Name: Indel Detection na CRISPR/Cas9 Mutagenese met behulp van Hoge resolutie Melt Analysis in de Mosquito Aedes aegypti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Leer een efficiënte methode voor het detecteren van CRISPR/Cas9-geïnduceerde indels in Aedes aegypti met behulp van high-resolution melt analysis. Deze techniek maakt snelle identificatie van mutanten mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Alle figuren zijn gemaakt met Biorender.com onder een licentie aan de Texas A & M University. Dit werk werd ondersteund door fondsen van het National Institute of Allergy and Infectious Disease (AI137112 en AI115138 tot Z.N.A.), Texas A & M AgriLife Research onder het Insect Vectored Disease Grant Program en het USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch-project 1018401.

1. Scannen op single nucleotide polymorfismen (SNP's), HRMA primer ontwerp en primer validatie
<ol><li>SNP-identificatie bij wilde laboratoriumkoloniemuggen<ol><li>Selecteer het doelexon om de juiste polypeptidevertaling te verstoren. OPMERKING: Het doel moet dicht bij het startcodon liggen of tussen de belangrijkste residuen die nodig zijn voor de eiwitfunctie. Hoe korter het exon (bijvoorbeeld ≤200 basen), hoe moeilijker het is om te richten en te analyseren. Vermijd bewerken dicht bij de grenzen van een exon, omdat dit een van de HRMA-primers dwingt om een intron te passeren of in een intron te zitten. Dit is onwenselijk omdat de SNP-tarieven in die regio's meestal veel hoger zijn.</li>
		<li>Primer ontwerp<ol>
<li>Ga naar de NCBI Blast - Primer Blast website15, kopieer en plak de gekozen exon in het vak bovenaan de pagina | kies de PCR-productgrootte (zorg ervoor dat deze het grootste deel van de exon omvat) | kies het organisme.</li>
			<li>Klik op Geavanceerde parameters | Kies (voor PCR Product Tm) en voeg 60 (voor een optimale temperatuur van 60 °C) toe | Koop Primers. Houd de andere parameters als standaard aan.</li>
		</ol></li>
		<li>Verkrijg genomisch DNA (gDNA) uit de wild-type laboratoriumkolonie. Zet 10 muggen opzij, verdoof ze met CO2 en leg ze in een petrischaaltje op ijs om ze inactief te houden. Stel 10 buisjes in met 0,5 μL van het reagens voor het vrijkomen van DNA uit weefsel en 20 μL verdunningsbuffer, beide voorzien in de DNA-afgiftekit die wordt voorgesteld in de materiaaltabel.</li>
		<li>Verwijder één poot van een enkele mug met een tang en plaats deze in een overeenkomstige buis van een verdunde oplossing van het DNA-afgiftereagens (vanaf stap 1.1.3), waarbij het been volledig in de oplossing wordt ondergedompeld. Herhaal deze stap met de resterende muggen en veeg de tang af met 70% ethanol voordat je doorgaat naar de volgende.</li>
		<li>Incubeer de beenbevattende oplossing bij kamertemperatuur gedurende 2-5 minuten, vervolgens bij 98 °C gedurende 2 minuten en laat deze afkoelen tijdens het instellen van de PCR-reactie. OPMERKING: Platen met het vrijgekomen gDNA kunnen worden opgeslagen bij -20 °C en het protocol kan op dit punt worden gepauzeerd.</li>
		<li>Bereid 10 buisjes met 10 μL 2x PCR Master Mix, primers tot een eindconcentratie van 0,5 μM en water van moleculaire kwaliteit tot een eindvolume van 20 μL, en breng 1 μL van het verdunde monster over naar elke buis. Voer PCR uit volgens deze cyclusparameters: 98 °C 5 min, 40 cycli van 98 °C gedurende 5 s, 60 °C 30 s, 72 °C 20 s per kb; eindverlenging van 72 °C gedurende 1 min.</li>
		<li>Zuiver de PCR-producten met een enzym om de resterende PCR-primers af te breken en overtollige dNTPs of een kolomreinigingskit te defosfororyleren. Ga verder met het sequencen van de monsters.</li>
		<li>Analyseer elk elektroferogram op de aanwezigheid van dubbele pieken /dubbelzinnige basen en pas basisaanroepen handmatig aan in elke reeks met behulp van de juiste gedegenereerde basiscode. OPMERKING: Deze stap moet worden uitgevoerd voordat meerdere sequenties worden uitgelijnd, omdat het gebruikelijk is dat de basisaanroepsoftware de meer prominente piek selecteert als de "echte" basisaanroep, waardoor de valse indruk wordt gewekt van een afwezigheid van SNP's.</li>
		<li>Voer een uitlijning van meerdere sequenties uit met behulp van de uitlijningssoftware SeqMan Pro, die wordt vermeld in de Materiaaltabel of andere open-source uitlijningssoftware, zoals ClustalW16 of T-Coffee17.<ol>
<li>Open de uitlijnsoftware | klik op Reeksen toevoegen | selecteer de gewenste sequenties en klik op Toevoegen | zodra alle sequenties zijn gekozen, klikt u op Gereed.</li>
			<li>Klik op Monteren om de uitlijning uit te voeren. Om de uitlijning te openen, klikt u op Contig 1 en analyseert u de uitlijning en identificeert u de SNP's (figuur 1). OPMERKING: Als alternatief voor stap 1.1.3-1.1.6 kan PCR worden uitgevoerd op basis van geïsoleerd genomisch DNA dat is verkregen uit bulkmonsters (afgeleid van >10 personen). Gesequentieerde ampliconen kunnen direct worden geanalyseerd op de aanwezigheid van SNP's die verschijnen als dubbele pieken in het elektroferogram, hoewel zeldzame SNP's moeilijker te detecteren zullen zijn.</li>
		</ol></li>
		<li>Ontwerp 3-5 single guide RNA's (sgRNA's), waarbij regio's met een SNP die hierboven zijn geïdentificeerd, worden vermeden, volgens het protocol beschreven in18.</li>
	</ol></li>
	<li>HRMA primer ontwerp<ol>
<li>Test de exonsequentie op de mogelijke vorming van secundaire structuren tijdens PCR met behulp van mFold19.<ol>
<li>Ga naar de UNAFold Web Server | klik op mFold | klik in het vervolgkeuzemenu op Toepassingen | DNA-vouwvorm.</li>
			<li>Voer de naam van de reeks in het vak in en plak de exon.</li>
			<li>Verander de vouwtemperatuur naar 60 °C; op de Ionische omstandigheden, verander [Mg++] in 1,5 en op Eenheden overschakelen naar mM; klik op Fold DNA.</li>
			<li>Klik op Output, onder Structuur 1, op pdf om de Circular Structure Plots te openen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ga naar NCBI Blast - Primer Blast15 voor primerontwerp.</li>
		<li>Kopieer en plak de geselecteerde exonvolgorde die is bepaald door sequencing in stap 1.1 (de reeks met het laagste aantal SNP's of geen SNP's) in het vak boven aan de pagina.</li>
		<li>Gebruik het symbool < > om reeksen te markeren en uit te sluiten die SNP's, de doellocatie en regio's bevatten met mogelijke vorming van secundaire structuur.</li>
		<li>Selecteer de PCR-productgrootte tussen 80 en 150 bp en kies het organisme. OPMERKING: Grotere fragmentgroottes kunnen met succes worden gebruikt (~ 300 bp). Langere ampliconen kunnen echter de gevoeligheid verminderen tussen sequenties die verschillen in één of slechts enkele basenparen.</li>
		<li>Klik op Get Primers. Selecteer 2-3 paar primers die moeten worden getest (idealiter zijn primerlocaties ≥20-50 bp verwijderd van CRISPR-doellocaties).</li>
	</ol></li>
	<li>Primer validatie<ol>
<li>Voer een gradiënt-PCR uit met gDNA van één persoon.<ol>
<li>Bereid een hoofdmix voor en verwijder één monster voor het niet-sjabloonbesturingselement (NTC) in een aparte buis. Voeg de sjabloon toe aan de resterende mastermix en aliquot in een 96-well plaat.</li>
			<li>Volg de fietsparameters: 98 °C 30 s, 34 cycli van 98 °C gedurende 10 s, 55–65 °C 30 s, 72 °C 15 s; eindverlenging van 72 °C gedurende 10 min.</li>
			<li>Genereer thermische smeltprofielen volgens de parameters: denaturatiestap 95 °C gedurende 1 minuut, gloeien bij 60 °C gedurende 1 minuut, smeltcurvedetectie tussen 75 °C en 95 °C in stappen van 0,2 °C, met een houdtijd van 10 s bij elke temperatuur. OPMERKING: Alleen gloeitemperaturen met een enkel thermisch smeltprofiel mogen worden gebruikt.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Ga verder met het genereren van de mutantenlijnen met embryo-injecties zoals beschreven in12.</li>
</ol>2. Bereiding van genomisch DNA van muggenpoten
<ol><li>Scheid de G1-muggen op geslacht in het popstadium, zodat ze niet paren voordat ze worden gegenotypeerd, en zorg ervoor dat leeftijdsgematchte, wild-type controlemuggen beschikbaar zijn om te worden gebruikt voor referenties en backcrosses. Seks-scheid ze ook.</li>
	<li>Verzamel de benodigde materialen (figuur 2A) en bereid een 96 well PCR-plaat met 0,5 μL van het DNA-afgiftereagens en 20 μL verdunningsbuffer (uit de gDNA-afgiftekit) per persoon om te worden gegenotypeerd (figuur 2B) en laat het op ijs liggen. Reserveer twee reacties voor NTC.</li>
	<li>Label een tray voor muggenflacons (Drosophila-injectieflacons ) zodat elk putje op de 96-plaat overeenkomt met de respectieve muggenflacon in de tray.</li>
	<li>Verdoof de G1-muggen met CO2 en plaats ze in een glazen petrischaal om ze verdoofd te houden (figuur 2C, D). Verdoof en plaats 8 wilde muggen in een tweede petrischaaltje.</li>
	<li>Veeg een pincet af met 70% ethanol en verwijder een van de achterpoten van de mug (figuur 2E,F).</li>
	<li>Dompel het been onder in de DNA-afgifte-reagensoplossing, plaats de mug in de bijbehorende injectieflacon en sluit deze met een spons (figuur 2G, H).</li>
	<li>Veeg het pincet opnieuw af met 70% ethanol en ga verder met het verwijderen van het been van de volgende mug. Herhaal stap 2.5-2.7 totdat de 96-putplaat is voltooid. OPMERKING: Het is belangrijk om het pincet af te vegen met 70% ethanol. Dit minimaliseert DNA-kruisbesmetting.</li>
	<li>Sluit de plaat af met een optische PCR-plaatafdichting (figuur 2I) en incubeer de 96-putplaat met de poten bij kamertemperatuur (RT) gedurende 2-5 minuten en vervolgens bij 98 °C gedurende 2 minuten. Laat de plaat afkoelen tot RT tijdens het bereiden van de PCR-mix. OPMERKING: Het hele proces duurt meestal 3-4 uur. Als de muggen langer dan de verwachte duur (vooral ≥1 dag) in de injectieflacons moeten worden gehouden, plaats dan een klein stukje rozijn (of bron van suiker en water) bij elke mug om de overleving van de muggen tijdens langdurige incubaties te garanderen.</li>
</ol>3. Hrma
<ol><li>Voer PCR uit.<ol>
<li>Bereid een mastermix voor met de volgende componenten per reactie: 10 μL 2x buffer (uit de gDNA-afgiftekit), 0,5 μM van elke primer, 1 μL EvaGreen-kleurstof, 0,4 μL polymerase (uit gDNA-afgiftekit) en compleet tot 19 μL met water van moleculaire kwaliteit.</li>
		<li>Breng met behulp van een meerkanaals pipet 19 μL van het mastermengsel over in elke put. Breng 1 μL van de DNA-afgifteoplossing met muggen-DNA bereid in sectie 2 over op de plaat (figuur 3A). Sluit de plaat af met een optische PCR-plaatafdichting.</li>
		<li>Voer de PCR uit volgens de cyclusparameters: 98 °C gedurende 5 minuten, 39 cycli van 98 °C gedurende 10 s, de gekozen gloeitemperatuur (72 °C) gedurende 30 s; eindverlenging 72 °C gedurende 2 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Genereer thermische smeltprofielen volgens de parameters: denaturatiestap 95 °C gedurende 1 minuut, gloeien bij 60 °C gedurende 1 minuut, smeltcurvedetectie tussen 75 °C en 95 °C in stappen van 0,2 °C, met een houdtijd van 10 s bij elke temperatuur. Zie de aanvullende materiaal- en aanvullende figuur S1-S5 voor een gedetailleerde beschrijving van de software-instellingen voor HRMA-uitvoering met behulp van het CFX96 Real-Time System.</li>
	<li>Onderzoek de smeltprofielen (figuur 3B). Wijs wild-type besturingselement toe aan het referentiecluster. OPMERKING: De software (zie de tabel met materialen) normaliseert automatisch de gegevens en wijst clusters aan met kleuren voor verschillende smeltcurven.</li>
	<li>Markeer de verschillende clusters met overeenkomstige kleuren op de sjabloon met 96 bronnen (afbeelding 3C).</li>
	<li>Selecteer de personen met interessante curven, verwijder ze uit de buizen en ga terug (figuur 3D). Voer de gepaarde vrouwtjes met bloed en verzamel G2-eieren .</li>
</ol>4. Sequentieverificatie door Sanger-sequencing
<ol><li>Zuiver het PCR-product uit de putten met geselecteerde muggen (van de plaat bereid in sectie 3.1), gebruik een enzym om de resterende PCR-primers af te breken en defosfororylaat overtollige dNTPs. U kunt ook een kolomopruimingskit gebruiken en doorgaan met het sequentiëren van de monsters. OPMERKING: Directe sequencing kan een grotere uitdaging zijn wanneer de PCR-productgrootte klein is (≤200 bp). Ontwerp in dergelijke gevallen primers om grotere fragmenten die de doellocatie omvatten te versterken (≥250 bp) en te versterken door PCR met behulp van het DNA in de 96-well plaat (stap 2.2).</li>
	<li>Analyseer en identificeer de indels met behulp van trace viewer software (Figuur 4). Als alternatief kan Poly Peak Parser software20 helpen bij het detecteren van de mutatie bij heterozygote individuen.<ol>
<li>Ga naar de Poly Peak Parser-website, selecteer de volgorde van de mutanten in het menu Bladeren en kopieer en plak de referentiereeks in het vak. OPMERKING: De uitlijning tussen het alternatieve allel en de referentie verschijnt automatisch aan de rechterkant van het scherm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+Guidelines+for+diagnosis%2C+treatment%2C+prevention+and+control%5BTitle%5D)+AND+%22WHO%22%5BJournal%5D)">Dengue Guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control.</a> WHO. , Report No. 978 160(2009).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+epidemiology+update%5BTitle%5D)+AND+%22WHO%22%5BJournal%5D)">Zika epidemiology update.</a> WHO. , 1-13 (2019).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+prevention+and+control+of+Chikungunya+fever%5BTitle%5D)+AND+%22WHO%22%5BJournal%5D)">Guidelines for prevention and control of Chikungunya fever.</a> WHO. , (2009).</li>
<li>WHO. World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/publications/i/item/9789240015791">https://www.who.int/publications/i/item/9789240015791</a> (2020).</li>
<li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+detection+using+Surveyor+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Mutation detection using Surveyor nuclease.</a> Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).</li>
<li>Babon, J. J., McKenzie, M., Cotton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+resolvases+T4+endonuclease+VII+and+T7+endonuclease+I+in+mutation+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The use of resolvases T4 endonuclease VII and T7 endonuclease I in mutation detection.</a> Molecular Biotechnology. 23 (1), 73-81 (2003).</li>
<li>Erali, M., Voelkerding, K. V., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+melting+applications+for+clinical+laboratory+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Pathology%22%5BJournal%5D)">High resolution melting applications for clinical laboratory medicine.</a> Experimental and Molecular Pathology. 85 (1), 50-58 (2008).</li>
<li>Reed, G. H., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+specificity+of+single-nucleotide+polymorphism+scanning+by+high-resolution+melting+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis.</a> Clinical Chemistry. 50 (10), 1748-1754 (2004).</li>
<li>Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+of+genotyping+zebrafish+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants.</a> Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).</li>
<li>Tong, S. Y., Giffard, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiological+applications+of+high-resolution+melting+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Microbiological applications of high-resolution melting analysis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3418-3421 (2012).</li>
<li>Simko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+DNA+melting+analysis+in+plant+research%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution DNA melting analysis in plant research.</a> Trends in Plant Science. 21 (6), 528-537 (2016).</li>
<li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+end-joining+repair+for+efficient+site-specific+gene+insertion+after+TALEN%2FCRISPR+mutagenesis+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4038-4043 (2015).</li>
<li>O'Leary, S., Adelman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+knockout+of+female-biased+genes+AeAct-4+or+myo-fem+in+Ae.+aegypti+results+in+a+flightless+phenotype+in+female%2C+but+not+male+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 knockout of female-biased genes AeAct-4 or myo-fem in Ae. aegypti results in a flightless phenotype in female, but not male mosquitoes.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 14 (12), 0008971(2020).</li>
<li>Kojin, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aedes+aegypti+SGS1+is+critical+for+Plasmodium+gallinaceum+infection+of+both+the+mosquito+midgut+and+salivary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Aedes aegypti SGS1 is critical for Plasmodium gallinaceum infection of both the mosquito midgut and salivary glands.</a> Malaria Journal. 20 (1), 11(2021).</li>
<li>Ye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-BLAST%3A+a+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13, 134(2012).</li>
<li>Larkin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustal+W+and+Clustal+X+version+2.0%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Clustal W and Clustal X version 2.0.</a> Bioinformatics. 23 (21), 2947-2948 (2007).</li>
<li>Notredame, C., Higgins, D. G., Heringa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-Coffee%3A+A+novel+method+for+fast+and+accurate+multiple+sequence+alignment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment.</a> Journal of Molecular Biology. 302 (1), 205-217 (2000).</li>
<li>Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+targeted+mutagenesis+of+Drosophila+with+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system.</a> Cell Reports. 6 (6), 1178-1179 (2014).</li>
<li>Zuker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mfold+web+server+for+nucleic+acid+folding+and+hybridization+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction.</a> Nucleic Acids Research. 31 (13), 3406-3415 (2003).</li>
<li>Hill, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly+peak+parser%3A+Method+and+software+for+identification+of+unknown+indels+using+sanger+sequencing+of+polymerase+chain+reaction+products%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Poly peak parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products.</a> Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).</li>
<li>Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+candidate+iron+transporters+from+the+ZIP%2FZnT+gene+families+in+the+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Identification of candidate iron transporters from the ZIP/ZnT gene families in the mosquito Aedes aegypti.</a> Frontiers in Physiology. 9, 380(2018).</li>
<li>Slomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+melting+%28HRM%29+for+high-throughput+genotyping-limitations+and+caveats+in+practical+case+studies%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2316(2017).</li>
<li>Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+T7E1+and+surveyor+mismatch+cleavage+assays+to+detect+mutations+triggered+by+engineered+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases.</a> G3. 5 (3), 407-415 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Smeltanalyse met hoge resolutie biedt een eenvoudige en snelle oplossing voor de identificatie van dedels die worden gegenereerd door CRISPR/Cas9-technologie in de vectormug Ae. aegypti. Het biedt flexibiliteit, waardoor de genotypering van muggen gemuteerd voor een breed scala aan genen mogelijk is, van vliegspier tot ijzermetabolisme en meer13,14. HRMA kan in slechts enkele uren worden uitgevoerd, van monsterverzameling tot de eindanalyses. Extra tijd ...

Als vectoren van pathogenen zoals dengue1, Zika2 en chikungunya3 virussen, evenals malariaparasieten4, vormen muggen een aanzienlijke bedreiging voor de volksgezondheid voor de mens. Voor al deze ziekten is er een aanzienlijke focus van transmissie-interventie op de bestrijding van muggenvectoren. Studie van de genen die belangrijk zijn in bijvoorbeeld toegeeflijkheid voor pathogenen, muggenconditie, overleving, voortplanting en resistentie tegen insecticiden is de sleutel tot het ontwikkelen van nieuwe muggenbestrijdingsstrategieën. Voor dergelijke doeleinden wordt genoombewerking bij muggen een gangbare praktijk, vooral met de ontwikkeling van technologieën zoals HEs, ZFN's, TALENs en meest recent CRISPR met Cas9. De vestiging van gen-bewerkte stammen omvat meestal het terugkruisen van individuen die de gewenste mutaties gedurende een paar generaties dragen om off-target en founder (bottleneck) effecten te minimaliseren, gevolgd door het kruisen van heterozygote individuen om homozygote of trans-heterozygote lijnen te genereren. Bij afwezigheid van een dominante marker is moleculaire genotypering noodzakelijk in dit proces omdat in veel gevallen geen duidelijke fenotypische eigenschappen kunnen worden gedetecteerd voor heterozygote mutanten.
Hoewel sequencing de gouden standaard is voor genotypische karakterisering, brengt het uitvoeren van dit over honderden of mogelijk duizenden individuen aanzienlijke kosten, arbeid en tijd met zich mee die nodig zijn om resultaten te verkrijgen, wat vooral van cruciaal belang is voor organismen met een korte levensduur zoals muggen. Veelgebruikte alternatieven zijn Surveyor nuclease assay5 (SNA), T7E1 assay6 en hoge resolutie smeltanalyse (HRMA, beoordeeld in 7). Zowel SNA als T7E1 gebruiken endonucleases die alleen niet-overeenkomende bases splitsen. Wanneer een gemuteerd gebied van het heterozygote mutante genoom wordt versterkt, worden DNA-fragmenten van mutante en wild-type allelen gegloeid om niet-overeenkomend dubbelstrengs DNA (dsDNA) te maken. SNA detecteert de aanwezigheid van mismatches via de spijsvertering met een mismatch-specifieke endonuclease en eenvoudige agarose gel elektroforese. Als alternatief gebruikt HRMA de thermodynamische eigenschappen van dsDNA gedetecteerd door dsDNA-bindende fluorescerende kleurstoffen, waarbij de disassociatietemperatuur van de kleurstof varieert op basis van de aanwezigheid en het type mutatie. HRMA is onder andere gebruikt voor de detectie van single-nucleotide polymorfismen (SNP's)8, mutante genotypering van zebravissen9, microbiologische toepassingen10 en plantengenetisch onderzoek11.
Dit artikel beschrijft HRMA, een eenvoudige methode van moleculaire genotypering voor gemuteerde muggen gegenereerd door CRISPR / Cas9-technologie. De voordelen van HRMA ten opzichte van alternatieve technieken omvatten 1) flexibiliteit, omdat het nuttig is gebleken voor verschillende genen, een breed scala aan indelgroottes, evenals het onderscheid tussen verschillende indelgroottes en heterozygote, homozygote en trans-heterozygote differentiatie12,13,14, 2) kosten, omdat het is gebaseerd op veelgebruikte PCR-reagentia, en 3) tijdbesparend, omdat het in slechts een paar uur kan worden uitgevoerd. Bovendien gebruikt het protocol een klein lichaamsdeel (een poot) als bron van DNA, waardoor de mug het genotyperingsproces kan overleven, waardoor mutantenlijnen kunnen worden opgezet en onderhouden.

<table><tbody><tr><td>70% Ethanol</td><td></td><td></td><td>70% ethanoloplossing in water</td></tr><tr><td>96-well PCR en Real-time PCR platen</td><td>VWR</td><td>82006-636</td><td>Voor het verkrijgen van genomisch DNA (van de mugbeen)</td></tr><tr><td>96-well platen templates</td><td></td><td></td><td>Huisgemaakte bedrukte, voor genotype-opname</td></tr><tr><td>Bio Rad CFX96</td><td>Bio Rad</td><td></td><td>PCR machine met gradiënt en HRMA mogelijkheden</td></tr><tr><td>Diversified Biotech reagent reservoirs</td><td>VWR</td><td>490006-896</td><td></td></tr><tr><td>Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E1050S</td><td></td></tr><tr><td>Glazen Petri-schaal</td><td>VWR</td><td>89001-246</td><td>150 mm x 20 mm</td></tr><tr><td>Hard-shell dunne wand 96-well omrande PCR platen</td><td>Bio-rad</td><td>HSP9665</td><td>Voor HRMA</td></tr><tr><td>Multi-kanaals pipettor (P10)</td><td>Integra Biosciences</td><td>4721</td><td></td></tr><tr><td>Multi-kanaals pipettor (P300)</td><td>Integra Biosciences</td><td>4723</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Polyolefin Acrylaat Sealing tape, Thermo Scientific</td><td>VWR</td><td>37000-548</td><td>Te gebruiken met de 96-well PCR platen voor het verkrijgen van genomisch DNA</td></tr><tr><td>Optische afdichtingstape</td><td>Bio-rad</td><td>2239444</td><td>Te gebruiken met de 96-well omrande PCR platen voor HRMA</td></tr><tr><td>Phire Animal tissue direct PCR Kit (zonder bemonsteringshulpmiddelen)</td><td>Thermo Fisher</td><td>F140WH</td><td>Voor het verkrijgen van genomisch DNA en het uitvoeren van PCR</td></tr><tr><td>Kunststof Vlieg Flessen Verdelers</td><td>Genesee</td><td>59-128W</td><td></td></tr><tr><td>Precision Melt Analysis Software</td><td>Bio Rad</td><td>1845025</td><td>Gebruikt voor het genotyperen van de mug DNA-monsters en het analyseren van de thermische denaturing eigenschappen van dubbelstrengs DNA (zie protocol stap 3.3)</td></tr><tr><td>SeqMan Pro</td><td>DNAstar Lasergene software</td><td></td><td>Voor multiple sequentie-uitlijning</td></tr><tr><td>Eenkanaals pipettor</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pincet Dumont #5 11 cm</td><td>WPI</td><td>14098</td><td></td></tr><tr><td>Witte schuimpluggen</td><td>VWR</td><td>60882-189</td><td></td></tr><tr><td>Brede Drosophila Flessen, Polystyreen</td><td>Genesee</td><td>32-117</td><td></td></tr><tr><td>Brede Vlieg Flessen Tray, Blauw</td><td>Genesee</td><td>59-164B</td><td></td></tr></tbody></table>

indel detection na crispr/cas9 mutagenese met behulp van hoge resolutie melt analysis in de mosquito aedes aegypti

Indel Detection following CRISPR/Cas9 Mutagenesis using High-resolution Melt Analysis in the Mosquito Aedes aegypti

Muggengenbewerking is routine geworden in verschillende laboratoria met de oprichting van systemen zoals transcriptie-activator-achtige effectornucleasen (TALENs), zinkvingernucleasen (ZFN's) en homing-endonucleasen (HE's). Meer recent heeft geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhalingen (CRISPR) / CRISPR-geassocieerd eiwit 9 (Cas9) -technologie een eenvoudiger en goedkoper alternatief geboden voor precisiegenoomtechnologie. Na nuclease-actie zullen DNA-reparatieroutes de gebroken DNA-uiteinden repareren, vaak met indels. Deze out-of-frame mutaties worden vervolgens gebruikt voor het begrijpen van de genfunctie in de doelorganismen. Een nadeel is echter dat mutante individuen geen dominante marker dragen, waardoor identificatie en tracking van mutante allelen een uitdaging is, vooral op schalen die nodig zijn voor veel experimenten. 
Hoge resolutie smeltanalyse (HRMA) is een eenvoudige methode om variaties in nucleïnezuursequenties te identificeren en maakt gebruik van PCR-smeltcurven om dergelijke variaties te detecteren. Deze post-PCR-analysemethode maakt gebruik van fluorescerende dubbelstrengs DNA-bindende kleurstoffen met instrumentatie die de mogelijkheid heeft om gegevens vast te leggen op temperatuurstijgingen en eenvoudig kan worden geschaald naar 96-well plaatformaten. Hier wordt een eenvoudige workflow beschreven met behulp van HRMA voor de snelle detectie van CRISPR / Cas9-geïnduceerde indels en het opzetten van mutantenlijnen in de mug Ae. aegypti. Kritisch is dat alle stappen kunnen worden uitgevoerd met een kleine hoeveelheid beenweefsel en niet vereisen dat het organisme wordt opgeofferd, waardoor genetische kruisingen of fenotyperingstests kunnen worden uitgevoerd na genotypering.

Muggen met mutaties in de genen AaeZIP11 (putative iron transporter21) en myo-fem (een female-biased myosine-gen gerelateerd aan vluchtspieren13) werden verkregen met behulp van CRISPR/Cas9-technologie, gegenotypeerd met BEHULP VAN HRMA en sequentie-geverifieerd (figuur 5). Figuur 5A en figuur 5C tonen de genormaliseerde fluorescentie-intensiteit van de HRM-curven van...

Dit artikel beschrijft een protocol voor snelle identificatie van indels geïnduceerd door CRISPR /Cas9 en selectie van mutante lijnen in de mug Aedes aegypti met behulp van hoge resolutie smeltanalyse.

Indel Detection na CRISPR/Cas9 Mutagenese met behulp van Hoge resolutie Melt Analysis in de Mosquito Aedes aegypti

Mosquito gene editing has become routine in several laboratories with the establishment of systems such as transcription-activator-like effector nucleases ...

Dit protocol is een zeer eenvoudige en efficiënte manier om mutanten te detecteren die door CRISPR/Cas9-technologie van talloze personen worden gegenereerd. De twee belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het in een paar uur kan worden gedaan en dat het van toepassing is op een groot aantal organismen. Primerontwerp kan een uitdaging zijn voor bepaalde genen en meerdere rondes van primerontwerp en -verificatie kunnen nodig zijn om HRMA efficiënt te maken.Als u een gradiënt-PCR wilt uitvoeren, begint u met het voorbereiden van een hoofdmix. Verwijder vervolgens 19 microliter van de mastermix voor de niet-sjabloonbesturing of NTC in een 96-well plaat. Voeg vervolgens de sjabloon toe aan de resterende hoofdmix.Aliquot 20 microliter van het monster mengen in de 96-well plaat. Voer PCR uit volgens de cyclusparameters en genereer vervolgens de thermische smeltprofielen met behulp van de parameters die in het manuscript worden genoemd. Nadat u al het benodigde materiaal hebt verzameld, bereidt u een mastermix voor met 0,5 microliter dna-afgiftereagens en 20 microliter verdunningsbuffer per te genotyperen individu.Gebruik een meerkanaals pipet, aliquot 20 microliter van het mengsel in een PCR-plaat en laat de PCR-plaat op ijs staan. Plaats vervolgens de verdoofde G1-muggen in een glazen petrischaal om ze verdoofd te houden en plaats acht wilde muggen in de tweede petrischaal. Veeg een pincet af met 70% ethanol en gebruik het gedesinfecteerde pincet om een van de achterpoten van de muggen te verwijderen.Dompel vervolgens het been onder in de DNA-afgiftereagensoplossing. Plaats de mug in de bijbehorende injectieflacon en sluit de injectieflacon met een spons. Als u klaar bent, veegt u het pincet af met 70% ethanol voordat u doorgaat met het verwijderen van het been van de volgende mug totdat de 96-well plaat is voltooid.Sluit de plaat later af met een optische PCR-plaatafdichting en incubeer de PCR-plaat met de poten bij kamertemperatuur gedurende twee tot vijf minuten, gevolgd door incubatie bij 98 graden Celsius gedurende twee minuten. Laat de plaat afkoelen tot kamertemperatuur. Bereid voor PCR een mastermix met de gewenste componenten en gebruik vervolgens een meerkanaalspipet om 19 microliter van de mastermix over te brengen in elke put van de 96-well plaat.Na het overbrengen van een microliter van de DNA-afgifteoplossing met eerder bereid muggen-DNA naar de plaat, verzegelt u de plaat met een optische PCR-plaatafdichting. Voer de PCR uit met de juiste cyclusparameters om thermische smeltprofielen te genereren volgens de parameters die in het manuscript worden beschreven en onderzoek vervolgens de smeltprofielen door wildtypecontrole toe te wijzen aan het referentiecluster. Markeer de verschillende clusters met bijbehorende kleuren op de sjabloon met 96 bronnen.Selecteer vervolgens de personen met interessante curven en verwijder de geselecteerde personen van het buizen- naar het achterkruis. Bloedvoer de maakte het vrouwtjes, gevolgd door het verzamelen van G2A's. In de representatieve analyse wordt de sequentieanalyse van de ZIP11-mutant van de Aedes aegypti getoond.Het elektroferogram van Aedes aegypti ZIP11 heterozygote mutanten gaf de nucleotidepositie aan waar de indel voorkwam. De indel wordt weergegeven door een verschuiving van enkele naar dubbele pieken, omdat polymorfe posities beide nucleotiden gelijktijdig laten zien. Aan het einde van de run werd het aantal verwijderde of ingevoegde basenparen berekend door de enkele pieken te tellen.Muggen met mutaties in de genen Aedes aegypti ZIP11 en myo-fem werden gegenotypeerd en gesequenced geverifieerd met behulp van de hoge resolutie smeltanalyse van HRMA. De fluorescerende signalen van de monsters werden genormaliseerd tot relatieve waarden van één tot nul. Bovendien werd elke curve afgetrokken van de wild-type referentie en de bijbehorende vergroting aangegeven.Een mislukte automatische clustertoewijzing wordt weergegeven in de representatieve resultaten, waarbij geen goed onderscheid tussen de groepen is gemaakt. Verder werd elk monster individueel geanalyseerd en toegewezen aan de juiste groepen op basis van de gelijkenis met referentiemonsters van heterozygoten, homozygoten en transheterozygoten. Na het uitvoeren van HRMA's is het sequentiëren van het DNA van de gemuteerde individuen noodzakelijk om de indels te analyseren en de andere mutaties in de beoogde sequentie te identificeren.

indel-detection-following-crisprcas9-mutagenesis-using-high

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

This video demonstrates the role of digital droplet polymerase chain reaction in identifying indel mutation in a DNA sample. The high precision and sensitivity of ddPCR enable accurate and consistent detection of rare mutations present in a sample, even at low levels. It can identify and quantify indel mutations in different regions of the genome, providing valuable insights into the mechanisms of mutation and the functional consequences of these mutations.

Digital Droplet Polymerase Chain Reaction for Indel Mutation Detection in Target Genes

This video demonstrates the gradient polymerase chain reaction for optimization of the annealing temperature of primers, which sets gradient annealing temperature along wells. The effect of different annealing temperatures is determined by the yield of amplified products that helps to optimize the reaction condition.

Gradient Polymerase Chain Reaction to Determine the Optimum Annealing Temperature

Dit protocol beschrijft de workflow van een CRISPR/Cas9 gebaseerde gen bewerken systeem voor de reparatie van puntmutaties in zoogdiercellen. Hier, gebruiken wij een combinatorische benadering voor het gen bewerken met een gedetailleerde opvolgzuigelingenvoeding experimentele strategie voor het meten van indel vorming op de doelsite — Kortom, het analyseren van on-site mutagenese.

Een standaard methodiek te onderzoeken ter plaatse mutageniteit als een functie van punt mutatie reparatie gekatalyseerd door CRISPR/Cas9 en SsODN in menselijke cellen

Dit protocol beschrijft micro-injectieprocedures voor Culex quinquefasciatus embryo's die zijn geoptimaliseerd om te werken met CRISPR/Cas9 genbewerkingstools. Deze techniek kan efficiënt site-specifieke, erfelijke, kiembaanmutaties genereren die kunnen worden gebruikt voor het bouwen van genetische technologieën in deze onderbelichte ziektevector.

Embryo micro-injection technieken voor efficiënte site-specifieke mutagenese in Culex quinquefasciatus

CRISPR/Cas9 wordt steeds vaker gebruikt om genfunctie in niet-modelorganismen te karakteriseren. Dit protocol beschrijft hoe knock-out lijnen van Culex pipienste genereren, van het bereiden van injectiemengsels tot het verkrijgen en injecteren van muggenembryo's, evenals hoe geïnjecteerde muggen en hun nakomelingen op te wekken, te kruisen en te screenen op gewenste mutaties.

Embryo's van Culex-muggen voorbereiden en injecteren om null-mutaties te genereren met CRISPR/Cas9

Hier wordt een protocol gepresenteerd van Helicoverpa armigera (Hübner) embryo micro-injectie en knock-out mutant identificatie gemaakt door CRISPR / Cas9 genoombewerking. Gemuteerde insecten maken verder onderzoek naar genfunctie en interactie tussen verschillende genen in vivo mogelijk.

Embryo Microinjectie en Knockout Mutant Identificatie van CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (Hübner)

Het protocol beschrijft hoe locatiegerichte modificaties in het genoom van Anopheles malariamuggen kunnen worden bereikt met behulp van het φC31-systeem . De beschreven modificaties omvatten zowel de integratie als de uitwisseling van transgene cassettes in het genoom van attP-dragende koppelingslijnen.

Site-Directed φC31-gemedieerde integratie en cassette-uitwisseling in Anopheles Vectors of Malaria

Dit protocol biedt de stappen van DNA-extractie tot experimentele opstelling voor digitale druppel PCR (ddPCR), inclusief analyse voor de identificatie en kwantificering van niet-homologe end-joining (NHEJ) gebeurtenissen op doellocaties na gRNA-geïnduceerde Cas9-splitsing en DNA-reparatie. Andere toepassingen van deze methode zijn toepassingen zoals polymorfismedetectie en genbewerkingsvariantverificatie.

Digital-Droplet PCR om indels mutaties in genetisch gemodificeerde anopheline muggenpopulaties te detecteren

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor genoombewerking door middel van embryonale micro-injectie in de mug A. aegypti met behulp van de CRISPR-Cas9-technologie.

Genoombewerking in de gelekoortsmug Aedes aegypti met behulp van CRISPR-Cas9

Genetisch gecodeerde histon-miniSOG induceert genoom-brede erfelijke mutaties in een blauw licht-afhankelijke manier. Dit mutagenese methode is eenvoudig, snel, vrij van giftige chemicaliën, en zeer geschikt voor forward genetische screening en transgene integratie.

Optogenetische willekeurige mutagenese met behulp van histon-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Leer een efficiënte methode voor het detecteren van CRISPR/Cas9-geïnduceerde indels in Aedes aegypti met behulp van high-resolution melt analysis. Deze techniek maakt snelle identificatie van mutanten mogelijk.

Indel Detection na CRISPR/Cas9 Mutagenese met behulp van Hoge resolutie Melt Analysis in de Mosquito Aedes aegypti

Meer video's verkennen