vertraagde ontwikkeling van het reukcircuit.

Daarom is het belangrijk om de culturele schaal en pinnen grondig te steriliseren voordat de beeldvorming wordt afgebeeld en de beeldvormingsruimte schoon en geïsoleerd te houden. Voor het bereiken van een hogere ruimtelijke temporele resolutie kan dit explantsysteem in beeld worden gebracht met behulp van een meer geavanceerde microscoop, de adaptieve optica roosterlichtmicroscoop. Hoewel hier als voorbeeld een fabriekscircuitontwikkeling werd getoond, kan dit systeem mogelijk worden uitgebreid naar studies van andere circuits en ontwikkelingsprocessen in het zich ontwikkelende centrale brein.