Name: Gecombineerde mechanische en enzymatische dissociatie van hippocampusweefsel van muizenhersenen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Leer een gecombineerde mechanische en enzymatische dissociatiemethode voor hippocampusweefsel van muizen. Dit protocol levert hoog levensvatbare enkele-celsuspensies op voor gedetailleerde cellulaire analyses.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken Aimee Rogers voor het bieden van hands-on training en voortdurende productondersteuning. We bedanken Dr. Amanda Burke voor het voortdurend oplossen van problemen en het verduidelijken van discussies. We bedanken Meredith Joheim en de UAMS Science Communication Group voor de grammaticale redactie en opmaak van dit manuscript. Deze studie werd ondersteund door NIH R25GM083247 en NIH 1R01CA258673 (A.R.A).

Experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de ethische normen die zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van UAMS. 6 maanden oude vrouwelijke C57Bl6 / J wild-type muizen werden gekocht en gehuisvest (4 muizen per kooi) onder een constante 12 uur licht / donker cyclus.
1. Bereiding van reagentia
<ol><li>Bereid een oplosbare oplossing voor levende/dode vlekken. Reconstitueer de fluorescerende vlek met 20 μL dimethylsulfoxide (DMSO).</li>
	<li>Wikkel de injectieflacon in folie, label deze als "Reconstituted" en bewaar deze bij -20 °C gedurende maximaal zes maanden.</li>
	<li>Bereid een 0,9% zoutoplossing met heparine. Verdun de inhoud van één injectieflacon heparinenatrium (10.000 USP-eenheden per 10 ml) in 1 l dubbel gedestilleerd water (ddH2O).</li>
	<li>Bereid voldoende voor op ongeveer 45 ml per dier en bewaar bij 4 °C gedurende maximaal een week.</li>
	<li>Maak 1% paraformaldehyde (PFA).<ol>
<li>Verwarm in een zuurkast een kookplaat tot 50 °C. Verwarm in een magnetron 100 ml ddH2O in een glazen bekerglas tot ongeveer 60 °C. Voeg een magnetische roerstaaf toe en breng over op de hete plaat.</li>
		<li>Weeg in de zuurkast 1 g PFA af en voeg toe aan het bekerglas ddH2O. Voeg 0,1125 g NaOH-kristallen toe en meng tot het is opgelost (5-10 min).</li>
		<li>Voeg 0,4 g NaPO4- monobasisch toe en meng tot het is opgelost (2-5 min). Filter de oplossing vacuüm en stel de pH in op 7,4 met HCl en NaOH.</li>
		<li>Laat 30 minuten afkoelen op ijs of op 4°C voordat u het bewaart. OPMERKING: Aliquots van 1,5 ml kunnen gedurende één jaar bij -20 °C worden bewaard. Vermijd vries-dooicycli. Als de oplossing na het ontdooien troebel wordt of zich een neerslag heeft gevormd, mag de oplossing niet worden gebruikt. LET OP: Giftig, ontvlambaar. Werk altijd met PFA onder een geventileerde capuchon en draag de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspend gelyofiliseerd enzym A met 1 ml buffer A. Draai de oplossing niet. OPMERKING: Enzym A en buffer A en buffers A, Y en Z zijn reagentia in de commerciële Adult Brain Dissociation Kit17.</li>
	<li>Verdeel Enzym P in aliquots van 50 μL en resuspend Enzym A in 10 μL aliquots. Volgens de instructies van de kit maximaal zes maanden bewaren bij -20 °C. Vermijd vries-dooicycli.</li>
</ol>2. Dag van het experiment
<ol><li>Koel de tafelcentrifuge tot 4 °C.</li>
	<li>Plaats aliquot(s) van PFA in de koelkast voor geleidelijke ontdooiing.</li>
	<li>Plaats de gereconstitueerde levende/dode vlek in het donker (bijvoorbeeld een lade) om bij kamertemperatuur te ontdooien.</li>
	<li>Bereid de runderserumalbumine (BSA) Buffer. Voeg 0,5 g BSA toe aan 100 ml 1x Dulbecco's fosfaat-gebufferde oplossing zonder calcium en magnesium (D-PBS), pH 7,2.</li>
	<li>Voeg een roerstaaf toe en meng op een roerplaat gedurende 30 min. Breng over op conische buizen van 50 ml en bewaar bij 4 °C. OPMERKING: Gebruik altijd vers bereide BSA-buffer.</li>
	<li>Bereid levende/dode vlekverdunning voor. Voeg 1 μL van de gereconstitueerde levende/dode vlekkenoplossing toe aan 360 μL D-PBS en bewaar deze in het donker (bijv. een lade of doos) bij kamertemperatuur. Bereid 50 μL van de werkverdunning per monster.</li>
</ol>3. Perfusie
<ol><li>Plaats de zoutoplossing met heparine op ijs.</li>
	<li>Schakel zuurstof in, stel de flowmeterindicatorbal op het anesthesieverdampersysteem voor kleine dieren in op 1 l/min. Zorg voor voldoende zuurstofdruk en isofluraan.</li>
	<li>Stel de verdamperknop in op 3,5% (voor inductie en onderhoud).</li>
	<li>Bereid de perfusiepompleidingen voor met de zoutoplossing/heparine-oplossing. Stel de snelheid in op 6 ml/min.</li>
	<li>Plaats de muis in de inductiekamer, schakel de ontluchter in en wacht enkele minuten totdat de muis niet meer reageert. Bevestig voldoende diepte van de anesthesie door de afwezigheid van pedaalontwenning tot schadelijke knijp.</li>
	<li>Plaats de muis op zijn rug op de dissectiebak met zijn neus in de neuskegel. Voer een secundaire bevestiging van volledige verdoving uit door de afwezigheid van pedaalontwenning tot schadelijke knijp. Pin alle vier de poten op het dienblad.</li>
	<li>Spuit de buik van het dier in met 20% ethanol.</li>
	<li>Knijp met een tang in de onderbuik en til de huid op. Gebruik een schaar om door vacht en huid naar de bodem van de ribbenkast te snijden.</li>
	<li>Maak twee diagonale incisies van onder de ribbenkast naar elke schouder.</li>
	<li>Reseceer voorzichtig het middenrif (vermijd de longen en het hart). Reseceer de ribbenkast om het hart bloot te leggen.</li>
	<li>Breek voorzichtig het bindweefsel rond het hart af. OPMERKING: Stappen 3.10-3.11 zijn van cruciaal belang; presteren met vaardigheid en behendigheid.</li>
	<li>Gebruik de schaar om het rechteratrium (donkere lob linksboven in het hart) te knippen. Schakel de stroom isofluraan naar de ontluchter uit.</li>
	<li>Houd het hart stabiel met een tang. Met de schuine kant van de vlindernaald naar boven gericht, doorboort u de linker ventrikel terwijl u de naald waterpas en parallel aan het dier houdt.</li>
	<li>Houd de naald op zijn plaats, zet de pomp aan en perfundeer ten minste 30 ml van de zoutoplossing / heparine-oplossing totdat de vloeistof die het hart verlaat ondoorzichtig is en de lever en longen verbleken van kleur. OPMERKING: Stappen 3.13-3.14 zijn van cruciaal belang; presteren met vaardigheid en behendigheid.</li>
	<li>Schakel de pomp uit, verwijder de naald en breng de muis over naar het dissectiegebied.</li>
</ol>4. Dissectie
<ol><li>Met behulp van een grote chirurgische schaar, onthoofd het hoofd.</li>
	<li>Snijd de vacht van de achterkant van het hoofd tot aan de ogen. Pel de huid terug om de schedel bloot te leggen.</li>
	<li>Klem de schedel tussen de ogen. Maak twee sneden aan de achterkant van de schedel, op de posities van 10 en 2 uur, en maak vervolgens één lange snede (houd de uiteinden omhoog om te voorkomen dat de hersenen worden beschadigd) langs de midsagittale lijn van de schedel naar de oorspronkelijke snede tussen de ogen.</li>
	<li>Gebruik een tang om de twee helften van de schedel naar de zijkanten af te pellen. Gebruik een spatel om de hersenen te verwijderen en plaats deze in een glazen petrischaaltje van 60 mm op ijs gevuld met koude D-PBS (figuur 1).</li>
	<li>Gebruik een scalpel of scheermes om elke hemisfeer te scheiden. Verwijder vervolgens de reukbollen en het cerebellum.</li>
	<li>Gebruik een tang om de middenhersenen te verwijderen totdat de hippocampus is blootgesteld.</li>
	<li>Beveilig de hersenen met een tang. Gebruik een tweede set tangen om de hippocampus voorzichtig uit elke hemisfeer te plagen en beide hippocampi over te brengen naar een gelabelde buis van 1,5 ml met koude D-PBS.</li>
	<li>Plaats de monsterbuis met de twee hippocampi van de muis op ijs.</li>
</ol>5. Bereid enzyme mix 1 en 2 voor elk monster
OPMERKING: Gebruik voor volumes van meer dan 2 ml een serologische pipet van 10 ml; gebruik voor volumes van 200 μL-2 ml een pipet van 1000 μL; gebruik voor volumes van 21-199 μL een pipet van 200 μL; gebruik voor volumes van 2-20 μL een pipet van 20 μL; gebruik voor volumes onder 2 μL een pipet van 0-2 μL.
<ol><li>Ontdooi voor elk monster één aliquot elk van Enzym P en Enzym A bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Combineer voor enzymmix 1 50 μl enzym P en 1900 μl buffer Z in een gelabelde C-buis (materiaaltabel).</li>
	<li>Voeg voor enzymmix 2 20 μl buffer Y toe aan de ontdooide 10 μl aliquot van enzym A.</li>
</ol>6. Protocol voor hersendissociatie bij volwassenen17
OPMERKING: Bij het werken met monsters moeten buizen bij kamertemperatuur in een buizenrek worden geplaatst, terwijl BSA en D-PBS op ijs blijven, tenzij anders vermeld.
<ol><li>Schakel de dissociator in.</li>
	<li>Gebruik een tang om de stukjes hippocampiweefsel over te brengen naar de C-buis.</li>
	<li>Breng 30 μL enzymmix 2 over in de C-buis. Draai de dop totdat de spanning wordt gevoeld en draai vervolgens aan totdat deze klikt.</li>
	<li>Plaats de C-buis ondersteboven in een positie van de dissociator; aan de steekproef wordt de status Geselecteerd toegewezen (figuur 2). Bevestig de kachel boven de C-buis.</li>
	<li>Druk op het mappictogram, selecteer de map Favorieten , scrol naar en selecteer het 37C_ABDK_02 programma. Klik op OK om het programma toe te passen op alle geselecteerde C-buizen en tik vervolgens op Start (figuur 2).</li>
	<li>Label één conische buis van 50 ml per monster.</li>
	<li>Plaats een celzeef van 70 μm op elke conische buis van 50 ml en maak deze nat met 2 ml BSA-buffer.</li>
	<li>Verwijder na voltooiing van het programma de kachel en de C-buis uit de dissociator.</li>
	<li>Voeg 4 ml BSA-buffer toe aan het monster en breng het mengsel aan op de celzeef op de conische buis van 50 ml.</li>
	<li>Voeg 10 ml D-PBS toe aan de C-buis, sluit deze en draai de oplossing voorzichtig rond. Breng het aan op de celzeef op de conische buis van 50 ml.</li>
	<li>Gooi de celzeef en de C-buis weg. Centrifugeer de suspensie bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Aspirateer vervolgens en gooi het supernatant weg.</li>
</ol>7. Puin verwijderen
<ol><li>Resuspend de pellet met 1550 μL koude D-PBS en breng de suspensie over in een gelabelde conische buis van 15 ml.</li>
	<li>Voeg 450 μL koude vuilverwijderingsoplossing toe en pipetteer op en neer (draai geen vortex). OPMERKING: Debris Removal Solution is een reagens in de commerciële Adult Brian Dissociation Kit17.</li>
	<li>Leg voorzichtig 1 ml koude D-PBS op de celsuspensie en houd de punt tegen de wand van de conische buis. Herhaal dit totdat de totale overlay 2 ml is. OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang; presteren met vaardigheid en behendigheid.</li>
	<li>Centrifugeer bij 3000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C met volledige acceleratie en volledige rem. OPMERKING: Als de fasen niet duidelijk gescheiden zijn, herhaalt u stap 7.2-7.3. Centrifugeer een laatste keer bij 1000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>De suspensie moet nu uit drie verschillende lagen bestaan (figuur 3). Adem de bovenste laag op. Veeg de pipetpunt heen en weer om de witte middelste laag op te zuigen. Verwijder zoveel mogelijk van de middelste laag zonder de onderste laag te storen. OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang; presteren met vaardigheid en behendigheid.</li>
	<li>Voeg 2 ml koude D-PBS toe en pipetteer op en neer om te mengen.</li>
	<li>Centrifugeer bij 1000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C met volledige acceleratie en volledige rem. Aspirateer en gooi het supernatant weg. Resuspend de pellet in 1 ml BSA-buffer. OPMERKING: Cellen kunnen opnieuw worden gesuspendeerd in de juiste buffer en vervolgens magnetisch worden gelabeld en geïsoleerd ter voorbereiding op eencellige sequencing op dit punt.</li>
</ol>8. Aantal cellen
<ol><li>Voer celtelling uit volgens het protocol van de fabrikant van de beschikbare celteller (één optie wordt vermeld in de tabel met materialen)</li>
</ol>9. Levende/dode vlek
<ol><li>Centrifugeer de resterende 900 μL (vanaf 7,7) bij 1000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C met volledige acceleratie en volledige rem.</li>
	<li>Terwijl het monster draait, labelt u één stroombuis per monster en wikkelt u deze in folie om blootstelling aan licht te beperken.</li>
	<li>Aspirateer en gooi het supernatant weg.</li>
	<li>Resuspend de pellet in 50 μL verdunde levende/dode vlek (eerder bereid). OPMERKING: Deze stap moet worden uitgevoerd in een omgeving met weinig licht. Schakel de bovenlichten van de ruimte uit om dit te bereiken.</li>
	<li>Breng elk monster over naar de overeenkomstige gelabelde stroombuis en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 8-10 minuten in het donker (bijvoorbeeld een lade of doos).</li>
	<li>Voeg 500 μL BSA-buffer toe en centrifugeer bij 1000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C met volledige acceleratie en volledige rem.</li>
	<li>Aspirateer en gooi het supernatant weg. OPMERKING: De pellet is mogelijk niet zichtbaar; laat een kleine hoeveelheid buffer achter om de pellet niet onbedoeld op te zuigen. Cellen kunnen op dit punt opnieuw worden gesuspendeerd in de juiste buffer, worden geblokkeerd en gekleurd met celspecifieke antilichamen. Zie Aanvullend bestand 1 voor voorbeeldprotocol18.</li>
</ol>10. Fixatie (optioneel)
<ol><li>Resuspend de pellet in 200 μL van 1% PFA (eerder bereid). Incubeer gedurende 15 min bij 4 °C.</li>
	<li>Was door 500 μL D-PBS toe te voegen en centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Aspirateer de supernatant. OPMERKING: De pellet is mogelijk niet zichtbaar; laat een kleine hoeveelheid buffer achter om de pellet niet onbedoeld op te zuigen.</li>
	<li>Resuspend de pellet in 200 μL D-PBS en bewaar bij 4 °C gedurende maximaal 3 dagen.</li>
</ol>11. Flowcytometrie
<ol><li>Label de filterdoppen op de nieuwe buizen.</li>
	<li>Pipetteer met behulp van een pipet van 1 ml elk monster op de filterdop.</li>
	<li>Centrifugeer kort bij 200 x g bij 4 °C, zodat de centrifuge slechts 200 x g kan bereiken voordat de werking wordt gestopt.</li>
	<li>Ga verder naar de flowcytometriekern voor downstream-analyse.</li>
</ol>

<ol><li>Andersen, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O'Keefe, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAndersen%2C+P+%22The+Hippocampus+Book%22">The Hippocampus Book</a>. , Oxford University Press, Inc. (2007).</li>
<li>Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+influence+on+neurogenesis+in+the+dentate+gyrus+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genetic influence on neurogenesis in the dentate gyrus of adult mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 10409-10414 (1997).</li>
<li>Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+Functional+Implications+of+Adult+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis.</a> Cell. 132, 645-660 (2008).</li>
<li>Kempermann, G., Song, H., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+adult+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the adult hippocampus.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, 018812(2015).</li>
<li>Bond, A. M., Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mammalian+neural+stem+cells+and+neurogenesis%3A+Five+decades+later%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult mammalian neural stem cells and neurogenesis: Five decades later.</a> Cell Stem Cell. 17, 385-395 (2015).</li>
<li>Sato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+microglia+on+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Effects of microglia on neurogenesis.</a> Glia. 63, 1394-1405 (2015).</li>
<li>Lee, V. M., Scientist, S., Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neural stem cells. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.stemcell.com/media/files/minireview/MR29019-Neural_Stem_Cells.pdf">http://www.stemcell.com/media/files/minireview/MR29019-Neural_Stem_Cells.pdf</a> (2015).</li>
<li>Mu, Y., Lee, S. W., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+in+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Signaling in adult neurogenesis.</a> Current Opinion in Neurobiology. 20, 416-423 (2010).</li>
<li>Fares, J., Diab, Z. B., Nabha, S., Fares, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+adult+hippocampus%3A+history%2C+regulation%2C+and+prospective+roles%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the adult hippocampus: history, regulation, and prospective roles.</a> International Journal of Neuroscience. 129, 598-611 (2018).</li>
<li>Tosun, M., Semerci, F., Maletic-Savatic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+stem+cells+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of stem cells in the hippocampus.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1169, 31-53 (2019).</li>
<li>Abbott, L. C., Nigussie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Medicine+Series+C%3A+Anatomia+Histologia+Embryologia%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis in the mammalian dentate gyrus.</a> Journal of Veterinary Medicine Series C: Anatomia Histologia Embryologia. 49, 3-16 (2020).</li>
<li>Rodrigues, G. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A., Cabral, J. M., Diogo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neural+precursors+using+magnetic+activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Purification of human induced pluripotent stem cell-derived neural precursors using magnetic activated cell sorting.</a> Methods in Molecular Biology. 1283, Clifton, N.J. 137-145 (2015).</li>
<li>Ko, I. K., Kato, K., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+analysis+of+multiple+surface+markers+expressed+on+rat+neural+stem+cells+using+antibody+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Parallel analysis of multiple surface markers expressed on rat neural stem cells using antibody microarrays.</a> Biomaterials. 26, 4882-4891 (2005).</li>
<li>Jager, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+enzymatic+and+mechanical+methods+of+dissociation+on+neural+progenitor+cells+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells.</a> Advances in Medical Sciences. 61 (1), 78-84 (2017).</li>
<li>Volovitz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-aggressive%2C+highly+efficient%2C+enzymatic+method+for+dissociation+of+human+brain-tumors+and+brain-tissues+to+viable+single-cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells.</a> BMC Neuroscience. 17, 1-10 (2016).</li>
<li>Reiß, S., Herzig, I., Schmitz, J., Bosio, A., Pennartz, S. Semi-automated tissue dissociation and preserved epitope integrity optimize immunomagnetic sorting of neural cells. , Available from: 
 <a target="_blank" href="www.miltenyibiotec.com">www.miltenyibiotec.com</a> (2021).</li>
<li>Adult brain dissociation kit: mouse and rat. Miltenyi Biotec. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.miltenyibiotec.com/upload/assets/IM0011920.pdf">https://www.miltenyibiotec.com/upload/assets/IM0011920.pdf</a> (2020).</li>
<li>Cell surface flow cytometry staining protocol. Miltenyi Biotec. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.miltenyibiotec.com/US-en/applications/all-protocols/cell-surface-flow-cytometry-straining-protocol-pbs-bsa-1-50.html">https://www.miltenyibiotec.com/US-en/applications/all-protocols/cell-surface-flow-cytometry-straining-protocol-pbs-bsa-1-50.html</a> (2021).</li>
<li>Finak, G., Jiang, W., Gottardo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CytoML+for+cross-platform+cytometry+data+sharing%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">CytoML for cross-platform cytometry data sharing.</a> Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 93, 1189-1196 (2018).</li>
<li>Turaç, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+flow+cytometric+analysis+of+surface+and+intracellular+antigens+reveals+surface+molecule+markers+of+human+neuropoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Combined flow cytometric analysis of surface and intracellular antigens reveals surface molecule markers of human neuropoiesis.</a> PLoS One. 8, 1-14 (2013).</li>
<li>Schwarz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+fluorescence+activated+cell+sorting+to+examine+cell-type-specific+gene+expression+in+rat+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537(2015).</li>
<li>Brummelman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((application+and+computational+analysis+of+high-dimensional+fluorescent+antibody+panels+for+single-cell+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">application and computational analysis of high-dimensional fluorescent antibody panels for single-cell flow cytometry.</a> Nature Protocols. 14, 1946-1969 (2019).</li>
<li>Recommended controls for flow cytometry. Abcam. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.abam.com/protocols/recommended-conntrols-for-flow-cytometry">https://www.abam.com/protocols/recommended-conntrols-for-flow-cytometry</a> (2021).</li>
<li>Fixing cells with paraformaldehyde (PFA) for flow cytometry. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://flowcytometry.utoronto.ca/wp-content/uploads/2016/02/FixingCells_PFA.pdf">https://flowcytometry.utoronto.ca/wp-content/uploads/2016/02/FixingCells_PFA.pdf</a> (2021).</li>
<li>Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+fluorescence+intensity+of+selected+leukocyte+surface+markers+following+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation.</a> Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 71, 379-385 (2007).</li>
<li>Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+of+brain+cell+transcriptomes+and+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes.</a> Neuron. 109, 11-26 (2021).</li>
<li>Ho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+single-cell+transcriptomics+in+adult+rodent+brain%3A+The+medium+spiny+neuron+transcriptome+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A guide to single-cell transcriptomics in adult rodent brain: The medium spiny neuron transcriptome revisited.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 1-16 (2018).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+technologies+in+studying+brain+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">Novel technologies in studying brain immune response.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 6694566(2021).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+atlas+of+the+mouse+brain+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Mattei, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+dissociation+induces+transcriptional+and+proteotype+bias+in+brain+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21, 1-20 (2020).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+microdissected+mouse+brain+tissue+for+artifact+free+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100590(2021).</li>
<li>Delmonte, O. M., Fleisher, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+Surface+markers+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: Surface markers and beyond.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143, 528-537 (2019).</li>
<li>O'Connor, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relevance+of+flow+cytometry+for+biochemical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">The relevance of flow cytometry for biochemical analysis.</a> IUBMB Life. 51, 231-239 (2001).</li>
<li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized.+Experiments%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> Journal of Visualized. Experiments. (94), e52241(2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Verschillende stappen in dit neurale dissociatieprotocol vereisen bekwame techniek en behendigheid - perfusie, supernatantaspiratie en myelineverwijdering. Tijdens het perfusieproces moeten de inwendige organen intact blijven (afgezien van het verwijderen van het diafragma en het knippen van het hart); dit omvat het vermijden van de bovenste kamers van het hart met de vlindernaald. Hoewel de hoeveelheid zoutoplossing met heparine die nodig is varieert, geeft transparante vloeistof die uit het hart stroomt aan dat het pro...

De hippocampus werd voor het eerst beschreven door een Bolognese anatoom, Giulio Cesare Aranzio, in de jaren 15001. Bij het benoemen van deze nieuw ontdekte structuur werd Aranzio waarschijnlijk geïnspireerd door de griezelige gelijkenis met het zeepaardje van het geslacht Hippocampus1. De hippocampus is betrokken bij stressreacties, maar staat algemeen bekend om zijn rol in leren en geheugen. Meer specifiek is de hippocampus verantwoordelijk voor het coderen en ophalen van declaratief en ruimtelijk geheugen1.
De hippocampus, of eigenlijke hippocampus, is verdeeld in de SUBVELDEN CA1 (cornu ammonis), CA2 en CA3. In vergelijking met de rest van het zenuwstelsel heeft de hippocampus verschillende unieke bepalende kenmerken, waaronder de plasticiteit en het potentieel voor voortdurende neurogenese2. Neurogenese is het proces van de proliferatie en differentiatie van neurale stamcellen, gevolgd door hun integratie in het reeds bestaande neuronale netwerk. Neurogenese is beperkt tot de subgranulaire zone van de gyrus dentate en de subventriculaire zone van de laterale ventrikels (en de olfactorische bollen)3. Hoewel neurogenese overvloedig aanwezig is in embryogenese, is het een levenslang proces 3,4. Als zodanig zal deze discussie zich richten op volwassen neurogenese in de hippocampus.
De subventriculaire en subgranulaire zones zijn neurogene niches die ependymale en vasculaire cellen bevatten, evenals onrijpe en volwassen afstammingslijnen van neurale stamcellen5. Microglia dragen bij aan deze niches als immuuncellen om neurogenese te reguleren6. Neurale voorlopercellen zijn niet-stamcelprogenieën van neurale stamcellen7. Drie soorten neurale voorlopers zijn aanwezig in de subventriculaire zone: radiale glia-achtige type B-cellen, type C transit-versterkende voorlopers en type A neuroblasten 3,8. De langzaam delende type B neurale voorlopercellen in de subventriculaire zone kunnen differentiëren in snel delende type C-cellen8. Vervolgens differentiëren type C-cellen in type A-cellen8. Deze neuroblasten migreren door de rostrale migratiestroom naar de bulbus olfactorius voordat ze differentiëren in interneuronen of oligodendrocyten9. Deze olfactorische bolintercurnen zijn de sleutel tot olfactorisch kortetermijngeheugen en associatief leren, terwijl de oligodendrocyten myelinaat axonen van het corpus callosum9. De meerderheid van de volwassen neurogenese vindt plaats in de subgranulaire zone van de gyrus dentate, waar radiale type 1 en niet-radiale type 2 neurale voorlopers worden gevonden3. De meeste neurale voorlopercellen zijn voorbestemd om dentate granulaatneuronen en astrocyten10 te worden. Verbonden door gap junctions, vormen astrocyten netwerken om plasticiteit, synaptische activiteit en neuronale prikkelbaarheid te moduleren5. Als het primaire exciterende neuron van de gyrus dentate leveren korrelcellen input van de entorhinale cortex naar het CA3-gebied11.
Neurale stamcelpopulaties kunnen worden geïsoleerd met behulp van immunomagnetische of immunofluorescente isolatiestrategieën12,13. Neuraal weefsel is bijzonder moeilijk te dissociëren; pogingen om dit te doen resulteren vaak in monsters met een slechte levensvatbaarheid van de cel en/ of het niet produceren van de noodzakelijke eencellige suspensie voor downstream-analyse. Neurale dissociatie kan worden uitgevoerd via mechanische dissociatie (zoals het gebruik van filters, haktechnieken of pipettrituratie), enzymatische spijsvertering of een combinatie van technieken14,15. In een studie die neurale dissociatiemethoden evalueerde, werden de levensvatbaarheid en kwaliteit van handmatige mechanische dissociatie door pipettrituratie versus combinaties van pipettrituratie en spijsvertering met verschillende enzymen vergeleken15. De kwaliteit werd beoordeeld op basis van de hoeveelheid celklonten en DNA of subcellulair puin in de bereide suspensie15. Suspensies van gliale tumoren onderworpen aan handmatige mechanische dissociatie alleen hadden een significant lagere cel levensvatbaarheid dan behandelingen met dispase of een combinatie van DNase, collagenase en hyaluronidase15. Volovitz et al. erkenden de variatie in levensvatbaarheid en kwaliteit tussen de verschillende methoden en benadrukten dat onvoldoende dissociatie de nauwkeurigheid van downstream-analyse kan verminderen15.
In een afzonderlijke studie vergeleken de auteurs meer dan 60 verschillende methoden en combinaties van dissociatie van gekweekte neuronale cellen14. Deze methoden omvatten acht verschillende variaties van handmatige mechanische dissociatie door pipettrituratie, een vergelijking van incubatie met vijf individuele enzymen met drie verschillende intervallen en verschillende combinaties van mechanische dissociatie met enzymatische spijsvertering of de combinatie van twee enzymen14. Geen van de mechanische methoden leverde een eencellige suspensieop 14. Vier van de enkelvoudige enzymbehandelingen, tien van de combinatie-enzymatische behandelingen en vier van de combinaties van mechanische dissociatie met enzymatische vertering leverden een eencellige suspensie op14. Enzymatische vertering met TrypLE gevolgd door Trypsine-EDTA meest effectief gedissocieerde monsters14. Overigens hadden monsters behandeld met TrypLE en/of Trypsine-EDTA de neiging gelatineuze klontente vormen 14. Hoewel deze studie werd uitgevoerd op gekweekte cellen, spreekt het over de tekortkomingen van pipettrituratie of enzymatische spijsvertering alleen.
Zij-aan-zij vergelijkingen van handmatige versus geautomatiseerde mechanische dissociatie ontbreken. Eén groep voerde echter flowcytometrie uit om handmatige en semi-geautomatiseerde mechanische dissociatie van hele muizenhersenen te vergelijken in combinatie met commerciële papaïne- of trypsine-enzymatische dissociatiekits16. Verwerking met de dissociator leverde consistenter levensvatbare cellen op16. Na dissociatie isoleerden de auteurs ook Prominine-1-cellen, neuronale voorlopercellen en microglia16. Voor twee van de drie geïsoleerde celpopulaties was de zuiverheid van de geïsoleerde cellen iets hoger wanneer monsters werden verwerkt met de dissociator, in vergelijking met handmatig16. Reiß et al. merkten op dat person-to-person variabiliteit in pipetteertechniek de reproduceerbaarheid van levensvatbare celpopulatieopbrengst in weefseldissociatie belemmert16. De auteurs concludeerden dat geautomatiseerde mechanische dissociatie de monsterverwerking standaardiseert16.
De methode van dissociatie die in dit manuscript wordt beschreven, is een combinatie van volledig geautomatiseerde mechanische dissociatie en enzymatische spijsvertering, met behulp van oplossingen die gepaard gaan met een commerciële hersendissociatiekit voor volwassenen17. In tegenstelling tot standaardprotocollen vermindert dit geoptimaliseerde protocol monstermanipulatie, levert het een zeer levensvatbare eencellige suspensie op en is het bedoeld voor het verwerken van minimale hoeveelheden startweefsel.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-682-003</td><td>Basix, assorted color</td></tr><tr><td>15 mL Falcon Tubes</td><td>Becton Dickinson Labware Europe</td><td>352009</td><td>Polystyrene</td></tr><tr><td>25 mL Serological Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-235</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Vacuum Filter/ Storage Bottle System</td><td>Corning</td><td>431097</td><td></td></tr><tr><td>70 μm cell strainer</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Adult Brain Dissociation Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>&nbsp;130-107-677</td><td>Contains Enzyme P, Buffer Z, Buffer Y, Enzyme A, Buffer A, Debris Removal Solution</td></tr><tr><td>Aluminum Foil</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-105</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mouse, clone REA969</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-116-246</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Myelin Basic Protein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3821-100UG</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PSA-NCAM-PE, human, mouse and rat, Clone 2-2B</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-117-394</td><td></td></tr><tr><td>BD LSRFortessa</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-50G</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-VioBlue, mouse, Clone REA592</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-113-810</td><td></td></tr><tr><td>CD31 Antibody</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-111-541</td><td></td></tr><tr><td>Ceramic Hot Plate Stirrer</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-100-100SH</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Pharmco by Greenfield Global</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Fine Scissors - Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td>Perfusion</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>BD</td><td></td><td>(v10.7.0)</td></tr><tr><td>gentleMACS C Tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Octo Dissociator with Heaters</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>Gibco DPBS (1X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Glass Beaker</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-555-25A</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium</td><td>Fresenius Kabi</td><td>504011</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>L34965</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Stir Bar</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-513-51</td><td></td></tr><tr><td>Noyes Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15012-12</td><td>Dissection</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244-3KG</td><td>Prilled, 95%</td></tr><tr><td>Pipette tips GP LTS 20 µL 960A/10</td><td>Rainin</td><td>30389270</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips GP LTS 250 µL 960A/10</td><td>Rainin</td><td>30389277</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips RT LTS 1000 µL FL 768A/8</td><td>Rainin</td><td>30389213</td><td></td></tr><tr><td>Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL)</td><td>Rainin</td><td>30386597</td><td></td></tr><tr><td>RBXMO FITC XADS</td><td>Fisher Scientific</td><td>A16167</td><td></td></tr><tr><td>Round Ice Bucket with Lid</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-210-129</td><td></td></tr><tr><td>Round-Bottom Tubes with Cell Strainer Cap</td><td>Falcon</td><td>100-0087</td><td></td></tr><tr><td>S1 Pipet Fillers</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>9541</td><td></td></tr><tr><td>Spatula &amp; Probe</td><td>Fine Science Tools</td><td>10090-13</td><td>Dissection &amp; Perfusion</td></tr><tr><td>Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4"</td><td>Termuno</td><td>SV-23BLK</td><td>Butterfly needle</td></tr><tr><td>Test Tube Rack</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-809-37</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Legend XTR Centrifuge</td><td>ThermoFisher</td><td>discontinued</td><td>Or other standard table top centrifuge</td></tr><tr><td>Variable-Flow Peristaltic Pump</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-2</td><td>Low-flow model</td></tr><tr><td>VetFlo Starter Kit for Mice</td><td>Kent Scientific</td><td>VetFlo-MSEKIT</td><td>Anesthesia mask, tubing, induction chamber, charcoal canisters</td></tr><tr><td>VetFlo Vaporizer Single Channel Anesthesia System</td><td>Kent Scientific</td><td>VetFlo-1210S</td><td>0.2&ndash;4 LPM</td></tr><tr><td>Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>731196</td><td>Cell Counting</td></tr><tr><td>Vi-CELL XR 4 Bags of Sample Vials</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>383721</td><td>Cell Counting</td></tr></tbody></table>

gecombineerde mechanische en enzymatische dissociatie van hippocampusweefsel van muizenhersenen

Combined Mechanical and Enzymatic Dissociation of Mouse Brain Hippocampal Tissue

Dit neurale dissociatieprotocol (een aanpassing van het protocol bij een commerciële hersendissociatiekit voor volwassenen) optimaliseert weefselverwerking ter voorbereiding op gedetailleerde downstream-analyse zoals flowcytometrie of eencellige sequencing. Neurale dissociatie kan worden uitgevoerd via mechanische dissociatie (zoals het gebruik van filters, haktechnieken of pipettrituratie), enzymatische spijsvertering of een combinatie daarvan. De delicate aard van neuronale cellen kan de inspanningen bemoeilijken om de zeer levensvatbare, echte eencellige suspensie te verkrijgen met minimaal cellulair puin dat nodig is voor eencellige analyse. De gegevens tonen aan dat deze combinatie van geautomatiseerde mechanische dissociatie en enzymatische spijsvertering consequent een zeer levensvatbare (>90%) eencellige suspensie oplevert, waarmee de bovengenoemde problemen worden overwonnen. Hoewel een paar van de stappen handmatige behendigheid vereisen, verminderen deze stappen de verwerking van monsters en mogelijk celverlies. Dit manuscript beschrijft elke stap van het proces om andere laboratoria uit te rusten om met succes kleine hoeveelheden neuraal weefsel te dissociëren ter voorbereiding op downstream-analyse.

Monsters werden verwerkt met een flowcytometer in een kernfaciliteit en de resulterende gegevens werden geëvalueerd met een softwarepakket voor stroomanalyse. Voorheen werden compensatiecontroles geanalyseerd - de levende / dode vlek en negatieve controle. Als meerdere fluorochchromen worden gebruikt, moeten fluorescentie minus één (FMO) controles en single-stain controles worden voorbereid voor elk antilichaam. Compensatie voor spectrale overlap voor de experimentele monsters werd berekend op basis van de geanalyseerde ...

Dit neurale celdissociatieprotocol is bedoeld voor monsters met een lage hoeveelheid uitgangsmateriaal en levert een zeer levensvatbare eencellige suspensie op voor downstream-analyse, met optionele fixatie- en kleuringsstappen.

Gecombineerde mechanische en enzymatische dissociatie van hippocampusweefsel van muizenhersenen

This neural dissociation protocol (an adaptation of the protocol accompanying a commercial adult brain dissociation kit) optimizes tissue processing in ...

Het succesvol dissociëren van kleine hoeveelheden neuraal weefsel kan laboratoria uitrusten om structuurspecifiek inzicht te krijgen in de werkzaamheid van de behandeling, cellulaire functie, evenals ziekte en behandelingsmechanismen van actie. Dit neurale dissociatieprotocol levert consequent een zeer levensvatbare en werkelijke eencellige suspensie op. Bovendien kunnen we monsters verwerken die slechts een fractie zijn van die waarvoor de commerciële kits bedoeld zijn.Een goede planning en voorbereiding zijn de sleutel tot een succesvol resultaat voor deze techniek. Het zou nuttig zijn om verschillende oefenrondes te lopen om vertrouwd te raken met het protocol. Na het verdoven van een zes maanden oude vrouwelijke C57BL / 6J-muis, knijp je in de onderbuik en til je de huid op met een tang.Knip vervolgens met een schaar door de vacht en de huid naar de onderkant van de ribbenkast. Maak twee diagonale incisies die beginnen onder de ribbenkast en naar elke schouder bewegen. Reseceer vervolgens voorzichtig het middenrif en de ribbenkast om het hart bloot te leggen.Nadat u voorzichtig bindweefsel rond het hart hebt verwijderd, gebruikt u een schaar om het rechteratrium te knippen. Schakel vervolgens de isofluraanstroom naar de ontluchter uit. Houd het hart stabiel met een tang en met de schuine kant van de vlindernaald naar boven gericht, doorboort u de linker ventrikel terwijl u de naald waterpas en parallel aan het dier houdt.Houd vervolgens de naald op zijn plaats, zet de pomp aan en perfuseer ten minste 30 milliliter van de zoutoplossing of heparine-oplossing totdat de vloeistof die het hart verlaat ondoorzichtig is en de lever en longen verbleken van kleur. Schakel na de perfusie de pomp uit, verwijder de naald en breng de muis over naar het dissectiegebied. Snijd na onthoofding de vacht van de achterkant van het hoofd tot aan de ogen en pel de huid terug om de schedel bloot te leggen.Knip vervolgens de schedel tussen de ogen en maak twee sneden aan de achterkant van de schedel op posities van 10 en 2 uur. Maak vervolgens een lange snede langs de midsagittale lijn van de schedel naar de oorspronkelijke snede tussen de ogen. Pel vervolgens met een tang de twee helften van de schedel weg naar de zijkanten.Gebruik vervolgens een spatel om de hersenen te verwijderen en plaats deze in een 60 millimeter glazen petrischaal gevuld met koude DPBS en bewaard op ijs. Gebruik een scalpel of scheermes, scheid elke hemisfeer en verwijder de olfactorische bollen en het cerebellum. Verwijder vervolgens de middenhersenen totdat de hippocampus is blootgesteld.Beveilig vervolgens de hersenen met een tang. Gebruik vervolgens een tweede set tangen en plaag de hippocampus voorzichtig uit elke hemisfeer. Breng beide hippocampi over op een gelabelde buis van 1,5 milliliter met koude DPBS en plaats de buis op ijs.Breng met een tang de stukjes hippocampiweefsel over naar een C-buis en voeg 30 microliter enzymmengsel 2 toe aan de buis. Na het draaien van de dop en het aandraaien totdat deze klikt, plaatst u de buis in een dissociator en voert u het juiste programma uit. Terwijl het programma loopt, bevochtigt u een celzeef van 70 micron die op een conische buis van 50 milliliter met twee milliliter BSA-buffer wordt geplaatst.Nadat het dissociatieprogramma is voltooid, voegt u vier milliliter BSA-buffer toe aan het gedissocieerde weefsel en filtert u het mengsel door de celzeef op de conische buis van 50 milliliter. Voeg vervolgens 10 milliliter DPBS toe aan de C-buis. Sluit vervolgens de buis, draai de oplossing voorzichtig en filter deze door de celzeef op de conische buis van 50 milliliter.Centrifugeer de gefilterde celsuspensie, gooi het supernatant weg zonder de pellet te verstoren en sla de pellet op. Voor het verwijderen van puin, resuspend de pellet met 1.550 microliter koude DPBS en breng de suspensie over naar een gelabelde conische buis van 50 milliliter. Voeg vervolgens 450 microliter oplossing voor het verwijderen van koud vuil toe en pipetteer op en neer.Leg de celsuspensie voorzichtig over elkaar met één milliliter koude DPBS, waarbij de punt tegen de wand van de conische buis blijft. Herhaal de procedure totdat de totale overlay twee milliliter is. Centrifugeer vervolgens de suspensie op 3.000 keer G gedurende 10 minuten met volledige versnelling en volledige pauze.Zuig de bovenste laag op en veeg vervolgens de pipetpunt heen en weer om de witte middelste laag op te zuigen. Verwijder zoveel mogelijk van de middelste laag zonder de onderste laag te storen. Voeg vervolgens twee milliliter koude DPBS toe en pipetteer op en neer om te mengen.Centrifugeer vervolgens de suspensie op 1.000 keer G gedurende 10 minuten met volledige versnelling en volledige pauze. Gooi na het centrifugeren het supernatant weg en resuspend de pellet in één milliliter BSA-buffer. Centrifugeer na het tellen van de cellen de resterende celsuspensie en resuspend de pellet in 50 microliter verdunde levende dode vlek.Breng het monster vervolgens over in een gelabelde stroombuis en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 8 tot 10 minuten in het donker. Voeg na de incubatie 500 microliter BSA-buffer toe en herhaal de centrifugatiestap. Gooi vervolgens het supernatant weg en laat een kleine hoeveelheid buffer in de buis achter.De primaire poort sloot puin uit in de voorwaartse verstrooiing versus zijverstrooiingspercelen en de dode cellen werden vervolgens uitgesloten. De tweede poort sloot cellen uit die positief waren voor myeline basiseiwit. En van de resterende cellen werden dichtheidsdiagrammen van cellen gemaakt die positief waren voor elk fluorochroom.De frequentie van elke neuronale celpopulatie werd berekend vanuit de derde poort. Monsters verwerkt met handmatige mechanische dissociatie en enzymatische spijsvertering leverden een aanzienlijk lagere populatie van cellen van belang op, terwijl zowel verse als vaste monsters verwerkt met geautomatiseerde mechanische dissociatie en enzymatische spijsvertering een veelvoudig hogere populatie van cellen van belang vertoonden. Hoewel de stappen voor het verwijderen van perfusie en puin in eerste instantie een uitdaging kunnen zijn, kan het handhaven van een soepele en vaste hand helpen succes te garanderen.

combined-mechanical-enzymatic-dissociation-mouse-brain-hippocampal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dissociëren cellen van specifiek weefsel soorten vereist specifieke parameters voor weefsel aggitation het verkrijgen van een hoog volume van levensvatbare, kweekbare cellen. De Miltenyi gentleMACS Dissociator optimaliseert deze taak met een eenvoudige, praktische protocol. In deze publicatie het gebruik van dit apparaat op nerual weefsel wordt uitgelegd.

Generatie van de Single-celsuspensies van Mouse Neural Tissue

This video demonstrates a protocol to obtain a highly viable single-cell suspension from the mouse brain hippocampus using a combination of automated mechanical dissociation and a mixture of enzymes to aid in enzymatic digestion.

Obtaining a Single-Cell Suspension from Mouse Hippocampal Tissue

This video demonstrates a protocol for extracting microglial cells from demyelinating lesions in mouse brains using magnetic cell sorting. The protocol involves dissecting the lesioned brain tissue containing microglial cells, treating the tissue with specific enzymes to obtain a single-cell suspension, and utilizing microglial receptor-specific magnetic beads to isolate the microglial cells.

Isolating Microglia from Mouse Brain Demyelinating Lesions Using Magnetic Activated Cell Sorting

This video demonstrates a protocol to isolate cells from rat hippocampi, including neurons, astrocytes, and microglia.

Obtaining Various Neural Cell Populations from a Rat Hippocampus

This video demonstrates the recording of rhythmic neuronal network activity, also known as theta oscillations, in an isolated hippocampus. Electrodes are inserted into various layers and spatial positions to detect and analyze theta oscillations. This shows the unique neuronal compositions and the connectivity of the neuronal network across different layers of the hippocampus.

In Vitro Recording of Theta Oscillations in the Mouse Hippocampus

Primaire gedissocieerde embryonale hippocampale neuronale culturen zijn nuttig voor het onderzoeken van de signaalmechanismen die betrokken zijn bij neurondood. Het bepalen van het geslacht van de embryo's vóór de isolatie en dissociatie van de hippocampus maakt de voorbereiding van afzonderlijke mannelijke en vrouwelijke culturen mogelijk, waardoor de onderzoeker geslachtsspecifieke celsignalering kan identificeren en onderzoeken.

Sex Stratified neuronale kweken om ischemische Cell Death Pathways Studie

Een protocol om een co-cultuursysteem te genereren dat bestaat uit neuronen afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's), primaire corticale neuronen en astrocyten wordt beschreven. Dit co-cultuursysteem maakt detectie mogelijk van de vorming van synaptische contacten en circuits tussen nieuwe, iPSC-afgeleide neuronen en reeds bestaande corticale neuronen die channelrhodopsine-2 tot expressie brengen.

Een optogenetische Aanpak voor het beoordelen van de vorming van neuronale verbindingen in een co-cultuur systeem

Dit protocol beschrijft de voorbereiding van horizontale hippocampal-entorhinal cortex (HEC) plakjes van muizen die spontane scherpe golf rimpelactiviteit vertonen. Plakjes worden geïncubeerd in een vereenvoudigde interface-holdingkamer en opnames worden uitgevoerd onder ondergedompelde omstandigheden met snelstromende kunstmatige cerebrospinale vloeistof om weefsel oxygenatie en de spontane opkomst van activiteit op netwerkniveau te bevorderen.

Acute muis hersenen snijden om spontane Hippocampal Netwerk activiteit te onderzoeken

Dit artikel is bedoeld om een systematisch protocol te beschrijven om horizontale hippocampale hersenplakken bij muizen te verkrijgen. Het doel van deze methodologie is om de integriteit van hippocampale vezelroutes te behouden, zoals het perforantpad en het bemoste vezelkanaal om deukende gyrusgerelateerde neurologische processen te beoordelen.

Horizontale Hippocampal Plakjes van de Hersenen van de Muis

Hier laten we zien hoe transfectie van primaire hippocampale knaagdierneuronen kan worden gecombineerd met confocale beeldvorming met levende cellen om pathologische eiwitgeïnduceerde effecten op axonaal transport te analyseren en mechanistische routes te identificeren die deze effecten mediëren.

Beeldvorming van levende cellen gebruiken om de effecten van pathologische eiwitten op axonaal transport in primaire hippocampusneuronen te meten

Het huidige protocol beschrijft hoe primaire hippocampale microglia van volwassen muizen kunnen worden geïsoleerd en gezuiverd, gevolgd door instructies voor het uitvoeren van patch-clamp-opnames van hele cellen op deze acuut geïsoleerde cellen.

Isolatie en opname van patch-clamp met hele cellen van hippocampale microglia van volwassen muizen

Leer een gecombineerde mechanische en enzymatische dissociatiemethode voor hippocampusweefsel van muizen. Dit protocol levert hoog levensvatbare enkele-celsuspensies op voor gedetailleerde cellulaire analyses.

Gecombineerde mechanische en enzymatische dissociatie van hippocampusweefsel van muizenhersenen

Meer video's verkennen