Productie van siRNA-geladen lipide nanodeeltjes met behulp van een microfluïdisch apparaat
22 maart 2022
Microfluïdische productiemethoden voor lipide nanodeeltjes (LNP) hebben de aandacht getrokken in medicijnafgiftesystemen (DDS'en), waaronder RNA-afgifte. Dit protocol beschrijft de fabricage, LNP (siRNA-loaded LNP) productie en LNP evaluatie processen met behulp van ons originele microfluïdische apparaat genaamd iLiNP.
De grootte van lipide nanodeeltjes beïnvloedt de biodistributie, het antitumoreffect en de genuitschakelingsprestaties. Daarom is de LNP-groottecontrolemethode een effectieve techniek voor het produceren van nanogeneesmiddelen, waaronder RNA-afgiftesystemen. Dit originele microfluïdische apparaat, het iLiNP-apparaat genaamd, was in staat om de LNP-grootte variërend van 20 tot 100 nanometer met intervallen van 10 nanometer te regelen.
Het iLiNP-apparaat kan niet alleen siRNA-geladen LNP's produceren, maar ook alle mRNA-geladen LNPS en ribonucleoproteïne geladen LNP's. Neem om te beginnen de lipide-ethanoloplossingen en produceer de siRNA-geladen LNP's door DOTAP-, DSPC-, cholesterol- en DMG-PEG2k-oplossingen te mengen in een molaire verhouding van 50 tot 10 tot 38,5 tot 1,5. Pas de totale lipideconcentratie aan op acht millimolar.
Neem vervolgens de waterige oplossingen van 154 millimolar zoutoplossing en 25 millimolar acetaatbuffer bij pH 4 en filter ze door 0,2 micrometer membraanfilters of spuitfilters. Bereid de siRNA-bufferoplossing door 70 microgram siGL4 op te lossen in één milliliter 25 millimolaire acetaatbuffer. Vul glazen spuiten van één milliliter met respectievelijk lipide- en waterige oplossingen.
Sluit de glazen spuiten aan op de piekcapillaris met behulp van spuitconnectoren, stel vervolgens het debiet van de lipide- en waterige oplossingen in en introduceer de lipide- en waterige oplossingen afzonderlijk in het iLiNP-apparaat met behulp van spuitpompen. Verzamel de LNP-suspensies in een microbuis uit de uitlaat van het iLiNP-apparaat. Dialyseer de LNP-suspensie met behulp van een dialysemembraan van 12 tot 14 kiloDalton moleculaire gewichtsafsnijdingen bij vier graden Celsius 's nachts tegen zoutoplossing of DPBS voor respectievelijk POPC LNP's en siRNA-geladen LNP's.
Verzamel de gedialyseerde LNP-suspensies in microbuisjes en pipetteer vervolgens 20 tot 30 microliter van de LNP-suspensie naar een microkwartscel. Meet ten slotte de LNP-grootte, LNP-grootteverdeling en polydispersiteitsindex door dynamische lichtverstrooiing. POPC LNP-grootteverdeling geproduceerd bij verschillende stroomomstandigheden, zoals het totale debiet en de stroomsnelheidsverhoudingen worden hier weergegeven.
Nauwkeurige LNP-maten variërend van 20 tot 100 nanometer kunnen worden geregeld met behulp van dit iLiNP-apparaat. Kleine LNP's worden gevormd bij hoge totale stroomsnelheidsomstandigheden. Bovendien zijn de LNP-maten die bij de FRR 5 worden gevormd kleiner dan die van de FRR 3, ongeacht het totale debiet.
De grootteverdeling van siRNA-geladen LNP's wordt hier weergegeven. siRNA's worden ingekapseld in de LNP's door elektrostatische interactie tussen het kationische lipide DOTAP en de negatief geladen siRNA's. Het iLiNP-apparaat produceerde 90 nanometer siRNA geladen kationische LNP's met een smalle verdeling.
De siRNA-inkapselingsefficiëntie was 95% vanwege de elektrostatische interactie tussen het kationische lipide en de negatief geladen siRNA's. Cytotoxiciteit en de gen-uitschakelingsactiviteit van de 19 nanometer siRNA geladen LNP's werden geëvalueerd. siRNA geladen LNP's vertoonden cytotoxiciteit bij een dosis van 10 tot 100 nanomolair siRNA.
Het expressieniveau van luciferase was verlaagd afhankelijk van de siRNA-concentratie. De siRNA geladen LNP's onderdrukten 80% luciferase expressie bij een dosis van 100 nanomolaire siRNA. Optimalisaties van de flowcondities zijn de belangrijkste stappen in het protocol om de gewenste grootte LNP's te verkrijgen.
De op microfluïdische basis gebaseerde LNP-productiemethode inclusief het iLiNP-apparaat vereist geen ingewikkelde procedure en zal naar verwachting worden gebruikt als de standaard LNP-productiemethode.
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor de productie van met siRNA geladen lipidenanodeeltjes (LNPs) met behulp van een microfluidisch apparaat genaamd iLiNP. De methode maakt een nauwkeurige controle over de LNP-grootte mogelijk, wat cruciaal is voor effectieve systemen voor genezismiddelenafgifte.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Drug-deliverysystemen
- Lipide nanodeeltjes
- Microfluidica
Achtergrond
- De grootte van lipide nanodeeltjes beïnvloedt de biodistributie en therapeutische effectiviteit.
- Controle over de LNP-grootte is essentieel voor het optimaliseren van de RNA-afgifte.
- Het iLiNP-apparaat maakt groottecontrole mogelijk van 20 tot 100 nanometer.
- Elektrostatische interacties faciliteren de inkapseling van siRNA in LNPs.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een betrouwbare methode voor de productie van siRNA-geladen LNP's.
- Het evalueren van de impact van de LNP-grootte op de efficiëntie van gene silencing.
- Het optimaliseren van de stroomcondities voor de gewenste LNP-kenmerken.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van lipide- en waterige oplossingen voor de productie van LNP's.
- Gebruik van het iLiNP-apparaat voor het mengen en de vorming van LNP's.
- Dialyse van LNP-suspensies om overtollige materialen te verwijderen.
- Dynamische lichtverstrooiing om de LNP-grootte en -distributie te meten.
Belangrijkste Resultaten
- Het iLiNP-apparaat produceerde siRNA-geladen LNP's met een grootte van 90 nanometers en een inkapselingsefficiëntie van 95%.
- Kleine LNP's werden gevormd onder condities met een hoge totale stroomsnelheid.
- siRNA-geladen LNP's vertoonden cytotoxiciteit en effectieve gen-silencing.
- Geoptimaliseerde stroomcondities waren cruciaal voor het bereiken van de gewenste LNP-groottes.
Conclusies
- De microfluïdische methode met gebruik van het iLiNP-apparaat vereenvoudigt de productie van LNP's.
- Van deze aanpak wordt verwacht dat deze de LNP-productie in het onderzoek zal standaardiseren.
- Verdere studies kunnen de toepassing van deze methode in diverse RNA-afgiftesystemen onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor het management
Precieze controle over de grootte van lipid nanodeeltjes (LNP) is cruciaal voor het optimaliseren van de biodistributie, therapeutische effectiviteit en de prestaties van gene silencing in RNA-gebaseerde systemen voor geneesmiddelentoediening. Het iLiNP microfluidische apparaat maakt reproduceerbare LNP-productie mogelijk met een instelbare grootte van 20 tot 100 nanometer, wat workflows voor vroege targetvalidatie en lead-identificatie ondersteunt. Deze mogelijkheid vergroot het voorspellend vertrouwen in preklinische modellen door de variabiliteit in de prestaties van nanodeeltjes te verminderen, een sleutelfactor bij het beperken van risico's voor translationele vooruitgang.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om de grootte-afhankelijke biologische activiteit van siRNA-geladen LNP's te onderzoeken in assays voor doelvalidatie.
- Operationele waarde: Biedt gestandaardiseerde LNP-formuleringen om ruis te verminderen bij fenotypische screening en studies voor mechanische risicoreductie.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert monodisperse siRNA-LNP's met een gedefinieerde grootte en een inkapselingsefficiëntie van 95% voor een betrouwbare evaluatie van verbindingen.
- Operationele waarde: Ondersteunt de standaardisatie van assays door reproduceerbare controle over de LNP-grootte via aanpassing van de stroomsnelheid in het iLiNP-apparaat.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert de correlatie tussen de grootte van LNP's en de efficiëntie van gene silencing en cytotoxiciteit in ziekterelevante systemen.
- Operationele waarde: Maakt schaalbare productie mogelijk van mRNA-, siRNA- en ribonucleoproteïne-geladen LNP's voor preklinische continuïteit.
Integratie van Pipeline & Workflow
De iLiNP-microfluïdische methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinische ontwikkeling, in het bijzonder voor RNA-therapeutica waarbij de grootte-afhankelijke aflevering de effectiviteit beïnvloedt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door systematische variatie van LNP-grootte mogelijk te maken om de impact op cellulaire opname en target-interactie te beoordelen.
- Screening: Levert assay-klare LNP-formuleringen met een consistente grootteverdeling en een hoge siRNA-inkapseling voor reproduceerbare screening van verbindingen.
- Analytics: Levert kwantitatieve gegevens over grootte, polydispersiteit en zetapotentiaal via dynamische lichtverstrooiing om go/no-go-beslissingen te onderbouwen.
- Translationeel onderzoek: Verbindt LNP-optimalisatie in de ontdekkingsfase met preklinische evaluatie via gestandaardiseerde, grootte-gecontroleerde nanomedicijnen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor het produceren van diverse RNA-geladen LNP's (siRNA, mRNA, RNP) over meerdere projecten heen.
Operationele en bedrijfskundige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verbetert het vertrouwen in het target door LNP-fysisch-chemische eigenschappen te koppelen aan functionele resultaten zoals gene silencing.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van de LNP-productie door microfluïdische precisie.
- Strategische waarde: Vermindert biologische risico's in een laat stadium door het vroegtijdig minimaliseren van risico's met betrekking tot de prestaties van het aflevervoertuig.
- Impact op portfolio: Informeert de risico-gecorrigeerde prioritering van RNA-therapeutische kandidaten op basis van de afleverings-efficiëntie.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in lipideformulering, microfluïdische handling en het laden van nucleïnezuren.
- Is afhankelijk van spuitpompen, glazen spuiten en dialyse-infrastructuur voor de zuivering van LNP's.
- Necessiteert standaardisatie van stroomsnelheidsverhoudingen en totale stroomcondities tussen teams.
- Houdt rekening met aanpassingen bij het wijzigen van lipidesamenstellingen of RNA-cargo-types.
- Wordt beperkt door de noodzaak van post-productie dialyse en dynamische lichtverstrooiing voor kwaliteitscontrole.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:54
Preparation of Lipid Solutions and the siRNA/ Buffer Solution
1:58
Set-Up of the iLiNP Device and Production of LNPs
2:35
Dialysis of the LNP Suspension and LNP Size Measurement
3:24
Results: POPC LNP Size Distributions Produced by the iLiNP Device at Different Flow Rate Ratios and Characterization and Cytotoxicity of siRNA-Loaded LNPs
5:22
Conclusion
