Flowcytometrische analyse voor identificatie van de aangeboren en adaptieve immuuncellen van muizenlong
16 november 2021
In deze studie presenteren we een effectief en reproduceerbaar protocol om de immuunpopulaties van het muriene ademhalingssysteem te isoleren. We bieden ook een methode voor de identificatie van alle aangeboren en adaptieve immuuncellen die zich in de longen van gezonde muizen bevinden, met behulp van een op 9 kleuren gebaseerd flowcytometriepaneel.
Omdat de long een zeer complex en uniek immuunsysteem herbergt, zijn er verschillende gating-strategieën voor de identificatie van longimmuuncellen ontwikkeld en gerapporteerd. Het bestaan van verschillende benaderingen maakt het moeilijk om resultaten van verschillende laboratoria te vergelijken. Onze gating-strategie biedt een uitgebreide en reproduceerbare manier om tot 12 verschillende pulmonale myeloïde en niet-myeloïde immuunpopulaties te identificeren met behulp van negen markers.
Het huidige protocol beschrijft karakterisering en identificatie van longimmuunpopulaties onder steady-state omstandigheden. Dit protocol kan echter worden gebruikt om veranderingen van deze celpopulaties in verschillende ziektemodellen te identificeren, waar het kan helpen bij het identificeren van ziektespecifieke veranderingen in het longimmuunlandschap. Onderzoekers die deze techniek voor het eerst uitvoeren, moeten aandacht besteden aan de spijsverteringscondities en reagentia, omdat ze een groot verschil maken in de afgifte van immuuncellen uit het longweefsel.
Begin met het voorbereiden van het geëuthanaseerde dier voor een operatie. Stabiliseer de muis dorsaal door naalden of tape op de vier ledematen te gebruiken en gebruik vervolgens 70% ethanol om de huid van het ventrale gebied te ontsmetten. Maak een incisie van de nek naar de buik.
Verwijder de huid uit het thoracale gebied, samen met de ribben en het borstbeen. Spoel de longen door 10 milliliter koude PBS in de rechter ventrikel te injecteren met een naald van 18 tot 21 gauge totdat ze volledig wit worden. Verwijder vervolgens de thymus en het hart zonder de longen aan te raken.
Maak de longen los van de omliggende weefsels en breng ze over in een buis met koude BSA-buffer. Breng de long over naar een petrischaaltje, hak het met twee fijne scalpels en plaats het vervolgens in een conische buis van 50 milliliter. Voeg vijf milliliter verteringsbuffer toe om het bord te wassen.
Bevestig het deksel van de buis en verteer de long gedurende 30 minuten op een orbitale shaker met een snelheid van 150 rotaties per minuut bij 37 graden Celsius. Stop de reactie door 10 milliliter koude BSA-buffer toe te voegen. Meng en los na de vertering de longstukken op met een naald van 18 gauge.
Plaats een filterzeef van 70 micrometer bovenop een nieuwe conische buis van 50 milliliter en breng het verteerde longmengsel over in de zeef. Gebruik de rubberen kant van een zuigerspuit van 10 milliliter om de resterende longstukken op het filter te breken en was het met een BSA-buffer. Centrifugeer de eencellige suspensie bij 350 G gedurende acht minuten bij zeven graden Celsius.
Gooi het supernatant weg en resuspend de cellen in één milliliter ACK-lysisbuffer. Meng de suspensie met een pipet van één milliliter en incubeer deze gedurende 90 seconden bij kamertemperatuur. Voeg 10 milliliter koude BSA-buffer toe aan het reactiemengsel en centrifugeer het gedurende zeven minuten bij vier graden Celsius bij 350 G.
Gooi het supernatant weg, resuspend de pellet in kleuringsbuffer en tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Resuspend de cellen in een concentratie van 5 miljoen cellen per milliliter voor oppervlaktekleuring. Breng 1 miljoen cellen in 200 microliter per put over in een 96-putplaat en centrifugeer de plaat zeven minuten lang bij 350 G bij vier graden Celsius.
Bereid een flowcytometrieblokoplossing door anti-1632-antilichaam in kleuringsbuffer te verdunnen. Resuspend de cellen in 50 microliter van de flowcytometrieblokoplossing. Incubeer de suspensie gedurende 15 tot 20 minuten bij vier graden celsius of op ijs.
Voeg vervolgens 150 microliter kleurbuffer toe aan de plaat en centrifugeer deze gedurende vijf minuten 350 G bij vier graden Celsius. Bereid oppervlakte-antilichaamoplossing door de oppervlakteantistoffen te verdunnen in kleuringsbuffer. Resuspend de cellen in 50 microliter van de oppervlakte-antilichaamoplossing en incubeer de plaat bij vier graden Celsius in het donker.
Was de cellen vervolgens twee keer met kleuringsbuffer. Bereid de fixatie- en permeabilisatiebuffer voor door drie delen fixatie en permeabilisatieverdunningsmiddel en één deel kleurbuffer te mengen. Resuspend de cellen in 50 microliter van de voorbereide buffer per put van de 96-well plaat en incubeer ze gedurende 20 tot 25 minuten bij vier graden Celsius in het donker.
Verdun de permeabilisatiebuffer met gezuiverd gedeïoniseerd water om één keer permeabilisatiebuffer te bereiden en gebruik deze om de cellen te wassen. Bereid een intracellulaire antilichaamoplossing door verdunning met één milliliter permeabilisatiebuffer. Resuspend de cellen in 50 microliter van de verdunde intracellulaire antilichaamoplossing per put van de 96-well plaat en incubeer gedurende 40 minuten bij vier graden Celsius in het donker.
Was de cellen met permeabilisatiebuffer en vervolgens met kleuringsbuffer. Na de laatste wasbeurt, resuspend de cellen in 200 microliter vlekkenbuffer. Verkrijg minimaal 1,5 miljoen cellen per monster op de flowcytometer.
Na een succesvolle operatie en een passende postoperatieve procedure werden de puin en doubletten uitgesloten door middel van een gating-strategie. Immuuncellen werden geïdentificeerd met behulp van de CD45+ hematopoietische marker via flowcytometrie. De cellen werden onderscheiden als levend of dood.
De immuunlongcellen werden ingedeeld in drie groepen met behulp van anti-GR-1 en anti-CD68 antilichamen. Neutrofielen werden geïdentificeerd en geverifieerd met behulp van Ly6G als een unieke marker. De CD45+-populatie bevat ook natural killer-cellen, T-cellen en B-cellen.
Deze cellen werden gekleurd en geverifieerd door natural killer 1.1, CD3 en B220 antilichamen. De bronchoalveolaire lavage identificeerde eosinofielen die positief waren voor de CD11b-marker en alveolaire macrofagen die geen hoge niveaus van CD11b tot expressie brachten. CD45 + dendritische cellen werden gevonden en bevestigd door CD24-expressie.
Deze cellen vertoonden een positieve of negatieve reactie op CD103- en CD11b-markers. CD103-negatieve cellen werden geclassificeerd als conventionele en van monocyten afgeleide dendritische cellen op basis van CD64-expressie. de monocyt-afgeleide dendritische cellen waren laag positief voor de CD24 dendritische marker en positief voor de CD64 pan-macrofaag marker.
Interstitiële macrofagen met klassieke en niet-klassieke monocyten werden onderscheiden op basis van CD64- en GR-1-expressie. Deze cellen vertoonden positieve expressie voor CX3C chemokine receptor één. De belangrijkste stappen in deze procedure zijn het oogsten van goed weefsel, de spijsvertering en de voorbereiding van eencellige suspensie en gating op levende cellen en singlets.
Naast het karakteriseren van immuuncellen van de long door flowcytometrie, kunnen celkweek en functionele assays worden uitgevoerd in geïsoleerde celpopulaties. Deze techniek kan de weg vrijmaken voor onderzoekers om nieuwe vragen te onderzoeken bij longziekten, zoals infecties, auto-immuunziekten en kanker.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een uitgebreid protocol voor het isoleren van immuunpopulaties in het respiratoire systeem van muizen. Er wordt een reproduceerbare methode beschreven voor het identificeren van aangeboren en adaptieve immuuncellen in de longen van gezonde muizen met behulp van een 9-kleuren flowcytometrie-panel.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Respiratoire biologie
- Flowcytometrie
Achtergrond
- De long beschikt over een complex immuunsysteem.
- Er bestaan diverse gating-strategieën voor het identificeren van immuuncellen in de long.
- Het vergelijken van resultaten tussen verschillende laboratoria kan uitdagend zijn.
- Het begrijpen van immuunpopulaties in de long is cruciaal voor ziekteonderzoek.
Doel van de studie
- Om een gestandaardiseerde methode te bieden voor het identificeren van immuuncellen in de longen.
- Om vergelijkingen van immuuncelpopulaties tussen verschillende studies te vergemakkelijken.
- Om de identificatie van ziektespecifieke veranderingen in de longimmuniteit mogelijk te maken.
Gebruikte methoden
- Ontwikkeling van een flowcytometrie-panel met 9 kleuren.
- Toepassing van specifieke gating-strategieën voor de identificatie van immuuncellen.
- Karakterisering van immuunpopulaties onder steady-state condities.
- Aanpassing van het protocol voor gebruik in diverse ziektemodellen.
Belangrijkste Resultaten
- Identificatie van maximaal 12 verschillende pulmonale immuunpopulaties.
- Aantoonbaarheid van de reproduceerbaarheid bij de isolatie van immuuncellen.
- Inzichten in het immuunlandschap van de longen in steady-state.
- Potentieel voor toepassing bij het bestuderen van ziektegerelateerde veranderingen.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor de analyse van immuuncellen in de longen.
- Het kan het begrip van de longimmuniteit bij gezondheid en ziekte verbeteren.
- Aandacht voor de digestiecondities is cruciaal voor optimale resultaten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Gestandaardiseerde identificatie van immuunpopulaties in de long van muizen maakt reproduceerbare preklinische immunofenotypering mogelijk over verschillende ziektemodellen heen. Deze flowcytometrie-benadering ondersteunt targetvalidatie door kwantitatieve read-outs van immuuncellen te leveren die mechanistische pathways in de respiratoire pathofysiologie verduidelijken. Het protocol vergroot het voorspellende vertrouwen in vroege discovery-fasen door biologische variabiliteit bij beoordelingen van het immuunlandschap te verminderen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door middel van precieze kwantificering van innate en adaptieve immuuncel-subsets in de muizenlong.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbare gating-strategie voor een consistente identificatie van immuuncellen tussen laboratoria en studies.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door de bijdrage van immuuncellen aan de homeostase van de long en ziektemechanismen te verduidelijken.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde single-cell suspensies die geschikt zijn voor downstream functionele assays en compound-screening.
- Operationele waarde: Levert kwantitatieve flowcytometrie-outputs die assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid bij immuunprofilering mogelijk maken.
- Schaalbaarheid: Faciliteert de preparatie van gevalideerde immuuncelpopulaties voor high-throughput evaluatie van immunomodulerende compounds.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Maakt identificatie mogelijk van ziekte-specifieke veranderingen in het immuunlandschap van de longen in infectie-, auto-immuun- en kankermodellen.
- Translationele continuïteit: Ondersteunt de voortgang van ontdekking naar preklinische validatie door longitudinale immuunmonitoring mogelijk te maken.
- Mechanische risicoreductie: Verduidelijkt immuuncel-fenotypes en -functies om de selectie van targets en strategieën voor padmodulatie te informeren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in discovery biology-workflows door gestandaardiseerde immuunfenotypering te bieden, die dient als input voor de fasen van targetvalidatie en assayontwikkeling.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verhelderen van signaalpaden via kwantitatieve analyse van immuuncelsubsets in longweefsel.
- Screening: Maakt assays gereed door reproduceerbare immuuncelpopulaties te genereren voor de evaluatie van verbindingen en biomarkerbeoordeling.
- Analytics: Levert multiparametrische flowcytometrie-readouts die vergelijking van immuunresponsen over verschillende experimentele condities faciliteren.
- Translational Research: Verbindt ontdekkingsbevindingen met preklinische continuïteit door immuunmonitoring in ziektemodellen mogelijk te maken.
- Enterprise Reuse: Vestigt een gestandaardiseerde capaciteit voor immuunprofilering die kan worden toegepast in meerdere programma's voor respiratoire ziekten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door nauwkeurige kwantificering van immuuncellen en resolutie van subsets.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en reproduceerbaarheid van procedures voor het isoleren en kleuren van immuuncellen over verschillende locaties.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door mechanische ambiguïteit in immuunresponsen van de longen te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van immunomodulerende targets mogelijk op basis van kwantitatieve gegevens over het immuunlandschap.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in flowcytometrie, celkleuring en de identificatie van immuuncellen.
- Vereist toegang tot een flowcytometer, centrifugatieapparatuur en steriele weefselkweekfaciliteiten.
- Vereist standaardisatie van protocollen voor weefseldigestie om een consistente opbrengst en levensvatbaarheid van immuuncellen te garanderen.
- Vereist optimalisatie van antilichaampanels en kleuringscondities voor de specifieke immuunsubsets van belang.
- Omvat rekeninghouding met de weefselverwerkingstijd en de effecten van reagensstabiliteit op het behoud van immuuncel-epitopen.
