Pyrosequencing: een eenvoudige methode voor Nauwkeurige Genotyping

Genetisch onderzoek heeft enorm geprofiteerd van de publicatie van de sequentie van het menselijk genoom. Pyrosequencing is een uniek systeem waarmee genetische variatie, RNA-allelische onbalans, DNA-methyleringsstatus en het kopie-aantal van genen kunnen worden geanalyseerd. In deze video demonstreren we een basis pyrosequencing-reactie voor genetische analyse.

Hoi, ik ben Kristy King van het laboratorium van Dr. Charles Eby en Dr. Brian Gage van de afdeling Interne Geneeskunde aan de Washington University School of Medicine. Vandaag gaan we u een procedure voor pyrosequencing laten zien. Deze procedure is nuttig omdat het een van de meest grondige en tegelijkertijd eenvoudige methoden is die worden gebruikt om SNP's te analyseren.

Pyrosequencing is gebaseerd op sequencing door synthese, waarbij gebruik wordt gemaakt van de afgifte van pyrofosfaat telkens wanneer een nucleotide wordt ingebouwd in een open 3'-DNA-streng. Zodra een plaat is geladen, worden nucleotiden ingebouwd op basis van een door de software opgegeven sequentie. Het vrijgekomen pyrofosfat wordt gebruikt in een reactie die leidt tot de afgifte van ATP, dat door luciferase wordt gebruikt om luciferine om te zetten in oxyluciferine, wat resulteert in de emissie van licht. Het gedetecteerde licht wordt opgevangen door een CCD-camera en geregistreerd als pieken, ook wel pyrogrammen genoemd.

Alle nucleotiden die niet in de DNA-streng zijn ingebouwd, worden afgebroken door AP pyra om achtergrondruis te voorkomen. Deze procedure omvat de volgende stappen: assay-ontwerp, PCR-gelelektroforese voor kwaliteitscontrole en pyrosequencing.

Laten we beginnen met pyrosequencing. Om pyrosequencing uit te voeren, moet eerst een PCR-product worden klaargemaakt. Voor pyrosequencing zijn meer cycli nodig dan bij de meeste PCR-reacties om ervoor te zorgen dat alle primer wordt verbruikt, ongeveer 50 cycli.

Pyrosequencing vereist daarnaast dat een van de PCR-primers is gebiotinyleerd. Ten slotte is het belangrijk op te merken dat er ook een interne primer nodig is. Voor een efficiënt assay-ontwerp kan software worden gebruikt die bij de pyrosequencing wordt geleverd, om er zeker van te zijn dat er geen contaminatie aanwezig is.

Om te bevestigen dat het PCR-product aanwezig is, moet er een gel worden gedraaid voor enkele monsters en een negatieve controle. Voeg voor het maken van de pyrosequencingplaat 12 µL van de pyrosequencing-primermix toe aan de 96-well pyrosequencingplaat. Hiervoor is een mengsel nodig van 43,2 µL van de interne primer, samen met 1396,8 µL van een annealing-buffer; dek de pyrosequencingplaat af met adhesieve folie.

Als de voorbereiding langer dan 50 minuten duurt, voeg dan aan elke well van de 96-well PCR-plaat 70 µL SRO speed mix toe, bestaande uit 240 µL streptavidine-gecoate sero speeds 4, 560 µL bindingsbuffer (samengesteld uit tris, natriumchloride, EDTA en tween 20) en 3.600 µL water, en sluit het deksel stevig. Plaats de 96-well PCR-plaat met het kraalmengsel gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur in een plaatshaker.

Zorg ervoor dat het deksel goed vastzit om kruiscontaminatie tussen de wells te voorkomen. Deze stap maakt een grondige binding mogelijk van de met strep ENC gecoate spheros-beads aan de biotinylering-tag die zich op de PCR-primer bevindt. Richt een werkstation in voor het voorbereiden van de platen.

Dit omvat de reagensbakken, het plateau voor het PCR-product en de bead-mix en het plateau voor de pyrosequencing-primers. Zorg ervoor dat zowel het plateau voor het PCR-product en de bead-mix als het plateau voor de pyrosequencing-primers correct zijn uitgelijnd, zodat de negatieven in dezelfde oriëntatie staan. Schud vóór het overbrengen van monsters de vacuümtool, die is uitgeschakeld, in schoon water om eventuele beads of debris die erop zitten los te maken.

Gooi het resterende water weg, vul het reservoir opnieuw en schakel de vacuümpomp in. Laat het vacuümhulpmiddel in het reservoir blijven totdat al het water is verwijderd, wat ongeveer 30 seconden duurt. Plaats de filtertips van het vacuümhulpmiddel in de wells van de PCR-beadmixplaat en laat deze daar blijven totdat alle vloeistof uit de plaat is verwijderd.

Voorzichtig schudden kan worden gebruikt om oppervlaktespanning te voorkomen. Plaats het vacuüm in het reservoir met 70% ethanol zodra de vloeistof door de slang begint te stromen. Laat de filtertips vijf seconden lang de ethanol opzuigen.

Herhaal dit voor de 0,2 molar natriumhydroxide, die het DNA denatureert tot enkelstrengs PCR, en voor de wasbuffer om het PCR-product te reinigen en te neutraliseren. Koppel de vacuümslang los van het vacuüminstrument en plaats het vacuüminstrument in de pyrosequencingplaat die de pyrosequencingprimer in een annealingsbuffermengsel bevat.

Als de vacuümslang nog is aangesloten, zal het primermengsel worden opgezogen wanneer deze in de pyrosequencingplaat wordt geplaatst. De tips zorgen er dan voor dat u uw PCR-product verliest. Schud of wieg de vacuümtips voorzichtig in de putjes van de pyrosequencingplaat om uw PCR-product te verspreiden.

Verwijder het vacuüminstrument uit de pyrosequencingplaat zodra het schudden of wiegen is voltooid, sluit het vacuüminstrument opnieuw aan op de slang en plaats het instrument in schoon water om het te reinigen voor de volgende plaat. Plaats de pyrosequencingplaat gedurende twee minuten op een warmteblok bij 80 °C. Verwijder de plaat na twee minuten van het warmteblok en plaats deze op een koel oppervlak.

Zodra de plaat is afgekoeld, kan een plakfolie worden gebruikt om de plaat af te dekken, tenzij de plaat binnen 15 minuten wordt geanalyseerd om verdamping te voorkomen. Nu is het tijd om te beginnen met pyrosequencing. De eerste stap van pyrosequencing is het invoeren van de assaygegevens in de computer.

Select onder simplex entry de nieuwe vermelding en voer de assay-informatie in, inclusief een ID-naam en de te analyseren sequentie, welke wordt verstrekt door de assay-ontwerpsoftware en kwaliteitscontrole mogelijk maakt; selecteer de doseervolgorde, die de sequentie rond de SNP plus controlebasen biedt. Selecteer tot slot de histogrammen om een visuele weergave te krijgen van hoe uw pyrogram eruit moet zien. Het is nu tijd om een SNP-run in te voeren.

Voer onder het tabblad 'snip runs' en het algemene tabblad een run-naam in en selecteer de instrumentparameters voor de run. Selecteer onder het tabblad 'setup' de assay-vermelding en klik en sleep over de plaat. Let bij het invoeren van de gewenste assay in uw plaat op dat de gehele plaat niet hoeft te worden gebruikt; u kunt verschillende wells voor analyse inactiveren, en er kunnen veel verschillende assays op dezelfde plaat worden uitgevoerd.

Klik op het tabblad view en selecteer vervolgens Run. Deze pagina vermeldt de juiste volumes nucleotiden, enzym en substraat die nodig zijn voor de run. Maak zowel de nucleotide- of capillairtips als de reagentiatips schoon vóór gebruik.

Vul de tips met water en oefen druk uit op de bovenkant van de tip om te controleren op eventuele blokkades. Als er geen water uit de onderkant van de tip spuit, leeg en vul deze dan enkele keren bij om te proberen het water erdoorheen te forceren. U kunt de tips ook soniceren als de tip geblokkeerd blijft.

Gooi de tips weg en neem nieuwe tips. Het enzym en het substraat moeten voor gebruik worden geresuspendeerd met water. Om te voorkomen dat er door schudden luchtbellen ontstaan die tipverstoppingen of een inconsistente dispensatie kunnen veroorzaken, kunnen ongebruikte geresuspendeerde enzymen en substraten worden bewaard bij minus 20 graden Celsius.

Voor toekomstig gebruik van capillaire doseertips in een microcentrifugebuis, maak een één-op-één verdunning met de nucleotiden en te buffer P eight. Meng goed voor gebruik. Vul de nucleotide- en reagentiantips met de juiste volumes volgens de door de software gesuggereerde hoeveelheden.

Dispenseer de vloeistof voorzichtig langs de wanden van de tips om te voorkomen dat er luchtbellen in komen die verstoppingen kunnen veroorzaken. Controleer zorgvuldig de nucleotide-dispensertips op luchtbellen. Als er luchtbellen aanwezig zijn, tik dan simpelweg tegen de zijkant van de tips tot de luchtbellen naar boven komen of verwijder ze met een schone pipetpunt.

Voer een testplaat uit na het vullen van de cartridge. Plaats de cartridge in het pyrosequencing-instrument en de testplaat in het platform voor 96-wells platen. Door een adhesieve folie over de plaat te plaatsen, kan de dispensatie van reagentia en nucleotiden gemakkelijk worden waargenomen.

Selecteer het instrumenttabblad aan de linkerkant van het scherm en klik vervolgens op beheren. Selecteer het instrument uit het vervolgkeuzemenu. Klik op testen, waarna er een waarschuwing verschijnt.

U wordt gevraagd te controleren of de testplaat in het instrument is geplaatst. Klik op oké. Zodra dit is voltooid, verwijdert u de testplaat; in het midden van de plaat moeten zich vloeistofdruppels over zes van de wells bevinden, die de vier nucleotiden, het enzym en het substraat vertegenwoordigen.

Als er minder dan zes kleine stippen zijn, is er een verstopping opgetreden en moeten de tips worden gecontroleerd en vrijgemaakt van eventuele blokkades. Plaats de plaat in het pyrosequencing 96-well plaatplatform. Sluit alle hendels en klik op 'run' voor de individuele plaat.

Stel de run in; het enzym, het substraat en de nucleotiden worden in de vooraf bepaalde volgorde gedispenseerd. Zodra de run door de pyrosequencer is geanalyseerd, is het tijd om de resultaten te bekijken. Blauwe wells vertegenwoordigen een geslaagd genotype en pyro.

Oranje wells vereisen menselijke tussenkomst en kunnen worden bewerkt door op de betreffende well te klikken en het voorspelde histogram te openen. Een genotype kan worden goedgekeurd, afgekeurd of gecontroleerd, en het genotype zelf kan op de juiste wijze worden gewijzigd. Zodra een well is bewerkt, verschijnt er een donkere cirkel op de plaatkaart.

Negatieve controles moeten als negatief worden gescoord. Er kunnen aspecifieke pieken in de negatieve wells voorkomen, maar deze worden doorgaans veroorzaakt door looping van de interne primer. We hebben u hiermee getoond hoe u een polymorfisme in menselijk genomisch DNA kunt sequensen.

DNA Pyrosequencing is nuttiger dan andere sequenceringsprocedures omdat het aanpasbaar is aan een breed scala aan toepassingen. Het is bovendien robuust genoeg om DNA uit elke bron te verwerken, inclusief DNA met een lage concentratie of gedegradeerd DNA. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat men moet beginnen met een goed gezuiverd PCR-product.

Voeg voor elke assay een negatieve controle toe en zorg ervoor dat al uw reagentia van goede kwaliteit zijn. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.