Pyrosequencing: een eenvoudige methode voor Nauwkeurige Genotyping
January 8th, 2008
Pyrosequencing (R) is een van de meest grondige toch eenvoudige methoden tot op heden gebruikt om de polymorfismen te analyseren. Deze methode heeft geleid tot een snelle en efficiënte single-nucleotide polymorfisme evaluatie met inbegrip van vele klinisch relevante polymorfismen. De techniek en de methodologie van Pyrosequencing wordt uitgelegd.
Geneticaonderzoek heeft enorm geprofiteerd van de publicatie van de menselijke genoomsequentie. Pyro sequencing is een uniek systeem dat de analyse van genetische variatie mogelijk maakt, evenals RNA Allelische onbalans, DNA, methyleringsstatus en genkopienummer. In deze video demonstreren we een basis pyro sequencing reactie voor genetische analyse.
Hallo, ik ben Kristy King van het laboratorium van Dr.Charles Eby en Dr.Brian Gage in de afdeling Interne Geneeskunde van de Washington University School of Medicine. Vandaag laten we u een procedure voor pyro sequencing zien. Deze procedure is nuttig omdat het een van de meest grondige en eenvoudige methoden is die worden gebruikt om SNPs te analyseren.
Pyro sequencing is gebaseerd op sequencing door synthese, waarbij gebruik wordt gemaakt van de afgifte van pyrofosfaat wanneer een nucleotide wordt opgenomen in een open drie prime DNA-streng. Zodra een plaat is geladen, worden nucleotiden opgenomen op basis van een sequentie die wordt geleverd door de software. Zodra het pyrofosfaat is vrijgegeven, wordt het gebruikt in een reactie die resulteert in de afgifte van een TP, die wordt gebruikt door luciferase om Lucifer om te zetten in oxy Lucifer, wat resulteert in de emissie van licht. Het toegelaten licht wordt verzameld door een CCD-camera en geregistreerd als pieken, ook wel pyro's genoemd.
Alle nucleotiden die niet in de DNA-streng zijn opgenomen, worden afgebroken door AP pyra om achtergrondruis te voorkomen. Deze procedure omvat de volgende stappen. Assayontwerp, PCR-gelelektroforese voor kwaliteitscontrole en pyro sequencing.
Dus laten we beginnen met pyro sequencing. Om pyro sequencing uit te voeren, moet eerst een PCR-product worden voorbereid. PCR voor pyro sequencing vereist meer cycli dan de meeste PCR's om ervoor te zorgen dat alle primer ruwweg 50 cycli wordt opgebruikt.
Pyro sequencing vereist ook dat een van de PCR-primers gebiotinyleerd is. Ten slotte is het belangrijk op te merken dat een intern primer ook vereist is. Efficiënt assayontwerp kan worden uitgevoerd met software die wordt geleverd door pyro sequencing om ervoor te zorgen dat er geen besmetting aanwezig is.
En om te bevestigen dat het PCR-product aanwezig is, moet een gel worden uitgevoerd op een paar monsters evenals een negatieve controle. Om de pyro sequencing plaat toe te voegen, moet 12 microliter van de pyro sequencing primer mix worden toegevoegd aan de 96-wel pyro sequencing plaat. Dit vereist een mengsel van 43,2 microliter van de interne primer, samen met 1396,8 microliter van een knielingsbuffer. Dek de pyro sequencing plaat af met kleeffolie.
Als de instelling langer duurt dan 50 minuten voor elk van de 96-wel PCR-product, moet 70 microliter SRO speed mix worden toegevoegd dat 240 microliter streptavidine gecoate sero speeds bevat. 4, 560 microliter van bindbuffer, die is gemaakt van triss natriumchloride, EDTA en tween 20 en 3, 600 microliter van water en vervang het deksel stevig. Plaats de 96-wel PCR-productplaat met de bead mix in een plaatshaker gedurende vijf minuten op kamertemperatuur.
Zorg ervoor dat het deksel is beveiligd om kruisbesmetting tussen de putjes te voorkomen. Deze stap zorgt voor een grondige knieling van de strep ENC, gecoate spheros beads naar de biotin tag die zich op de PCR primer bevindt. Zet een werkstation op voor het voorbereiden van de platen.
Dat omvat de reagentenbakken, PCR-product en bead mix lade en de pyro sequencing primer lade. Zorg ervoor dat de PCR-product en bead mix plaat evenals de pyro sequencing primer lade goed zijn uitgelijnd, zodat de negatieven in dezelfde oriëntatie zijn. Voordat u monsters overbrengt, schudt u het vacuümgereedschap, dat is uitgeschakeld in schoon water om eventuele korrels of puin dat erop kan zitten los te maken.
Gooi het resterende water weg, vul de bak opnieuw en zet het vacuüm aan. Laat het vacuümgereedschap in de bak totdat al het water is verwijderd, wat ongeveer 30 seconden is. Plaats de filtertips van het vacuümgereedschap in de putjes van de PCR bead mix plaat en laat het erin blijven totdat al het vocht uit de plaat is verwijderd.
Zacht schudden kan worden gebruikt om oppervlaktespanning te voorkomen. Plaats het vacuüm in de 70% ethanol bak wanneer het vocht door de buis begint te stromen. Laat de filtertips vijf seconden het ethanol opsluipen.
Herhaal dit voor de 0,2 molare natriumhydroxide, die het DNA denatureert naar enkelstrengs PCR en voor de wasbuffer. Om het PCR-product te reinigen en te neutraliseren. Ontkoppel de vacuümslang van het vacuümgereedschap en plaats het vacuümgereedschap in de pyro sequencing plaat die het pyro sequencing primer in een knielings buffer mix bevat.
Als de vacuümslang nog steeds is verbonden, wanneer deze in de pyro sequencing plaat wordt geplaatst, zal het primer mix doorgezogen worden. De tips veroorzaken dat u uw PCR-product verliest. Schud voorzichtig of schud de tips van het vacuüm in de putjes van de pyro sequencing plaat om uw PCR-product te verspreiden.
Verwijder het vacuümgereedschap uit de pyro sequencing plaat zodra het schudden of schommelen voltooid is en sluit het vacuümgereedschap opnieuw aan op de slang en plaats het gereedschap in het schone water om het te reinigen voor de volgende plaat. Plaats de pyro sequencing plaat op een warmteblok gedurende twee minuten bij 80 graden Celsius. Verwijder de plaat na twee minuten uit de warmteblok en plaats deze op een koele ondergrond.
Zodra het is afgekoeld, kan kleeffolie worden gebruikt om de plaat te bedekken, tenzij de plaat binnen 15 minuten wordt gebruikt om verdamping te voorkomen. En nu is het tijd om met pyro sequencing te beginnen. De eerste stap van pyro sequencing is het invoeren van de assaygegevens in de computer.
Onder eenvoudige invoer, selecteert u de nieuwe invoer en voert u assayinformatie in, inclusief een ID-naam en de sequentie om te analyseren, die wordt geleverd door de assayontwerpsoftware en toelaat voor kwaliteitscontrole. Selecteer de dispensorvolgorde, die de sequentie rond de SNP plus controlebasen biedt. Selecteer ten slotte histogrammen om een visuele weergave te geven van hoe uw pigram eruit zou moeten zien. Nu is het tijd om een snip run in te voeren.
Onder de snip runs en het algemene tabblad, voert u een runnaam in en selecteert u instrumentparameters voor de run.
Overzicht
Dit artikel bespreekt Pyrosequencing, een methode voor het analyseren van genetische polymorfismen. Het benadrukt de efficiëntie van de techniek bij het evalueren van single-nucleotide polymorfismen (SNP's) en de toepassing ervan in genetische analyse.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Genetica
- Genoomanalyse
- Biotechnologie
Achtergrond
- De sequentie van het menselijk genoom heeft genetisch onderzoek gevorderd.
- Pyrosequencing maakt een gedetailleerde analyse van genetische variaties mogelijk.
- Het is vooral nuttig voor het evalueren van RNA allelische onbalans en DNA-methylatie.
- De methode is gebaseerd op sequencing door synthese.
Doel van het onderzoek
- Om de procedure voor Pyrosequencing te demonstreren.
- Om de methodologie voor het analyseren van SNP's uit te leggen.
- Om inzichten te geven in assayontwerp en kwaliteitscontrole.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van PCR-producten met biotinyleerde primers.
- Gebruik van een 96-well plate voor Pyrosequencing reacties.
- Incorporatie van nucleotiden en detectie van uitgezonden licht.
- Kwaliteitscontrole door middel van gelelektroforese.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle demonstratie van een basis Pyrosequencing reactie.
- Efficiënt assayontwerp bevestigd door softwaretools.
- Kwaliteitscontrolemaatregelen verzekerden nauwkeurige resultaten.
- Lichtemissie correleerde met nucleotiden incorporatie.
Conclusies
- Pyrosequencing is een betrouwbare methode voor SNP-analyse.
- De techniek vereenvoudigt de evaluatie van genetische polymorfismen.
- Het heeft significante toepassingen in klinische genetica.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Pyrosequencing enables rapid, accurate genotyping and quantitative analysis of genetic polymorphisms, supporting high-confidence target validation and biomarker discovery in biopharma R&D. Its ability to resolve SNPs, indels, and methylation status with internal quality control enhances predictive confidence at critical discovery inflection points. This standardized, scalable method strengthens portfolio decision-making by reducing ambiguity in genetic variant assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of genetic variants relevant to therapeutic hypotheses.
- Supports functional target validation by quantifying allele-specific expression and methylation.
- Facilitates biological de-risking through robust detection of SNPs and indels.
- Improves predictive confidence for advancing genetic targets in the pipeline.
Screening & Assay Development
- Prepares validated genotyping assays for downstream screening workflows.
- Delivers reproducible, quantitative outputs for assay standardization.
- Supports high-throughput analysis using 96-well plate formats.
- Enables reliable evaluation of compound effects on genetic variants.
Translational & Preclinical Research
- Aligns genetic variant analysis with disease-relevant biomarkers when supported by sample type.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by quantifying allele frequencies and methylation.
- Reduces translational risk by providing quantitative, reproducible genetic data.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on robust genotyping outputs.
Pipeline & Workflow Integration
Pyrosequencing integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, providing a standardized genotyping platform across the R&D continuum.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling accurate SNP and methylation analysis.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible genotyping data for compound screening and validation.
- Analytics: Provides quantitative readouts and internal controls for confident comparison of genetic conditions.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and continuity when genetic variants are linked to disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, standardized genotyping capability adaptable to diverse project needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in genetic analyses.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of genotyping workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust genetic data early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of genetic targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in PCR assay design and genotyping analysis.
- Needs access to pyrosequencing instrumentation and analytical software.
- Demands rigorous cross-team standardization for assay setup and quality control.
- Adaptable to various DNA sources, including low-concentration or degraded samples.
- Dependent on high-quality PCR products and validated controls for reliable outputs.
