Aggregaatkwantificering automatiseren bij Caenorhabditis elegans
14 oktober 2021
Het volgende protocol beschrijft de ontwikkeling en optimalisatie van een high-throughput workflow voor het kweken van wormen, fluorescentie beeldvorming en geautomatiseerde beeldverwerking om polyglutamine aggregaten te kwantificeren als een beoordeling van veranderingen in proteostase.
Een eenvoudige aanpak werd gekozen om veranderingen in proteostase te monitoren door polyglutamineaggregatie te beoordelen en een raamwerk te bieden dat kan worden gebruikt voor toepassingen met een hoge doorvoer. Het scoren van een fenotype zoals het aantal aggregaten door ik kan subjectief worden. Het automatiseren van aggregaattellingen stelt ons in staat om dergelijke vertekeningen te elimineren, de doorvoer en reproduceerbaarheid te verhogen.
Deze methode helpt bij het identificeren van bacteriële genen die bijdragen aan verstoring van de proteostase van de gastheer. Het begrijpen van de bijdrage van individuele bacteriële genen zal ons helpen de implicatie ervan in de pathogenese van ziekten zoals Alzheimer, Parkinson en Huntington te begrijpen. Begin met het verwijderen van de platen met wormen uit de vriezer en laat ze ontdooien bij kamertemperatuur.
Veeg vervolgens overtollige condensatie weg en verwijder het deksel voordat u het in beeld brengt. Gebruik de microscoopinstellingen met een belichtingstijd van 500 milliseconden, een vergroting van 40 X met een 0,63 X cameraadapter en een GFP-intensiteit ingesteld op 100% tijdens het vastleggen van afbeeldingen. Pas nu de doorgelaten lichtregeling aan totdat de wormen fel verlicht lijken in vergelijking met de donkere achtergrond, waardoor overbelichting wordt vermeden.
Verander de posities van wormen in de put om overmatig samenklonteren te voorkomen door een pipetpunt van 10 microliter te gebruiken om wormen voorzichtig in de gewenste positie te duwen. Stel het kanaal in op het GFP-filter voor het instellen van een brandpuntsvlak voor beide afbeeldingen. Leg een helder veldbeeld vast.
Maak een overeenkomstig fluorescentiebeeld zonder de plaat te verstoren of de focus van de microscoop te veranderen. Download nu de CellProfiler om de afbeeldingen te beoordelen. Open de software en sleep de interessante afbeeldingen naar het vak afbeeldingen.
Klik op de afbeeldingen in de bestandslijst om ze te openen. Selecteer het vergrootglas om een interessant gebied te markeren en het pijlpictogram om de lengte van zowel wormen als aggregaten te meten. Plaats de muisaanwijzer op het gewenste object om de intensiteitswaarde te bepalen, die te zien is op het onderste gedeelte van het scherm.
Om de CellProfiler-beeldanalysepijplijn te gebruiken, geeft u de afbeeldingsparen de juiste naam zoals beschreven in het tekstmanuscript na het downloaden van de CellProfiler van de officiële website. Download de pijplijn en upload deze naar CellProfiler door bestand, import en pijplijn uit bestand te selecteren. Selecteer de module ontwarde wormen om de instellingen te openen om een trainingsset te laden die wordt gebruikt om wormen in de module voor ontwarde wormen te identificeren.
Identificeer vervolgens de bestandsnaam van de trainingsset. Selecteer het pictogram uploadbestand en upload ook het aanvullende bestand. Upload afbeeldingen door de afbeeldingsmodule in de linkerbovenhoek te selecteren.
En sleep vervolgens afbeeldingen met de juiste naam naartoe. Voordat u de afbeeldingen analyseert, selecteert u de gewenste uitvoermap die wordt gebruikt om de resultaten op te slaan door op de knop uitvoerinstellingen in de linkerbenedenhoek van het programma te klikken. Selecteer vervolgens het mappictogram rechts van de standaarduitvoer om de gewenste uitvoerlocatie te kiezen.
Selecteer het pictogram Afbeeldingen analyseren om de afbeeldingsanalyse te starten. Als de analyse te lang duurt en vastzit aan het verwerken van een enkele afbeelding, onderbreekt u de uitvoering en identificeert u de onbewerkte afbeelding door de uitvoermap te sorteren en op te merken welke afbeeldingsnaam niet wordt gevonden. Na volledige analyse organiseert de software de resultaten in een Excel-spreadsheet met individuele wormen in kolom N en het respectieve aantal aggregaten in kolom K.Download de metadata-organizer om gemakkelijk gegevens uit het CSV-uitvoerbestand van CellProfiler te organiseren.
Zoek voor Windows OS het gedownloade bestand en pak het uit naar de gewenste locatie. Zoek en open de uitgepakte map met de naam gui_Windowsos_64x. En start de applicatie door op het GUI-toepassingspictogram te klikken.
Er kan een prompt worden geopend waarin toestemming wordt gevraagd om uit te voeren. Selecteer meer info en klik dan toch op uitvoeren. De metadata organizer is nu klaar om CellProfiler output CSV-bestanden te slepen en neer te zetten.
Zoek voor Mac OS het gedownloade bestand en pak het toepassingsbestand voor bestandsmetagegevens uit. Open de uitgepakte map in downloads. Klik met de rechtermuisknop op de GUI-toepassing en selecteer openen.
Er verschijnt een prompt waarin om toestemming wordt gevraagd om te openen vanwege het ontbreken van een officiële licentie. Selecteer openen. Zodra uw metadata organizer-applicatie is geopend in het betreffende besturingssysteem, klikt u hier op uw bestanden uploaden of sleept u de gewenste CellProfiler CSV-bestanden.
Klik op de knop Organiseren, die de gebruiker naar een nieuw scherm brengt met een knop Bestanden downloaden. Klik op de knop en selecteer de gewenste locatie om het uitvoerbestand op te slaan. Het uitvoerbestand wordt weergegeven als de oorspronkelijke bestandsnaam met _organized extensie toegevoegd aan de bestandsnaam.
In aanwezigheid van FUDR hadden wormen die verschillende bacteriën kregen een consistentere lichaamsgrootte die een meer uniforme en nauwkeurige wormdetectie mogelijk maakte, waardoor het probleem van overbevolking werd opgelost. Het bevriezen van de wormen verbeterde de polyQ-aggregaatdetectie door de achtergrondfluorescentie te elimineren, evenals de nauwkeurigheid van geautomatiseerd tellen vergelijkbaar met handmatig tellen. Omgekeerde brightfield-verlichting werd gebruikt om het hele C.elegans- en GFP-kanaal te detecteren om polyQ YFP-aggregaten in beeld te brengen.
Wormdetectie, ontwarring en aggregaatkwantificering voor elke worm werden gedaan door een geoptimaliseerde CellProfiler-beeldverwerkingspijplijn toe te passen, waarmee het aantal aggregaten per individuele worm kan worden verkregen. Het verschil tussen de effectiviteit van geautomatiseerde aggregaatkwantificering en het gebruik van de CellProfiler-pijplijn was minimaal, wat aangeeft dat de geautomatiseerde methode kan worden toegepast op grootschalige schermen. Van de 90 geteste bacteriestammen vertoonde de kolonisatie van de darm van C.elegans met één kandidaat een significante afname van het aantal aggregaten.
De bevestigingsexperimenten door handmatig tellen onthulden dat geen van de mutanten, inclusief degene die het aantal aggregaten aanzienlijk verminderde, de polyQ-aggregatie beïnvloedde. Onderzoekers die besluiten dit raamwerk te gebruiken, moeten begrijpen dat de geschetste stappen niet absoluut zijn. Modificatie en een fundamenteel begrip van hoe CellProfiler te manipuleren zijn essentieel voor succes.
Aanvullende biochemische benaderingen zoals western blotting kunnen worden gebruikt om polyQ-aggregatie te bevestigen.
Overzicht
Deze studie ontwikkelt een high-throughput workflow voor het kweken van wormen, fluorescentie beeldvorming en geautomatiseerde beeldverwerking om polyglutamine aggregaten te kwantificeren als een maatstaf voor veranderingen in proteostase. De methode verbetert de beoordeling van deze aggregaten, met name bij het onderzoeken van hun rol bij neurodegeneratieve ziekten.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Onderzoeksgebied
- Proteostase
- Neurodegeneratieve ziekten
- High-throughput screening
Achtergrond
- Polyglutamine aggregatie is gekoppeld aan ziekten zoals Alzheimer's, Parkinson's en Huntington's.
- Het begrijpen van de bijdragen van bacteriële genen aan verstoring van proteostase is essentieel.
- Traditionele scoremethoden voor aggregaten kunnen subjectief zijn.
Gebruikte methoden
- High-throughput beeldvorming en analyse met behulp van CellProfiler
- C. elegans als biologisch model
- Geautomatiseerde kwantificering van polyglutamine aggregaten
Belangrijkste resultaten
- Geautomatiseerde beeldverwerking zorgt voor eliminatie van vooringenomenheid en verhoogde reproduceerbaarheid in het tellen van aggregaten.
- Geïdentificeerde bacteriële genen die de gastheren proteostase beïnvloeden met significante bevindingen in worm aggregaten aantallen.
- Gevalideerde resultaten geven aan dat automatisering vergelijkbaar is met handmatig tellen, wat grootschalige screenings ondersteunt.
Conclusies
- Deze studie biedt een betrouwbaar kader voor het bestuderen van proteostase door middel van polyglutamine aggregatie.
- De inzichten verkregen uit deze methode zijn relevant voor het begrijpen van mechanismen in neurodegeneratieve ziekten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Automating aggregate quantification in C. elegans addresses the need for high-throughput, bias-free assessment of proteostasis in neurodegenerative disease models. By standardizing image acquisition and CellProfiler-based analysis, the method enables reproducible screening of large compound or genetic libraries. This supports early target validation and mechanistic de-risking in discovery pipelines for protein conformational diseases.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying polyglutamine aggregation as a proxy for proteostasis disruption.
- Operational Value: Reduces subjectivity in phenotypic scoring, improving data reliability for target validation campaigns.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing quantitative, reproducible readouts for mechanism-based compound prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative aggregate counts per worm, enabling robust assay readouts for screening campaigns.
- Operational Value: Increases throughput and reproducibility through automation, reducing manual labor and inter-operator variability.
- Assay Readiness: Produces structured output (Excel spreadsheet with worm and aggregate counts) compatible with downstream data analysis workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links C. elegans proteostasis models to human neurodegenerative disease mechanisms via conserved polyQ aggregation pathways.
- Mechanistic De-risking: Facilitates identification of bacterial or genetic modifiers of aggregation, supporting target validation in disease-relevant systems.
- Predictive Confidence: Enables cross-functional teams to compare conditions using normalized, automated aggregate quantification.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing quantitative proteostasis readouts that inform go/no-go decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on proteostasis mechanisms by enabling objective, high-content aggregation phenotyping.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized worm imaging and analysis compatible with 96-well or larger format screens.
- Analytics: Produces quantifiable dependent variable measurements (aggregates per worm) that allow statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects invertebrate model findings to human disease pathways through conserved aggregation biology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis pipeline adaptable to multiple proteostasis targets and screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by eliminating bias from manual aggregate counting.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized image processing and automated data output.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling large-scale screens with reduced hands-on time and higher data quality.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions through reliable, quantitative proteostasis biomarkers.
Implementation Considerations
- Requires familiarity with fluorescence microscopy and GFP/YFP imaging parameters for polyQ detection.
- Depends on CellProfiler software and associated pipeline configuration for automated worm and aggregate segmentation.
- Necessitates standardized image naming and folder organization for successful batch processing.
- Benefits from FUDR treatment to reduce worm size variability and improve detection accuracy in high-density wells.
- Relies on user training to adapt the pipeline for different worm strains, expression patterns, or imaging setups.
