Indel Detection na CRISPR/Cas9 Mutagenese met behulp van Hoge resolutie Melt Analysis in de Mosquito Aedes aegypti
10 september 2021
Dit artikel beschrijft een protocol voor snelle identificatie van indels geïnduceerd door CRISPR /Cas9 en selectie van mutante lijnen in de mug Aedes aegypti met behulp van hoge resolutie smeltanalyse.
Dit protocol is een zeer eenvoudige en efficiënte manier om mutanten te detecteren die door CRISPR/Cas9-technologie van talloze personen worden gegenereerd. De twee belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het in een paar uur kan worden gedaan en dat het van toepassing is op een groot aantal organismen. Primerontwerp kan een uitdaging zijn voor bepaalde genen en meerdere rondes van primerontwerp en -verificatie kunnen nodig zijn om HRMA efficiënt te maken.
Als u een gradiënt-PCR wilt uitvoeren, begint u met het voorbereiden van een hoofdmix. Verwijder vervolgens 19 microliter van de mastermix voor de niet-sjabloonbesturing of NTC in een 96-well plaat. Voeg vervolgens de sjabloon toe aan de resterende hoofdmix.
Aliquot 20 microliter van het monster mengen in de 96-well plaat. Voer PCR uit volgens de cyclusparameters en genereer vervolgens de thermische smeltprofielen met behulp van de parameters die in het manuscript worden genoemd. Nadat u al het benodigde materiaal hebt verzameld, bereidt u een mastermix voor met 0,5 microliter dna-afgiftereagens en 20 microliter verdunningsbuffer per te genotyperen individu.
Gebruik een meerkanaals pipet, aliquot 20 microliter van het mengsel in een PCR-plaat en laat de PCR-plaat op ijs staan. Plaats vervolgens de verdoofde G1-muggen in een glazen petrischaal om ze verdoofd te houden en plaats acht wilde muggen in de tweede petrischaal. Veeg een pincet af met 70% ethanol en gebruik het gedesinfecteerde pincet om een van de achterpoten van de muggen te verwijderen.
Dompel vervolgens het been onder in de DNA-afgiftereagensoplossing. Plaats de mug in de bijbehorende injectieflacon en sluit de injectieflacon met een spons. Als u klaar bent, veegt u het pincet af met 70% ethanol voordat u doorgaat met het verwijderen van het been van de volgende mug totdat de 96-well plaat is voltooid.
Sluit de plaat later af met een optische PCR-plaatafdichting en incubeer de PCR-plaat met de poten bij kamertemperatuur gedurende twee tot vijf minuten, gevolgd door incubatie bij 98 graden Celsius gedurende twee minuten. Laat de plaat afkoelen tot kamertemperatuur. Bereid voor PCR een mastermix met de gewenste componenten en gebruik vervolgens een meerkanaalspipet om 19 microliter van de mastermix over te brengen in elke put van de 96-well plaat.
Na het overbrengen van een microliter van de DNA-afgifteoplossing met eerder bereid muggen-DNA naar de plaat, verzegelt u de plaat met een optische PCR-plaatafdichting. Voer de PCR uit met de juiste cyclusparameters om thermische smeltprofielen te genereren volgens de parameters die in het manuscript worden beschreven en onderzoek vervolgens de smeltprofielen door wildtypecontrole toe te wijzen aan het referentiecluster. Markeer de verschillende clusters met bijbehorende kleuren op de sjabloon met 96 bronnen.
Selecteer vervolgens de personen met interessante curven en verwijder de geselecteerde personen van het buizen- naar het achterkruis. Bloedvoer de maakte het vrouwtjes, gevolgd door het verzamelen van G2A's. In de representatieve analyse wordt de sequentieanalyse van de ZIP11-mutant van de Aedes aegypti getoond.
Het elektroferogram van Aedes aegypti ZIP11 heterozygote mutanten gaf de nucleotidepositie aan waar de indel voorkwam. De indel wordt weergegeven door een verschuiving van enkele naar dubbele pieken, omdat polymorfe posities beide nucleotiden gelijktijdig laten zien. Aan het einde van de run werd het aantal verwijderde of ingevoegde basenparen berekend door de enkele pieken te tellen.
Muggen met mutaties in de genen Aedes aegypti ZIP11 en myo-fem werden gegenotypeerd en gesequenced geverifieerd met behulp van de hoge resolutie smeltanalyse van HRMA. De fluorescerende signalen van de monsters werden genormaliseerd tot relatieve waarden van één tot nul. Bovendien werd elke curve afgetrokken van de wild-type referentie en de bijbehorende vergroting aangegeven.
Een mislukte automatische clustertoewijzing wordt weergegeven in de representatieve resultaten, waarbij geen goed onderscheid tussen de groepen is gemaakt. Verder werd elk monster individueel geanalyseerd en toegewezen aan de juiste groepen op basis van de gelijkenis met referentiemonsters van heterozygoten, homozygoten en transheterozygoten. Na het uitvoeren van HRMA's is het sequentiëren van het DNA van de gemuteerde individuen noodzakelijk om de indels te analyseren en de andere mutaties in de beoogde sequentie te identificeren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor de snelle identificatie van indels geïnduceerd door CRISPR/Cas9 en de selectie van mutante lijnen bij de mug Aedes aegypti met behulp van high-resolution melt analyse. De methode is efficiënt en toepasbaar op diverse organismen, waardoor mutanten snel kunnen worden gedetecteerd.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Genetica
- Moleculaire biologie
- Entomologie
Achtergrond
- CRISPR/Cas9-technologie wordt op grote schaal gebruikt voor genbewerking.
- Het efficiënt identificeren van mutaties is cruciaal voor genetische studies.
- High-resolution melt analyse (HRMA) biedt een snelle detectiemethode.
- Uitdagingen bij het ontwerp van primers kunnen de efficiëntie van HRMA beïnvloeden.
Doel van de studie
- Om een protocol te bieden voor het identificeren van CRISPR-geïnduceerde mutaties.
- Om de toepasbaarheid van HRMA in diverse organismen aan te tonen.
- Om het proces van selectie van mutantlijnen te stroomlijnen.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van een mastermix voor PCR.
- Gebruik van non-template controls (NTC) in een 96-wells plaat.
- Gradient PCR om condities te optimaliseren.
- High-resolution melt-analyse voor het detecteren van indels.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol maakt een snelle identificatie van mutanten mogelijk.
- HRMA kan binnen enkele uren worden voltooid.
- Meerdere ronden van primerontwerp kunnen noodzakelijk zijn voor een optimale efficiëntie.
- De methode is veelzijdig toepasbaar over verschillende soorten heen.
Conclusies
- Dit protocol verhoogt de efficiëntie van de detectie van mutanten.
- Het biedt een waardevol instrument voor genetisch onderzoek bij muggen.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze methode voor bredere toepassingen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Snelle detectie van CRISPR/Cas9-geïnduceerde indels maakt efficiënte target-validatie in vectorcontrole-onderzoek mogelijk, waardoor de tijdlijnen voor functionele genstudies worden verkort. High-resolution melt-analyse ondersteunt schaalbare genotypering zonder opoffering van organismen, wat downstream fenotypische assays en genetische kruisingen vergemakkelijkt. Deze aanpak vergroot het voorspellend vertrouwen bij vroege ontdekkingen door kwantitatieve mutatiedetectie vanuit minimale weefselmonsters mogelijk te maken.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking en targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door middel van snelle indel-detectie na CRISPR-mutagenese.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door mutante allelen te identificeren zonder organismen op te offeren, waardoor monsters bewaard blijven voor vervolgonderzoeken.
- Impact op portfolio: Versnelt workflows voor targetvalidatie, waardoor gen-targets in ziekterelateerde systemen sneller kunnen worden geprioriteerd.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Produceert genormaliseerde fluorescentie-smeltcurves waarmee kwantitatieve vergelijking van wild-type en mutante genotypen mogelijk is.
- Operationele waarde: Compatibel met 96-well plaatformaten, ter ondersteuning van screening met een medium doorvoersnelheid van bewerkte individuen.
- Klaarheid van de assay: Genereert onderscheidbare smeltprofielen voor heterozygoten, homozygoten en transheterozygoten, wat een betrouwbare clustertoewijzing mogelijk maakt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Maakt genotypering gevolgd door fenotypering of bloedvoeding mogelijk, waardoor genetische modificatie wordt gekoppeld aan functionele uitkomsten in ziektemodellen.
- Mechanistische risicoreductie: Faciliteert indel-karakterisering via downstream sequencing, wat on-target effecten bevestigt en potentiële off-target modificaties identificeert.
- Ondersteuning van preklinische modellen: Maakt de vestiging van mutante lijnen in Aedes aegypti mogelijk, een belangrijke vector voor studies naar de transmissie van arbovirussen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van CRISPR-mutagenese tot lead-identificatie en biedt een genotyperingscontrole voorafgaand aan de functionele validatie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door snel indels te identificeren die de genfunctie in doelpaden verstoren.
- Screening: Maakt assay-standaardisatie mogelijk via genormaliseerde smeltkrompanalyse en referentiegebaseerde clustering.
- Analytiek: Genereert kwantitatieve verschuivingen in het smeltprofiel die correleren met de grootte van de indel, wat vergelijkende analyse tussen monsters mogelijk maakt.
- Translationeel onderzoek: Verbindt genetische modificatie met fenotypische beoordeling door het gebruik van levende organismen na genotypering mogelijk te maken.
- Bedrijfsvoering en hergebruik: Herbruikbaar voor diverse organismen en genen, waarbij de aanpasbaarheid van het primerontwerp een brede toepasbaarheid op doelwitten ondersteunt.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in target-validatie door direct bewijs van de resultaten van genbewerking te leveren.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde PCR- en smeltanalyseprotocollen met ingebouwde controles.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door de tijd en middelen die nodig zijn voor mutantscreening te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde vooruitgang mogelijk door de aanwezigheid van mutaties te bevestigen voordat er wordt geïnvesteerd in fenotypische assays.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in primerontwerp en -optimalisatie, aangezien bepaalde genen meerdere ontwerpiteraties kunnen vereisen voor een efficiënte HRMA.
- Afhankelijk van instrumentatie met nauwkeurige temperatuurrampbesturing en fluorescentiedetectie voor high-resolution melt-analyse.
- Vereist gestandaardiseerde monstervoorbereiding met gebruik van pootweefsel en reagentia voor DNA-vrijgave om een consistente inputkwaliteit te waarborgen.
- Vereist wild-type referentiemonsters voor een nauwkeurige clustertoewijzing en normalisatie van het smeltprofiel.
- Beperkt door de noodzaak van sequencing na HRMA om indels volledig te karakteriseren en aanvullende mutaties in de doelsequentie te detecteren.
Veelgestelde vragen over Biopharma
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:33
A Gradient PCR Using Genomic DNA (gDNA) from a Single Individual
1:09
Preparation of Genomic DNA from Mosquito Legs
2:31
Perform PCR
3:35
Results: Detection of CRISPR/Cas9-Induced Indels and the Establishment of Mutant Lines in the Mosquito Aedes aegypti
5:02
Conclusion
