Name: Evaluatie van leverglucoseproductie in een muismodel met polycysteus ovariumsyndroom (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Leer hoe u leverglucoseproductie kwantificeert in een PCOS-muismodel met behulp van stabiele isotopische glucose-tracers en GCMS-analyse. Deze methode biedt inzicht in glucosemetabolisme en pathogenese.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door opleidingsbeurzen van het Department of Obstetrics and Gynecology, Baylor College of Medicine (ALG) en R-01 onderzoeksbeurs (Grant # DK114689) voor CSB, SC en JM van National Institutes of Health.

Alle dierprocedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Baylor College of Medicine.
1. Bereiding van [6,6-2H2]glucose
<ol><li>Bereid een dag voor de procedure de stabiele isotoopglucose tracer voor in een normale zoutoplossing. Voor dit experiment werd [6,6-2H2]glucose gebruikt als tracer om de verschijningssnelheid van plasmaglucose te meten. OPMERKING: In dit experiment werden de glucoseproductie tijdens het vasten en glucoserijke omstandigheden gemeten, dus de glucose-isotoop werd bereid in twee verschillende preparaten. Bereid de oplossingen zodanig dat de uiteindelijke infusiedosis dicht bij respectievelijk 1 mg/(kg·min) en 2 mg/(kg·min) ligt. Deze concentraties werden geoptimaliseerd door verschillende eerdere pilootstudies.</li>
	<li>Bereid het eerste infundaat met slechts [6,6-2H2]glucose als tracer om de nuchtere toestand weer te geven door steriele en pyrogeenvrije [6,6-2H2]glucose op te lossen in steriele 0,9% natriumchlorideoplossing.</li>
	<li>Bereid het tweede infunderen door zowel [6,6-2H2]glucose tracer als niet-isotopische glucose (~20 mg/kg·min) op te lossen in steriele 0,9% natriumchlorideoplossing om de gevoede toestand te simuleren. OPMERKING: In het huidige experiment werd een infusie met geprimeerde constante snelheid van [6,6-2H2]glucose bij (~) 1,08 mg/(kg·min) (nuchtere conditie) en (~) 1,9 mg/kg·min (glucoserijke toestand) gebruikt. Om de 'glucoserijke toestand' na te bootsen, werd de D-glucose-infusiesnelheid ingesteld op (~) 18,8 mg/(kg·min).</li>
	<li>Zodra de oplossingen zijn bereid, filtert u de oplossingen steriel met een filter van 0,22 μm en bewaart u deze bij 4 °C. Verwarm de oplossingen tot kamertemperatuur voorafgaand aan de infusie. Laad de oplossingen op vooraf gelabelde spuiten van 1 ml.</li>
	<li>Stel de pomp in om een infusie met constante snelheid van het eerste infundaat (voor basale toestand) met alleen de tracer mogelijk te maken en programmeer de pomp voor een infusie met constante snelheid van de isotoop bij 150 μL / h gedurende 3 uur.</li>
	<li>Vervang aan het einde van de 3 uur durende vastenset-up de eerste infundaatspuit door de tweede infundaatspuit met de isotopische tracer en D-glucose (voor de gesimuleerde gevoede toestand) en bereid de infusie voor de initiële 15 min voor op 600 μL / h. Stel de pomp in op een infusie met constante snelheid op 150 μL/h voor de extra 3 uur.</li>
</ol>2. Opzetten van infusie-experimenten
<ol><li>Verwijder de muizen uit hun thuiskooien en plaats ze 3 uur voor aanvang van het experiment in hun vastenkooien. Voor dit experiment werd een 4 maanden oude vrouwelijke muis van de C57BL / 6J-stam gebruikt. OPMERKING: Deze procedure vereist geen analgesie voorafgaand aan of tijdens de procedure gezien het minimaal invasieve karakter ervan.</li>
	<li>Monteer de caging-apparatuur door de muizen te groeperen in een vast aantal muizen per insulinepomp. Plaats scheidingswanden bovenop een vlakke, stabiele basis om individuele stallen voor de muizen te maken. Het is belangrijk om toegang te hebben tot de staartaderkatheter om de infusie te laten lopen, dus zorg ervoor dat er een inkeping in de bodem van de kooideur zit. OPMERKING: Kooien die in de video worden getoond, zijn speciaal voor dit experiment gemaakt. Kooien zijn helder en gemaakt van plexiglas. Er is een vlakke, stabiele basis (standaard caging apparatuur) waarop de scheidingswanden zitten. Deze opstelling bestaat uit verschillende onderdelen om de installatie in verschillende omgevingen te vergemakkelijken, afhankelijk van de hoogte van de tafel en de behoeften van de experimentator. De deur naar de kooi schuift dicht en heeft een inkeping aan de onderkant om de staart door te laten.</li>
	<li>Monteer de spuiten van 1 ml met 1 ml basaal infundaat en sluit vervolgens aan op de injectiepompslang met behulp van de polyethyleenbuis 0,28 mm ID x 0,61 mm.</li>
	<li>Bereid de infusiepomp voor door de snelheid in te stellen op 150 μL/h, wat de basale snelheid is.</li>
	<li>Verwarm een waterbad tot 48 °C.</li>
	<li>Bereid het katheterinbrengstation naast het waterbad voor met de 30 G 0,5 inch naalden, 0,3 mm ID x 0,64 mm silastische slang en 1 inch doorzichtige transpore tape.</li>
	<li>Na 3 uur vasten begint u met het inbrengen van de katheter, dat hieronder wordt beschreven.</li>
</ol>3. Katheter inbrengen
<ol><li>Selecteer één muis en plaats deze in een veilige houder met toegang tot de staart. Een voorbeeld van wat te gebruiken is een fles doormidden gesneden met een inkeping voor de staart. Plaats de houder op een vlakke basis. Plaats een stuk tape over het proximale deel van de staart om ruimte te bieden voor het inbrengen van de katheter meer distaal. OPMERKING: Het type tape dat voor deze taak wordt gekozen, moet een matige sterkte en kleefkracht hebben. Multifunctionele, op papier gebaseerde etiketteringstape werd in dit experiment gebruikt omdat het mild en gemakkelijk af te pellen is.</li>
	<li>Bereid de katheter voor (30 G naald bevestigd aan 0,3 mm silastische slang en PE-10 waren gassteriliseerd) door deze te bevestigen aan een spuit van 1 ml met steriele hepariniseerde zoutoplossingspoeling. Spoel de katheter voorzichtig door.</li>
	<li>Breng de muis naar het waterbad en steek de staart ongeveer 30-45 s in het waterbad. Dit helpt om de staartvasculatuur te verwijden voor katheterplaatsing.</li>
	<li>Voer het inbrengen van de katheter uit onder steriele omstandigheden. Zodra de staart is opgewarmd, reinigt u de staart met benzalkoniumdoekjes en plaatst u een kleine koperen, tandeloze alligatorklem, die eerder was gevormd naar de vorm van de staart, als een tourniquet aan het proximale uiteinde van de staart. Visualiseer de laterale staartader onder een vergrootglas en breng vervolgens voorzichtig de katheter in de staartader en trek de naald terug. Spoel de oplossing voorzichtig om de doorgankelijkheid van de katheter te garanderen.</li>
	<li>Wikkel een stuk 1 inch transpore tape rond de inbrengplaats om de katheter vast te zetten. Verwijder het kleine tourniquet van de staart.</li>
</ol>4. Infusieopstelling en eerste infusie
<ol><li>Plaats de muis in zijn individuele kooi en sluit de schuifdeur, zodat de staart door de inkeping steekt en buiten de kooi blijft.</li>
	<li>Plaats een extra stuk tape over de hele katheter en de staart om deze aan de basisplaat van de kooi te bevestigen. Voor deze stap werd multipurpose gekleurde labeltape gebruikt.</li>
	<li>Koppel de spoeling los van de staartaderkatheter en plaats een kleine klem op de silastische slang van de katheter om terugstroming te voorkomen terwijl de infundaatsleiding van de pomp wordt aangesloten.</li>
	<li>Eenmaal veilig aangesloten, verwijdert u de klem en spoelt u met de aanzuigoplossing, die bestaat uit het infundaat. Zorg ervoor dat de oplossing helder is in de slang en niet met bloed is gekleurd.</li>
	<li>Noteer het tijdstip van aanvang van de infusie om ervoor te zorgen dat deze gedurende de totale tijd van ongeveer 3 uur loopt. Als meerdere kooien tegelijkertijd worden gebruikt, moeten ze worden gespreid om de infusietijden effectief te beheren.</li>
	<li>Zodra is vastgesteld dat de infusielijnen goed functioneren, verwijdert u het deksel van de muis. Plaats standaard beddengoed rond de muis.</li>
	<li>Start de infusie met het eerste infuus dat de tracer bevat en laat het gedurende 3 uur continu uitvoeren. Blijf voor de duur van de infusie het welzijn van muizen en infusielijnen controleren. Zorg ervoor dat de infuusslang goed is vastgezet en dat er geen lekken zijn uit de aansluitpunten van de lijn.</li>
</ol>5. Bloedafname
<ol><li>Nadat de eerste infusie is voltooid, stopt u de infusie, plaatst u een klem op de sylastische slang op de katheter om terugstroming te voorkomen. Verwijder de muizen voorzichtig uit hun behuizingen zonder de katheter te verstoren om bloed te verzamelen. Plaats ze op een plek in de buurt van de kooien voor bloedafname. Voor dit experiment ondergingen de muizen wangvenapunctie met behulp van een lancet van 4 mm.</li>
	<li>Verzamel ~75 μL bloed in de gewenste injectieflacon. Om monsters te deproteïniseren ter voorbereiding op massaspectrometrie, voegt u ongeveer 15 μL bloed toe aan 500 μL aceton. Het resterende bloed kan worden gebruikt om de bloedsuikerspiegel te controleren via de glucometer en / of gecentrifugeerd om plasma te scheiden voor toekomstige hormoontests.</li>
</ol>6. Tweede infusie
<ol><li>Verwijder de infundaten uit de spuitpompen door de slang los te koppelen van de spuiten en vervang deze door het tweede infundaat dat de tracer samen met de glucose bevat. Herhaal stap 4.2 tot en met 4.7 met behulp van de glucoserijke isotopische glucose-infusie.<ol>
<li>Om een steady state te bereiken, voert u gedurende 15 minuten een bolus van het tweede infusaat uit bij 600 μL/h. Noteer de starttijd voor elke groep kooien. Verlaag de infusiesnelheid tot 150 μL/h om de 3 uur van de totale infusietijd te voltooien.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Herhaal stap 5.1 en 5.2.</li>
	<li>Stop de infusiepomp en verwijder de staartaderkatheter voorzichtig, oefen druk uit op de katheterplaatsen totdat het bloeden stopt en breng muizen terug naar hun thuiskooien.</li>
	<li>Santize en desinfecteer de caging setup grondig met standaard water en zeep. OPMERKING: Dit is een overlevingsprocedure. Muizen kunnen worden teruggebracht naar kooien en indien nodig worden gehouden voor verdere ervaringen. Het wordt aanbevolen om gedurende ten minste een week na deze procedure geen verdere experimenten uit te voeren om voldoende dierenwelzijn te waarborgen.</li>
</ol>7. Massaspectrometrie
<ol><li>Stuur de monsters voor massaspectrometrie.</li>
	<li>Analyses<ol>
<li>Meet de isotopische verrijking van [6,6-2H2]glucose door gaschromatografie - massaspectrometrie (GCMS) met behulp van het pentaacetaatderivaat21,22. In het kort omvat deze methode de bereiding van het pentaacetaatderivaat van glucose, gevolgd door monsteranalyse met GCMS 20,22.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calculaties<ol>
<li>Voer alle kinetische metingen uit onder steady state omstandigheden. De totale plasmaglucose-verschijningssnelheid (glucose Ra) werd berekend op basis van de M+2-verrijking van [6,6-2H2]glucose in plasma met behulp van vastgestelde isotoopverdunningsvergelijkingen21. Onder steady state-omstandigheden wordt aangenomen dat de snelheid van verschijning van glucose gelijk is aan de snelheid van het verdwijnen van glucose. Snelheid van endogene glucoseproductie (mg/(kg·min)) (GPR) = glucoseRa - exogene glucose.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>March, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+of+polycystic+ovary+syndrome+in+a+community+sample+assessed+under+contrasting+diagnostic+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">The prevalence of polycystic ovary syndrome in a community sample assessed under contrasting diagnostic criteria.</a> Human Reproduction. 25 (2), 544-551 (2009).</li>
<li>Yildiz, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence%2C+phenotype+and+cardiometabolic+risk+of+polycystic+ovary+syndrome+under+different+diagnostic+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Prevalence, phenotype and cardiometabolic risk of polycystic ovary syndrome under different diagnostic criteria.</a> Human Reproduction. 27 (10), 3067-3073 (2012).</li>
<li>Rotterdam ESHRE/ASRM-Sponsored PCOS Consensus Workshop Group
. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+2003+consensus+on+diagnostic+criteria+and+long-term+health+risks+related+to+polycystic+ovary+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long-term health risks related to polycystic ovary syndrome.</a> Fertility and Sterility. 81 (1), 19-25 (2004).</li>
<li>Goodarzi, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycystic+ovary+syndrome%3A+etiology%2C+pathogenesis+and+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Polycystic ovary syndrome: etiology, pathogenesis and diagnosis.</a> Nature Reviews. Endocrinology. 7 (4), 219-231 (2011).</li>
<li>Azziz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction%3A+Determinants+of+polycystic+ovary+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Introduction: Determinants of polycystic ovary syndrome.</a> Fertility and Sterility. 106 (1), 4-5 (2016).</li>
<li>Baskind, N. E., Balen, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothalamic-pituitary%2C+ovarian+and+adrenal+contributions+to+polycystic+ovary+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+and+Research.+Clinical+Obstetrics+%26+Gynaecology%22%5BJournal%5D)">Hypothalamic-pituitary, ovarian and adrenal contributions to polycystic ovary syndrome.</a> Best Practice and Research. Clinical Obstetrics & Gynaecology. 37, 80-97 (2016).</li>
<li>Burghen, G. A., Givens, J. R., Kitabchi, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+hyperandrogenism+with+hyperinsulinism+in+polycystic+ovarian+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Correlation of hyperandrogenism with hyperinsulinism in polycystic ovarian disease.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 50 (1), 113-116 (1980).</li>
<li>Bremer, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycystic+ovary+syndrome+in+the+pediatric+population%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Syndrome+and+Related+Disorders%22%5BJournal%5D)">Polycystic ovary syndrome in the pediatric population.</a> Metabolic Syndrome and Related Disorders. 8 (5), 375-394 (2010).</li>
<li>Dunaif, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excessive+insulin+receptor+serine+phosphorylation+in+cultured+fibroblasts+and+in+skeletal+muscle.+A+potential+mechanism+for+insulin+resistance+in+the+polycystic+ovary+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Excessive insulin receptor serine phosphorylation in cultured fibroblasts and in skeletal muscle. A potential mechanism for insulin resistance in the polycystic ovary syndrome.</a> The Journal of Clinical Investigation. 96 (2), 801-810 (1995).</li>
<li>Højlund, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+insulin-stimulated+phosphorylation+of+Akt+and+AS160+in+skeletal+muscle+of+women+with+polycystic+ovary+syndrome+is+reversed+by+pioglitazone+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Impaired insulin-stimulated phosphorylation of Akt and AS160 in skeletal muscle of women with polycystic ovary syndrome is reversed by pioglitazone treatment.</a> Diabetes. 57 (2), 357-366 (2008).</li>
<li>Moghetti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergences+in+insulin+resistance+between+the+different+phenotypes+of+the+polycystic+ovary+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Divergences in insulin resistance between the different phenotypes of the polycystic ovary syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98 (4), 628-637 (2013).</li>
<li>Ovalle, F., Azziz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance%2C+polycystic+ovary+syndrome%2C+and+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance, polycystic ovary syndrome, and type 2 diabetes mellitus.</a> Fertility and Sterility. 77 (6), 1095-1105 (2002).</li>
<li>Dunaif, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profound+peripheral+insulin+resistance%2C+independent+of+obesity%2C+in+polycystic+ovary+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Profound peripheral insulin resistance, independent of obesity, in polycystic ovary syndrome.</a> Diabetes. 38 (9), 1165-1174 (1989).</li>
<li>Hutchison, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+exercise+on+insulin+resistance+and+body+composition+in+overweight+and+obese+women+with+and+without+polycystic+ovary+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Effects of exercise on insulin resistance and body composition in overweight and obese women with and without polycystic ovary syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology Metabolism. 96 (1), 48-56 (2011).</li>
<li>Stepto, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Women+with+polycystic+ovary+syndrome+have+intrinsic+insulin+resistance+on+euglycaemic-hyperinsulaemic+clamp%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Women with polycystic ovary syndrome have intrinsic insulin resistance on euglycaemic-hyperinsulaemic clamp.</a> Human Reproduction. 28 (3), 777-784 (2013).</li>
<li>Basu, R., Schwenk, W. F., Rizza, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+fasting+glucose+production+and+disappearance+are+abnormal+in+people+with+%26%2334%3Bmild%26%2334%3B+and+%26%2334%3Bsevere%26%2334%3B+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%2C+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Both fasting glucose production and disappearance are abnormal in people with &#34;mild&#34; and &#34;severe&#34; type 2 diabetes.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 287 (1), 55-62 (2004).</li>
<li>Blesson, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+dependent+dysregulation+of+hepatic+glucose+production+in+lean+Type+2+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Sex dependent dysregulation of hepatic glucose production in lean Type 2 diabetic rats.</a> Frontiers in Endocrinology. 10, Lausanne. 538(2019).</li>
<li>Caldwell, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+reproductive%2C+metabolic%2C+and+endocrine+features+of+polycystic+ovary+syndrome+in+female+hyperandrogenic+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Characterization of reproductive, metabolic, and endocrine features of polycystic ovary syndrome in female hyperandrogenic mouse models.</a> Endocrinology. 155 (8), 3146-3159 (2014).</li>
<li>Chappell, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+androgen+induced+lean+PCOS+impairs+mitochondria+and+mRNA+profiles+in+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Connections%22%5BJournal%5D)">Prenatal androgen induced lean PCOS impairs mitochondria and mRNA profiles in oocytes.</a> Endocrine Connections. 9 (3), 261-270 (2020).</li>
<li>Chacko, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+gluconeogenesis+using+glucose+fragments+and+mass+spectrometry+after+ingestion+of+deuterium+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Measurement of gluconeogenesis using glucose fragments and mass spectrometry after ingestion of deuterium oxide.</a> Journal of Applied Physiology. 104 (4), 944-951 (2008).</li>
<li>Bier, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+%26%2334%3Btrue%26%2334%3B+glucose+production+rates+in+infancy+and+childhood+with+6%2C6-dideuteroglucose%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Measurement of &#34;true&#34; glucose production rates in infancy and childhood with 6,6-dideuteroglucose.</a> Diabetes. 26 (11), 1016-1023 (1977).</li>
<li>Chacko, S. K., Sunehag, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gluconeogenesis+continues+in+premature+infants+receiving+total+parenteral+nutrition%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Disease+in+Childhood.+Fetal+and+Neonatal+Edition%22%5BJournal%5D)">Gluconeogenesis continues in premature infants receiving total parenteral nutrition.</a> Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 95 (6), 413-418 (2010).</li>
<li>Chacko, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ghrelin+on+glucose+regulation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%2C+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Effect of ghrelin on glucose regulation in mice.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 302 (9), 1055-1062 (2012).</li>
<li>Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-surgical+alternatives+to+invasive+procedures+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Non-surgical alternatives to invasive procedures in mice.</a> Laboratory Animals. 40 (3), 275-281 (2006).</li>
<li>Jacobs, J. D., Hopper-Borge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carotid+artery+infusions+for+pharmacokinetic+and+pharmacodynamic+analysis+of+taxanes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Carotid artery infusions for pharmacokinetic and pharmacodynamic analysis of taxanes in mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51917(2014).</li>
<li>Ayala, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperinsulinemic-euglycemic+clamps+in+conscious%2C+unrestrained+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3188(2011).</li>
<li>Kmiotek, E. K., Baimel, C., Gill, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+Intravenous+Self+Administration+in+a+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e3739(2012).</li>
<li>Marini, J. C., Lee, B., Garlick, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+urea+kinetic+studies+in+conscious+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">In vivo urea kinetic studies in conscious mice.</a> The Journal of Nutrition. 136 (1), 202-206 (2006).</li>
<li>Choukem, S. -P., Gautier, J. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+measure+hepatic+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metabolism%22%5BJournal%5D)">How to measure hepatic insulin resistance.</a> Diabetes Metabolism. 34 (6), Pt 2 664-673 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hyperglycemie en abnormaal glucosemetabolisme / homeostase zijn kenmerken van PCOS. De bloedsuikerspiegel wordt gehandhaafd door een combinatie van glucose uit voeding en glucoseproductie via glycogenolyse en gluconeogenese en glycogenese, onder controle van hormoon en enzymen. De productie van leverglucose wordt onderdrukt door de aanwezigheid van verhoogde circulerende glucosespiegels. Bij aandoeningen van abnormaal glucosemetabolisme wordt de regulatie van de onderdrukking van glucoseproductie aangetast, wat ...

Polycysteus ovariumsyndroom (PCOS) is een veel voorkomende aandoening die voorkomt bij 12%-20% van de vrouwen in de reproductieve leeftijd1,2. Het is een complexe ziekte die resulteert in variabele fenotypen met polycysteuze eierstokken, onregelmatige menstruatie en klinisch of laboratoriumbewijs van hyperandrogeenemie, en wordt meestal gediagnosticeerd wanneer een vrouw aan twee van de drie criteria voldoet3. Een overheersend aspect van PCOS, en een belangrijke factor in de pathogenese, is metabole verstoringen die worden aangetroffen bij vrouwen die de ziekte hebben. Vrouwen met PCOS hebben een hogere incidentie van insulineresistentie, glucose-intolerantie, obesitas en metabool syndroom3,4,5,6. Insulineresistentie is niet alleen een manifestatie van de ziekte, maar er wordt gedacht dat het bijdraagt aan de pathogenese door de werking van luteïniserend hormoon in de eierstok te versterken, wat leidt tot een verhoogde androgeenproductie7,8. Insulineresistentie wordt verondersteld verschillende mogelijke oorzaken te hebben, maar studies suggereren dat het te wijten kan zijn aan abnormale patronen van insulinereceptorsignalering9,10. Studies hebben insulineresistentie bij PCOS-patiënten geëvalueerd met behulp van de gouden standaardtechniek van hyperinsulinemisch-euglycemische clamp11,12,13,14,15. Vrouwen met PCOS, ongeacht de BMI, hebben hogere niveaus van insulineresistentie in vergelijking met controles. Insulinecontrole over glucoseproductie is verminderd bij aandoeningen van insulineresistentie die leiden tot overmatige glucoseproductie. Diabetespatiënten hebben bijvoorbeeld verhoogde gluconeogenese en verminderde onderdrukking van glycogenolyse16. Bovendien is een verminderde onderdrukking van de glucoseproductie waargenomen bij diabetische ratten17. Hoewel klemstudies een meting van insulineresistentie kunnen geven, richten weinig studies in PCOS zich op directe meting van glucoseproductie in nuchtere en gevoede toestanden. Dit vereist het gebruik van een niet-radioactieve isotopische glucose tracer infusie en meting via massaspectrometrie.
Diermodellen zijn op grote schaal gebruikt in PCOS-onderzoek. Zowel magere als zwaarlijvige PCOS-muizenmodellen zijn gemaakt door androgenen prenataal, prepubertaal of post-pubertaal toe te dienen18. Knaagdier PCOS-modellen tonen ook metabole verschillen in vergelijking met hun respectieve controles. Eerdere gegevens uit ons laboratorium toonden abnormale glucosetolerantietests (GTT) aan in PCOS-muismodellen (mager en zwaarlijvig), in overeenstemming met de menselijke PCOS-literatuur19. Het gebruik van een mager en zwaarlijvig diermodel maakt verder onderzoek naar metabole verschillen mogelijk. In het bijzonder maakt dit model het mogelijk om de snelheid van glucoseproductie rechtstreeks te evalueren met behulp van isotopische glucose tracers. Een van de meest gebruikte stabiele isotopische glucose tracers is [6,6-2H2]glucose. De [6,6-2H2]glucoseverrijking kan worden gemeten met behulp van een pentaacetaatderivaat zoals eerder beschreven20.
In deze studie was ons doel om de snelheid van hepatische glucoseproductie in nuchtere en glucoserijke toestand bij PCOS-muizen te meten met behulp van isotopische glucose-infusie. Deze technieken kunnen worden toegepast op een breed scala aan experimenten met glucosekinetiek.

<table><tbody><tr><td>0.9% natriumchloride oplossing</td><td>McKesson</td><td>275595</td><td></td></tr><tr><td>10 mL BD Luer-Lok tip spuit</td><td>VWR</td><td>75846-756</td><td>Twee spuiten per dier (één voor isotope glucose-oplossing, één voor glucose-rijke isotope-oplossing)</td></tr><tr><td>1-inch heldere transpore tape</td><td>3M</td><td>70200400169</td><td></td></tr><tr><td>1-inch labeltape</td><td>Fisher</td><td>GS07F161BA</td><td>Merk is voorbeeld</td></tr><tr><td>5 mL spuit met heparinerende zoutoplossing</td><td>McKesson</td><td>191-MIH-2235</td><td>Men kan ook een heparine-oplossing bereiden (10 eenheden/mL heparine in 0.9% natriumchloride)</td></tr><tr><td>5 mm Medipoint Goldenrod dierenlancetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9891620</td><td>5 mm als dier tussen 2 en 6 maanden oud is</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650501</td><td></td></tr><tr><td>Geavanceerde hetelplaat-roerder</td><td>VWR</td><td>97042-602</td><td>Merk is voorbeeld</td></tr><tr><td>BD 27 gauge 0.5 inch naalden</td><td>Health Warehouse</td><td>A283952</td><td></td></tr><tr><td>BD 30 gauge 0.5 inch naalden</td><td>Medvet</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>BD Intramedic Polyethyleen (PE) buis 0.28 mm ID x 0.61 mm</td><td>VWR</td><td>63019-004</td><td></td></tr><tr><td>BD Intramedic Polyethyleen (PE) buis 0.28 mm ID x 0.61 mm</td><td>VWR</td><td>63019-004</td><td></td></tr><tr><td>Kolf, 1000 mL</td><td></td><td></td><td>Elk merk</td></tr><tr><td>Kooipellets</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heldere VOA glazen flesjes met afsluitbare bovenkant</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-719-120</td><td>Voor opslag van aceton en bloedmonsters</td></tr><tr><td>Koperen klem zonder tanden voor tourniquet</td><td>Amazon</td><td></td><td>Elk merk; gladde klips met gladde kaken gemaakt van massief koper</td></tr><tr><td>D-(+)-glucose >99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose (6,6-D2, 99%)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td><td>DLM-349-PK</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning silastic buis 0.3 mm ID x 0.64 mm OD</td><td>VWR</td><td>62999-042</td><td></td></tr><tr><td>Loupe</td><td>Amazon</td><td></td><td>Elk merk; vergelijkbaar met LANCOSC Loupe met licht en standaard</td></tr><tr><td>Microbalans</td><td>Ohaus Adventurer Pro</td><td>AV264C</td><td>Elk soortgelijk model met nauwkeurigheid van 0.0001g kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Nalgene fles, 500 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0158-12EA</td><td>Of een soortgelijk merk; in de helft gezaagd (inclusief deksel) en staartvormige inkeping in de bodem gesneden</td></tr><tr><td>PHD Ultra multi-spuitpomp</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-3024A</td><td></td></tr><tr><td>Plexiglasplaat</td><td></td><td></td><td>Elk merk; om de muis tijdens katheterplaatsing te stabiliseren</td></tr><tr><td>Plexiglas platen en verdelers</td><td></td><td></td><td>Elk merk; gebruikt om muizen te kooien tijdens infusie</td></tr></tbody></table>

evaluatie van leverglucoseproductie in een muismodel met polycysteus ovariumsyndroom

Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

Polycysteus ovariumsyndroom (PCOS) is een veel voorkomende ziekte die resulteert in aandoeningen van het glucosemetabolisme, zoals insulineresistentie en glucose-intolerantie. Ontregeld glucosemetabolisme is een belangrijke manifestatie van de ziekte en is de sleutel tot de pathogenese. Daarom zijn studies met betrekking tot de evaluatie van het glucosemetabolisme in PCOS van het grootste belang. Zeer weinig studies hebben de productie van leverglucose rechtstreeks gekwantificeerd in PCOS-modellen met behulp van niet-radioactieve glucose tracers. In deze studie bespreken we stapsgewijze instructies voor de kwantificering van de snelheid van leverglucoseproductie in een PCOS-muismodel door M +2-verrijking van [6,6-2H2] glucose, een stabiele isotopische glucose tracer, te meten via gaschromatografie - massaspectrometrie (GCMS). Deze procedure omvat het creëren van stabiele isotopische glucose tracer oplossing, gebruik van staartader katheter plaatsing en infusie van de glucose tracer in zowel nuchtere als glucose-rijke toestanden in dezelfde muis in tandem. De verrijking van [6,6-2H2]glucose wordt gemeten met pentaacetaatderivaat in GCMS. Deze techniek kan worden toegepast op een breed scala aan studies met directe meting van de snelheid van de leverglucoseproductie.

Met behulp van eerder beschreven isotoopverdunningsvergelijkingen werd de totale plasmaglucosesnelheid (glucoseRa) berekend uit M+2-verrijking van [6,6-2H2]glucose in nuchtere en glucoserijke omstandigheden met behulp van het pentaacetaatderivaat21. Onder steady-state omstandigheden wordt aangenomen dat de snelheid van verschijning van glucose gelijk is aan de snelheid van het verdwijnen van glucose. In de controlegroep was de totale glucoseRa 19,98 ± 2,...

Deze studie beschrijft de directe meting van de leverglucoseproductie in een polycysteus ovariumsyndroom muismodel door gebruik te maken van een stabiele isotopische glucose tracer via staartader in zowel nuchtere als glucoserijke toestanden in tandem.

Evaluatie van leverglucoseproductie in een muismodel met polycysteus ovariumsyndroom

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. ...

Het doel van deze procedure is om de leverglucoseproductie te bepalen in een polycysteus ovariumsyndroom of PCOS-muismodel. Ontregeld glucosemetabolisme is een belangrijke manifestatie van PCOS en is de sleutel tot de pathogenese. Daarom zijn studies met betrekking tot de evaluatie van het glucosemetabolisme in PCOS van het grootste belang.In deze studie bespreken we stapsgewijze instructies voor de kwantificering van de snelheid van leverglucoseproductie in een PCOS-muismodel door de M plus twee verrijking van zes gedeutereerde glucose, een stabiele isotopische glucosetracer, te meten via gaschromatografie, massaspectrometrie of GCMS. Deze procedure omvat het creëren van een stabiele isotopische glucose traceroplossing, het gebruik van de plaatsing van de staartaderkatheter en infusie van de glucose tracer in zowel nuchtere als glucoserijke toestanden in dezelfde muis in combinatie. Bereid een dag voor de procedure de stabiele isotoopglucose tracer voor in een normale zoutoplossing.Voor dit experiment werd de glucoseproductie tijdens het vasten in glucoserijke omstandigheden gemeten, zodat de glucose-isotoop in twee verschillende preparaten werd bereid. De tracer werd onder sterie

evaluation-hepatic-glucose-production-polycystic-ovary-syndrome-mouse

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

De hyperinsulinemische-euglycemic clamp, of insuline klem, is de gouden standaard voor het beoordelen van de werking van...

Hyperinsulinemische-euglycemic Klemmen in Bewust, ongeremde Muizen

This video introduces how to perform an oral glucose tolerance test on a laboratory mouse.

Oral Glucose Tolerance Test (OGTT): Measuring Glucose Metabolism in Mice

This article describes a way to prepare and insert dihydrotestosterone (DHT) pellets to model Polycystic Ovary Syndrome (PCOS) in mice. The example protocol demonstrates the procedure in mice used for reproductive and metabolic studies.

Subcutaneous Dihydrotestosterone (DHT) Treatment: Mouse Model of Polycystic Ovary Syndrome (PCOS)

Hier worden geoptimaliseerde methoden beschreven om in vivo en in vitro modellen van hepatische steatose te genereren en om de steatotische fenotypes en gerelateerde fysiologische parameters te analyseren.

Geoptimaliseerd Analyse van<em&gt; In Vivo</em&gt; en<em&gt; In Vitro</em&gt; Leversteatose

Het huidige artikel beschrijft het genereren en metabole karakterisering van vetrijke dieet-gevoed muizen als een model van dieet-geïnduceerde insulineresistentie en overgewicht. Het beschikt verder over gedetailleerde protocollen voor het uitvoeren van de orale glucose tolerantie test en de insuline tolerantie test, toezicht op de gehele lichaam wijzigingen van het glucose metabolisme in vivo.

Studie van In Vivo Glucose metabolisme in High-fat dieet-gevoed muizen met behulp van orale Glucose tolerantie Test (OGTT) en insuline tolerantie Test (ITT)

We beschrijven de ontwikkeling van een mager PCOS-achtige muismodel met dihydrotestosteron pellet te bestuderen van de pathofysiologie van PCOS en de nakomelingen van deze PCOS-achtige dammen.

Een muismodel van Hyperandrogenic te bestuderen polycysteus ovarium syndroom

Primaire hepatocyten zijn een waardevol hulpmiddel om leverrespons en metabolisme in vitro te bestuderen. Met behulp van in de handel verkrijgbare reagentia werd een verbeterd tijd- en arbeidsefficiënt protocol voor primaire hepatocytenisolatie bij muizen ontwikkeld.

Een verbeterd tijd- en arbeidsefficiënt protocol voor primaire hepatocytenisolatie bij muizen

Vetzuur β-oxidatie is een essentiële metabole route die verantwoordelijk is voor het genereren van energie in veel verschillende celtypen, waaronder hepatocyten. Hier beschrijven we een methode om vetzuur β-oxidatie te meten in vers geïsoleerde primaire hepatocyten met behulp van 14C-gelabeld palmitinezuur.

Meting van vetzuur β-oxidatie in een suspensie van vers geïsoleerde muizenhepatocyten

Hier presenteren we een robuuste methode voor in situ perfusie van de muizenlever om de acute en directe regulatie van het levermetabolisme te bestuderen zonder de leverarchitectuur te verstoren, maar in afwezigheid van extra-hepatische factoren.

Glucoseproductie in de lever, ureagenese en lipolyse gekwantificeerd met behulp van het geperfuseerde levermodel van muizen

Dit protocol introduceert een techniek voor het induceren van modellen met polycysteus ovariumsyndroom (PCOS) bij muizen door middel van gecontroleerde afgifte van letrozol met behulp van minipompen. Onder adequate verdoving werd de minipomp subcutaan geïmplanteerd en PCOS werd met succes geïnduceerd bij de muizen na een bepaalde periode van de afgifte van de minipomp.

Een aangepaste techniek voor het induceren van polycysteus ovariumsyndroom bij muizen

Leer hoe u leverglucoseproductie kwantificeert in een PCOS-muismodel met behulp van stabiele isotopische glucose-tracers en GCMS-analyse. Deze methode biedt inzicht in glucosemetabolisme en pathogenese.

Evaluatie van leverglucoseproductie in een muismodel met polycysteus ovariumsyndroom

Meer video's verkennen