Name: Beeldvorming van moleculaire adhesie in celrollen door adhesievoetafdruktest (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Leer de adhesievoetafdruktest voor beeldvorming van moleculaire adhesie in rollende cellen met TIRF-microscopie. Deze methode kwantificeert fysiologisch relevante adhesiekrachten op moleculair niveau.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Canada Foundation of Innovation (CFI 35492), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN-2017-04407), New Frontiers in Research Fund (NFRFE-2018-00969), Michael Smith Foundation for Health Research (SCH-2020-0559) en het Eminence Fund van de University of British Columbia.

<ol><li>McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rolling+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Rolling cell adhesion.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).</li>
<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+The+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li>
<li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+adhesion+and+activation+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Neutrophil adhesion and activation under flow.</a> Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).</li>
<li>Etzioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+molecules+-+Their+role+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Adhesion molecules - Their role in health and disease.</a> Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).</li>
<li>van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+adhesion+deficiencies%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology%2FOncology+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Leukocyte adhesion deficiencies.</a> Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).</li>
<li>Hanna, S., Etzioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+adhesion+deficiencies%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Leukocyte adhesion deficiencies.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).</li>
<li>Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycomechanics+of+the+metastatic+cascade%3A+Tumor+cell-endothelial+cell+interactions+in+the+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).</li>
<li>Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-selectin+ligand-1+controls+circulating+prostate+cancer+cell+rolling%2Fadhesion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis.</a> Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).</li>
<li>Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+catch+bonds+involving+cell-adhesion+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules.</a> Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).</li>
<li>Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesive+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Adhesive dynamics.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006(2014).</li>
<li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+interpretation+of+cell+rolling+velocity+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution.</a> Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).</li>
<li>Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+cell+surface+adhesion+by+rotation+tracking+and+adhesion+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting.</a> Scientific Reports. 7 (1), 44502(2017).</li>
<li>Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+fast+molecular+adhesion+by+fluorescence+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting.</a> Science Advances. 7 (34), (2021).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).</li>
<li>Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+prepare+reproducible%2C+homogeneous%2C+and+hydrolytically+stable+aminosilane-derived+layers+on+silica%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica.</a> Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).</li>
<li>Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549(2014).</li>
<li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+with+DNA-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li>
<li>Chalfoun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIST%3A+Accurate+and+scalable+microscopy+image+stitching+tool+with+stage+modeling+and+error+minimization%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4988(2017).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+modular+and+universal+single+molecule+tension+sensor+using+protein+G+to+study+mechano-sensitive+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors.</a> Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).</li>
<li>Crockett-Torabi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectins+and+mechanisms+of+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Selectins and mechanisms of signal transduction.</a> Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).</li>
<li>Ye, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P-selectin+and+PSGL-1+axis+accelerates+atherosclerosis+via+activation+of+dendritic+cells+by+the+TLR4+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway.</a> Cell Death and Disease. 10 (7), 507(2019).</li>
<li>Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+IgG+binding+to+proteins+G+and+A%3A+Nonequilibrium+kinetic+and+binding+constant+determination+with+the+acoustic+waveguide+device%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device.</a> Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).</li>
<li>Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+molecular+forces+with+serially+connected+force+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantifying molecular forces with serially connected force sensors.</a> Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).</li>
<li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+molecular+tension-classifications%2C+interpretations+and+limitations+of+force+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors.</a> Physical Biology. 17 (1), 011001(2020).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.

De adhesievoetafdruktest maakt visualisatie mogelijk van de moleculaire adhesiegebeurtenissen tussen PSGL-1 en P-selectine tijdens celrollende adhesie. Dit proces wordt geïnitieerd door P-selectin-gemedieerde opname gevolgd door rollen onder vloeistofschuifspanning. Mogelijke problemen tijdens het experiment hebben meestal betrekking op slecht rollen van cellen of het missen van fluorescerende sporen, zelfs als cellen goed rollen. Deze problemen zijn vaak het gevolg van kwaliteitscontroles bij de kritieke stappen in het ...

De rollende adhesiecascade beschrijft hoe circulerende cellen aan de bloedvatwand vastklampen en langs de bloedvatwand rollen1. Passief rollen wordt voornamelijk gemedieerd door selectins, een belangrijke klasse van cellulaire adhesiemoleculen (CAMs)1. Onder de schuifstroom van bloed vormen leukocyten die P-selectine glycoproteïneligand-1 (PSGL-1) tot expressie brengen, zeer voorbijgaande bindingen met P-selectine, die tot expressie kunnen komen op het oppervlak van ontstoken endotheelcellen. Dit proces is van cruciaal belang voor leukocyten om te migreren naar een plaats van ontsteking2. Bovendien is PSGL-1 ook een mechanosensitieve receptor die in staat is om de daaropvolgende stevige adhesiefase van de rollende adhesiecascade te activeren bij zijn betrokkenheid bij P-selectin3.
Genetische mutaties die de CAM-functie beïnvloeden, kunnen het immuunsysteem ernstig beïnvloeden, zoals bij de zeldzame ziekte van leukocytenadhesiedeficiëntie (LAD), waar storing van adhesiemoleculen die het rollen bemiddelen, leidt tot ernstig immuungecompromitteerde individuen4,5,6. Bovendien is aangetoond dat circulerende tumorcellen migreren volgens een vergelijkbaar rollend proces, wat leidt tot metastase7,8. Omdat celrollen echter snel en dynamisch is, zijn conventionele experimentele mechanobiologische methoden niet geschikt voor het bestuderen van moleculaire interacties tijdens het rollen van cellen. Hoewel manipulatiemethoden met één cel en één molecuul, zoals atoomkrachtmicroscopie en optisch pincet, moleculaire interacties zoals de krachtafhankelijke interactie van P-selectine met PSGL-1 op het niveau van één molecuul9 konden bestuderen, zijn ze niet geschikt voor het onderzoeken van live adhesiegebeurtenissen tijdens het rollen van cellen. Bovendien kan de in vitro gekarakteriseerde interactie de vraag over moleculaire adhesie in vivo niet direct beantwoorden. Welk moleculair spanningsbereik is bijvoorbeeld biologisch relevant wanneer cellen in hun oorspronkelijke omgeving functioneren? Computationele methoden zoals lijmdynamicasimulatie10 of eenvoudig steady-state model11 hebben bepaalde moleculaire details vastgelegd en hoe ze het rolgedrag beïnvloeden, maar zijn sterk afhankelijk van de nauwkeurigheid van de modelleringsparameters en aannames. Andere technieken zoals tractiekrachtmicroscopie kunnen krachten detecteren tijdens celmigratie, maar bieden onvoldoende ruimtelijke resolutie of kwantitatieve informatie over moleculaire spanning. Geen van deze technieken kan directe experimentele observaties bieden van de temporele dynamica, ruimtelijke verdeling en magnitude heterogeniteit van moleculaire krachten, die rechtstreeks verband houden met celfunctie en gedrag in hun oorspronkelijke omgeving.
Daarom is het implementeren van een moleculaire krachtsensor die in staat is om selectin-gemedieerde interacties nauwkeurig te meten cruciaal voor het verbeteren van ons begrip van rollende adhesie. Hier beschrijven we het protocol voor de adhesievoetafdruktest12 waarbij PSGL-1 gecoate kralen worden gerold op een oppervlak dat p-selectin gefunctionaliseerde spanningsmeter tethers (TGT's) presenteert13. Deze TGT's zijn onomkeerbare DNA-gebaseerde krachtsensoren die resulteren in een permanente geschiedenis van breukgebeurtenissen in de vorm van fluorescentie-uitlezing. Dit wordt bereikt door het scheuren van de TGT (dsDNA) en vervolgens het labelen van de gescheurde TGT (ssDNA) met een fluorescerend gelabelde complementaire streng. Een groot voordeel van dit systeem is de compatibiliteit met zowel diffractie-beperkte als superresolutie beeldvorming. De fluorescerend gelabelde complementaire streng kan permanent gebonden zijn (>12 bp) voor diffractie-beperkte beeldvorming of tijdelijk gebonden (7-9 bp) voor superresolutie beeldvorming via DNA PAINT. Dit is een ideaal systeem om de rolhechting te bestuderen, omdat de TGT's tijdens actief rollen worden gescheurd, maar de fluorescentie-uitlezing na het rollen wordt geanalyseerd. De twee beeldvormingsmethoden bieden de gebruiker ook meer vrijheid om rolhechting te onderzoeken. Doorgaans is diffractie-beperkte beeldvorming nuttig voor het extraheren van moleculaire breukkracht door fluorescentie-intensiteit13, terwijl superresolutiebeeldvorming kwantitatieve analyse van receptordichtheid mogelijk maakt. Met de mogelijkheid om deze eigenschappen van rolhechting te onderzoeken, biedt deze aanpak een veelbelovend platform voor het begrijpen van het krachtregulatiemechanisme op de moleculaire adhesie van rollende cellen onder schuifstroom.

<table><tbody><tr><td>4-kanaals boorgids</td><td>Op maat gemaakt</td><td></td><td>3D geprint met ABS-filament</td></tr><tr><td>4-gaten glijding</td><td>Op maat gemaakt</td><td></td><td>Boor schone microscoopglazen met een Dremel met diamantgecoate boorkoppen op een 4-kanaals boorgids die een lay-out heeft die overeenkomt met de centra van de 8-32 draadgaten op de aluminium klem.</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>VWR</td><td>BDH1101-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Acrylen ruimtemaker</td><td>Op maat gemaakt</td><td></td><td>Snijd twee blokken van acrylplaten met de afmeting van 40 mm x 30 mm x 2,5 mm. Boor op elk blok twee 3 mm gaten die precies zijn uitgelijnd met de 4-40 gaten op de aluminium houder.</td></tr><tr><td>Aluminium chiphouder</td><td>Op maat gemaakt</td><td></td><td>Maal geanodiseerd aluminiumblok tot een C-vormige houder met de buitenafmetingen van 640 mm x 500 mm x 65 mm en de openingsafmetingen van 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlaten en uitlaten zijn getapt met 8-32 draad.</td></tr><tr><td>Aminosilane</td><td>AlfaAesar</td><td>L14043</td><td>CAS 1760-24-3</td></tr><tr><td>Antibioticum/antimycotische oplossing</td><td>Cytiva HyClone</td><td>SV3007901</td><td>Pen/Strep/Fungiezone</td></tr><tr><td>Beads, ProtG gecoat polystyreen</td><td>Spherotech</td><td>PGP-60-5</td><td></td></tr><tr><td>Bovien serum albumine</td><td>VWR</td><td>332</td><td></td></tr><tr><td>Buffer, DNA PAINT</td><td></td><td></td><td>0,05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>Buffer, T50M5</td><td></td><td></td><td>10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2</td></tr><tr><td>Buffer, Rolling</td><td></td><td></td><td>HBSS met 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0,1% BSA</td></tr><tr><td>Buffer, Wash</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 en 2 mM CaCl2, 0,05% Tween 20</td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>VWR</td><td>BDH9224</td><td></td></tr><tr><td>Celcultuurkolven</td><td>VWR</td><td>10062-868</td><td></td></tr><tr><td>Geconcentreerd zwavelzuur</td><td>VWR</td><td>BDH3072-2.5LG</td><td>95-98%</td></tr><tr><td>Dekglashoudende pincetten</td><td>Techni-Tool</td><td>758TW150</td><td></td></tr><tr><td>Diamantgecoate boorkoppen</td><td>Abrasive Technology</td><td>C5250510</td><td>0,75 mm diamantboor</td></tr><tr><td>DNA, amine-ssDNA (top streng)</td><td>IDT DNA</td><td>Aangepaste oligo</td><td>CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/</td></tr><tr><td>DNA, biotin-ssDNA (onderste streng)</td><td>IDT DNA</td><td>Aangepaste oligo</td><td>/5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG</td></tr><tr><td>DNA, imager streng voor DNA-PAINT</td><td>IDT DNA</td><td>Aangepaste oligo</td><td>GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/</td></tr><tr><td>DNA, imager streng voor permanente label</td><td>IDT DNA</td><td>Aangepaste oligo</td><td>CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/</td></tr><tr><td>Dubbelzijdige tape</td><td>Scotch</td><td>237</td><td>3/4 inch breedte, permanente dubbelzijdige tape</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermofisher</td><td>15575020</td><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td></tr><tr><td>Epoxy</td><td>Gorilla</td><td>42001</td><td>5 minuten uithardingstijd</td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum (FBS)</td><td>Avantor</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>GelGreen</td><td>Biotium</td><td>41005</td><td></td></tr><tr><td>Glazuur azijnzuur</td><td>VWR</td><td>BDH3094-2.5LG</td><td></td></tr><tr><td>Glas, Dekglazen</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5P</td><td></td></tr><tr><td>Glas, Microscoopglazen</td><td>VWR</td><td>48300-026</td><td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td></tr><tr><td>Glas, Kleurglam</td><td>VWR</td><td>74830-150</td><td>Wheaton Kleurglam (900620)</td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt-oplossing (HBSS)</td><td>Lonza</td><td>04-315Q</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>HL-60 cellen</td><td>ATCC</td><td>CCL-240</td><td></td></tr><tr><td>Luchtvochtigheidskamer glijondersteuning</td><td>Op maat gemaakt</td><td></td><td>3D geprint met ABS-filament</td></tr><tr><td>Waterstofperoxide</td><td>VWR</td><td>BDH7690-1</td><td>30%</td></tr><tr><td>Imidazool</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>Inlaten/uitlaten</td><td>Op maat gemaakt</td><td></td><td>Boor door acht 8-32 stelschroeven met kobaltboorkoppen. Plaats 1,5 cm&nbsp; polyethyleen buis (Tygon, I.D. 1/32&rdquo; O.D. 3/32&rdquo;) in elke holle stelschroef</td></tr><tr><td>Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)</td><td>Lonza</td><td>12-722F</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>VWR</td><td>BDH9244</td><td></td></tr><tr><td>Magneet Ni-NTA kralen</td><td>Invitrogen</td><td>10103D</td><td></td></tr><tr><td>Mailer buizen</td><td>EMS</td><td>EMS71406-10</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bio-Spin P-6 Gel Kolommen</td><td>Biorad</td><td>7326200</td><td>In SSC Buffer</td></tr><tr><td>PEG</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>PEG-biotine</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydroxide</td><td>VWR</td><td>470302-132</td><td></td></tr><tr><td>Eiwit, Eiwit G</td><td>Abcam</td><td>ab155724</td><td>N-terminaal His-Tag en C-terminaal cysteïne</td></tr><tr><td>Eiwit, P-selectine-Fc</td><td>R&amp;D System</td><td>137-PS</td><td>Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF</td></tr><tr><td>Eiwit, Streptavidin</td><td>Cedarlane</td><td>CL1005-01-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Pomp Spuit</td><td>Harvard Apparatus</td><td>704801</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td>Ward&rsquo;s Science</td><td>470302-444</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>VWR</td>

beeldvorming van moleculaire adhesie in celrollen door adhesievoetafdruktest

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Rollende adhesie, vergemakkelijkt door selectin-gemedieerde interacties, is een zeer dynamische, passieve beweeglijkheid bij het rekruteren van leukocyten naar de plaats van ontsteking. Dit fenomeen treedt op in postcapillaire venules, waar de bloedstroom leukocyten in een rollende beweging op de endotheelcellen duwt. Stabiel rollen vereist een delicaat evenwicht tussen de vorming van hechtingsbindingen en hun mechanisch aangedreven dissociatie, waardoor de cel aan het oppervlak vast kan blijven zitten tijdens het rollen in de stroomrichting. In tegenstelling tot andere hechtingsprocessen die plaatsvinden in relatief statische omgevingen, is de rolhechting zeer dynamisch omdat de rollende cellen over duizenden micron reizen met tientallen micron per seconde. Bijgevolg zijn conventionele mechanobiologische methoden zoals tractiekrachtmicroscopie ongeschikt voor het meten van de individuele adhesiegebeurtenissen en de bijbehorende moleculaire krachten vanwege de korte tijdschaal en hoge gevoeligheid die vereist is. Hier beschrijven we onze nieuwste implementatie van de adhesievoetafdruktest om de P-selectine in beeld te brengen: PSGL-1-interacties bij rollende adhesie op moleculair niveau. Deze methode maakt gebruik van onomkeerbare DNA-gebaseerde spanningsmeter-tethers om een permanente geschiedenis van moleculaire adhesiegebeurtenissen te produceren in de vorm van fluorescentiesporen. Deze sporen kunnen op twee manieren worden afgebeeld: (1) het samenvoegen van duizenden diffractie-beperkte beelden om een groot gezichtsveld te produceren, waardoor de adhesievoetafdruk van elke rollende cel over duizenden micron lang kan worden geëxtraheerd, (2) DNA-PAINT uitvoeren om superresolutiebeelden van de fluorescentiesporen binnen een klein gezichtsveld te reconstrueren. In deze studie werd de adhesievoetafdruktest gebruikt om HL-60-cellen te bestuderen die rollen bij verschillende schuifspanningen. Daarbij konden we de ruimtelijke verdeling van de P-selectine: PSGL-1 interactie in beeld brengen en inzicht krijgen in hun moleculaire krachten door fluorescentie-intensiteit. Deze methode vormt dus de basis voor het kwantitatieve onderzoek van de verschillende cel-oppervlakte-interacties die betrokken zijn bij de roladhesie op moleculair niveau.

Het bovenstaande protocol beschrijft de experimentele procedure van de adhesievoetafdruktest. De algemene experimentworkflow wordt geïllustreerd in figuur 1, van de assemblage van de stroomkamer (figuur 1A) tot de oppervlaktefunctionalisatie (figuur 1B) en experiment- en beeldvormingsstappen (figuur 1C).
Figuur 2 is een representatief resultaat v...

Dit protocol presenteert de experimentele procedures om de adhesievoetafdruktest uit te voeren om de adhesiegebeurtenissen tijdens snelle celrollende adhesie in beeld te brengen.

Beeldvorming van moleculaire adhesie in celrollen door adhesievoetafdruktest

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

Dit protocol helpt bij het leggen van het verband tussen moleculaire kracht en celrolgedrag, naast het ruimtelijk in kaart brengen en kwantificeren van rollende adhesie op moleculair niveau. Deze techniek maakt het mogelijk om individuele adhesiegebeurtenissen tijdens het eigenlijke celrollen te bestuderen, waardoor we de fysiologisch relevante moleculaire adhesiekracht direct kunnen meten. Oppervlaktevoorbereiding met behulp van de juiste concentratie en incubatietijd in elke stap is cruciaal om hoogwaardige oppervlaktefunctionalisatie te bereiken.De kwaliteit van bioconjugaties en de juiste omstandigheden zijn ook cruciaal. Visuele demonstratie is van cruciaal belang om onderzoekers te helpen dit protocol te repliceren. Met name de stappen zoals flow chamber assembly en nabewerkingsbeelden zullen veel baat hebben bij een visuele demonstratie.Begin met het dun verspreiden van een kleine hoeveelheid epoxy aan beide zijden van de dubbelzijdige tape met een scheermesje. Knip met behulp van een laser de epoxy-gecoate tape om vier kanalen te creëren. Maak de flowchip door de epoxytape tussen een schuif met vier gaten en peg-afdekkingslip te sandwichen.Gebruik een pipetpunt, oefen zachte druk uit over de lengte van de kanalen om een goede afdichting te creëren en laat de epoxy vervolgens minimaal een uur uitharden. Lijn de chip zo uit dat de opening van elk kanaal zich in het midden van de adapter bevindt. Plaats vervolgens twee transparante acryl afstandhouders op de chip.Oefen stevige druk uit in het midden van het blok en schroef aan de uiteinden van elke afstandhouder. Schroef de inlaten in de schroefgaten aan de andere kant van de beugel en controleer de afdichtingsconditie door het transparante acrylblok. Stroom 200 microliter wasbuffer in de kamer om te controleren op lekkage.Als er bubbels in het kanaal ontstaan, duw dan agressief op nog eens 200 microliter wasbuffer om de bubbels te verwijderen. Voeg 40 microliter BSA toe aan de stroomkamer om niet-specifieke binding te voorkomen en incubeer gedurende 10 minuten in de vochtigheidskamer. Voeg na incubatie 40 microliter bij Tween 20 toe aan de stroomkamer en incubeer opnieuw gedurende 10 minuten om de niet-specifieke binding verder te verminderen.Was vervolgens het kanaal met 200 microliter wasbuffer om alle passiveringsmiddelen te verwijderen. Voeg voor de functionalisering van het kameroppervlak 40 microliter Streptavidin toe aan de stroomkamer en incubeer gedurende 20 minuten en was de kamer vervolgens met 200 microliter wasbuffer. Voeg nu 40 microliter gehybridiseerd eiwit G-TGT toe aan de stroomkamer en incubeer gedurende 20 minuten.Voeg na het wassen met de wasbuffer 40 microliter eiwit G-TGT-bovenstreng toe en incubeer gedurende 20 minuten om elke ongehybridiseerde TGT-onderstreng op het oppervlak te voltooien en was vervolgens met wasbuffer. Voeg ten slotte 40 microliter P-selectin-Fc toe aan de stroomkamer en incubeer gedurende 60 minuten voor het wassen met wasbuffer. Vul een glazen spuit van vijf milliliter met de rolbuffer en tik op de zijkanten van de spuit om de bubbels los te maken en naar buiten te duwen terwijl ze naar de punt drijven.Nadat u een steriele naald in een 200 millimeter stuk polyethyleenslang hebt ingebracht, sluit u de naald aan op de glazen spuit. Bevestig de spuit op de spuitpomp en kantel de spuitpomp zodanig dat de zuigerzijde verhoogd is om te voorkomen dat luchtbellen het kanaal binnendringen. Steek het uiteinde van de buis in de inlaat van de stroomkamer.Steek het ene uiteinde van een ander stuk van 200 millimeter van de polyethyleenbuis in de uitlaat en dompel het andere uiteinde onder in een afvalbeker. Neem één tot twee milliliter van het celsuspensiemonster en centrifugeer om de cellen te pelleteren. Verwijder het medium en resuspend de cellen voorzichtig in 500 microliter van de rolbuffer.Koppel de slang voorzichtig los van de inlaten en de uitlaat en pipetteer 40 microliter van de celsuspensie in de stroomkamer. Sluit de slang opnieuw aan zoals eerder beschreven, zodat er geen bubbels in het stroomkanaal worden gebracht. Begin het celrolexperiment door de spuitpomp met de gewenste stroomsnelheden te starten.Observeer het rollen van cellen met behulp van een microscoop met een 10X objectief. Zodra het experiment is voltooid, verwijdert u de cellen uit het kanaal door de rolbuffer met 100 milliliter per uur te injecteren totdat het oppervlak celvrij is. Voor het in beeld brengen van de lokale sporen door DNA-PAINT, voegt u 40 microliter DNA-PAINT-beeldstreng geprepareerd in DNA-PAINT-buffer toe aan het kanaal.Voer totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie uit met behulp van de voorwaarden die in het tekstmanuscript worden vermeld. Lokaliseer en render de afbeeldingen met superresolutie. Voor het in beeld brengen van de lange sporen door permanente labeling, voegt u de permanente imager-streng toe en incubeert u gedurende 120 seconden in de T50M5-buffer.Was vervolgens het kanaal door 200 microliter wasbuffer toe te voegen. Neem een afbeelding op met de excitatielaser uit om achtergrondcameraruis te verkrijgen. Stel een groot gebied in een rasterpatroon voor met TIRF-microscopie.Programmeer de microscoop om over het gebied van 400 bij 50 afbeeldingen te scannen en splits de onbewerkte gegevens in individuele TIP-bestanden met elk maximaal 10.000 afbeeldingen met behulp van het ImageJ-programma. Vlak alle afbeeldingen af met behulp van het verlichtingsprofiel en gebruik de MIST-plug-in om de afbeeldingen te naaien. Het resultaat voor de eiwit G ssDNA bioconjugatiekarakterisering toonde een bijna één-op-één verhouding van eiwit G tot ssDNA waar het eiwit G Maleimide ssDNA en imidazoolelutiespectra van de orthogonale basis bufferen voor aanpassing aan het bioconjugatieproductspectrum.Native PAGE werd gebruikt om de bioconjugatie te bevestigen die de felgroene banden liet zien die samenvallen met de monomere eiwit G-band, wat wijst op succesvolle conjugatie en een goede opbrengst. Het TIRF-verlichtingsprofiel dat wordt geïntroduceerd vanuit een single-mode vezel is over het algemeen helderder in het midden van het gezichtsveld en dimmer rond de randen. Om de ongelijke verlichting te compenseren en de beelden af te vlakken voor kwantitatieve analyse, werd het verlichtingsprofiel bepaald door gemiddeld duizenden individuele frames.Afgevlakte beelden werden geproduceerd door de cameraruis af te trekken van zowel raw- als verlichtingsprofielen en vervolgens te normaliseren door het verlichtingsprofiel. Onbewerkte stiksels toonden duidelijke periodieke patronen die overeenkomen met de ongecorrigeerde afbeeldingen, terwijl hetzelfde gezichtsveld gestikt uit afgeplatte afbeeldingen een vlakke achtergrond produceerde. Een opvoerstroomprofiel werd gebruikt om het bereik van schuifspanning te bepalen, wat resulteerde in celrollen en vloeisporen opbrengen waaronder een typische eencellige adhesievoetafdruk kon worden gezien.Suboptimale en optimale resultaten van fluorescerende sporen met onvoldoende contrast, overmatige spoordichtheid, optimale spoordichtheid en contrast, en diffractie beperkt en DNA-PAINT beeldvorming worden getoond. incubatietijd van meer dan 60 minuten zorgt voor oppervlaktefunctionalisatie en een goede kamerconstructie voorkomt de passage van bellen die het gefunctionaliseerde oppervlak beschadigen. Deze procedure is van toepassing op kwantitatieve analyse van moleculaire kracht die betrokken is bij rollende adhesie en stelt onderzoekers in staat om het rollende gedrag van de verschillende celtypen te begrijpen.Deze techniek stelt onderzoekers in staat om nieuwe vragen te onderzoeken met betrekking tot snelle adhesiegebeurtenissen die leiden tot verdere vooruitgang van onderzoek naar één molecuul en mechanobiologie.

imaging-molecular-adhesion-in-cell-rolling-by-adhesion-footprint-assay

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Beschrijven we een protocol om te observeren en cel-rollen trajecten te analyseren op asymmetrische receptor-patroon substraten. De resulterende gegevens zijn nuttig voor de engineering van receptor-patroon substraten voor label-free cell scheiding en analyse.

Studeren Cell Rolling Trajecten op Asymmetrische Receptor Patterns

Een hechting frequentie test voor het meten van receptor-ligand interactie kinetiek wanneer beide moleculen zijn verankerd op het oppervlak van de interagerende cellen is beschreven. Deze mechanisch-gebaseerde test wordt geïllustreerd met behulp van een micropipet-druk menselijke rode bloedcel als adhesie sensor en integrine αLβ2 en intercellulaire adhesie molecuul-1 als interactie-receptoren en liganden.

Hechting Frequency Assay voor In Situ Kinetiek Analyse van de Cross-junctionele moleculaire interacties in de cel-cel-interface

Werkwijze voor de montage van lijm en oplosbaar gradiënten in een kamer microscopie voor levende celmigratie studies beschreven. De kunstmatige omgeving combineert aangroeiwerende oppervlakken en lijm tracks met oplossing hellingen en daarom maakt het mogelijk om te bepalen van het relatieve belang van begeleiding cues.

Het maken van lijm en Oplosbare verlopen for Imaging Cell Migration met fluorescentie microscopie

Deze studie gebruikte een multi-well plaat microfluïdische systeem aanzienlijk verhogen doorvoer cel rollen studies onder fysiologisch relevante schuifkracht. Gezien het belang van cel rollen in het multi-step cel homing cascade en het belang van cel homing na systemische toediening van exogene populaties van cellen bij patiënten, biedt dit systeem potentieel als een screening platform om celtherapie verbeteren.

Systematische analyse van In Vitro Cel Rolling Met behulp van een multi-well plaat Microfluidic System

Statische adhesietest is een krachtig instrument dat kan worden gebruikt om het model van interacties tussen T-lymfocyten en andere celtypes. Interacties worden gegenereerd door het injecteren gelabelde T-cellen in putjes bekleed met adhesiemoleculen, terwijl een plaatlezer wordt gebruikt om het aantal hechtende cellen te kwantificeren na seriële wasbeurten.

Statische Adhesie Assay voor de Studie van Integrine Activering in T-lymfocyten

Mechanische stijfheid in de tumor micro-omgeving speelt een cruciale rol in het besturen van kwaadaardige gedrag door het verhogen van invadopodia activiteit en actomyosine contractiliteit. Met polyacrylamidegels (PTA) kunnen invadopodia en trekkracht assays worden gebruikt om de invasieve en contractiele eigenschappen van kankercellen in reactie op stijfheid matrix.

Polyacrylamidegelen voor Invadopodia en Traction Force Testen op kankercellen

Deze stroom adhesietest een eenvoudige, high impact model van T-cel-epitheliale cel interacties. Een spuitpomp gebruikt om afschuifspanning te genereren en confocale microscopie neemt beelden voor kwantificering. Het doel van deze studies is om effectief te kwantificeren T-cel adhesie met behulp van stroom omstandigheden.

Assay van Adhesie Under Shear Stress voor de Studie van T-lymfocyten-Adhesie Molecule Interacties

Celoppervlak verklevingen staan ​​centraal in mechanotransductie, omdat ze mechanische spanning verzenden en inleiding van de signaalwegen die betrokken zijn in het weefsel homeostase en ontwikkeling. Hier presenteren we een protocol voor het ontleden van de biochemische routes die worden geactiveerd in reactie op de spanning, onder toepassing van ligand beklede magnetische microkralen en krachtuitoefening adhesie receptoren.

Het analyseren van de celoppervlakadhesie remodeling in reactie op mechanische spanning met behulp van Magnetic Beads

Dynamische wrijvingscoëfficiënt van immune cellen aan de vaatwand is een voorwaarde voor gut homing. Hier presenteren we een protocol voor een functionele in vitro assay voor de analyse van de impact van anti-integrine antilichamen, chemokines of andere factoren op de dynamische cel adhesie van menselijke cellen, met addressin beklede haarvaten.

Dynamische wrijvingscoëfficiënt Assay voor de functionele analyse van Anti-adhesie therapieën in ontstekingsdarmziekte

Een geavanceerde Microscoop waarmee snel en met hoge resolutie zal imaging van zowel de geïsoleerde plasmamembraan en de omliggende intracellulaire volume, worden gepresenteerd. De integratie van de draaiende schijf en de totale interne reflectie fluorescentie microscopie in één installatie kunt levende imaging experimenten bij hoge acquisitie tarieven tot 3.5 s per afbeeldingsstapel.

Visualiseren van hechting vorming in cellen door middel van geavanceerde draaiende schijf-totale interne reflectie fluorescentie microscopie

Het artikel beschrijft kwantificering van 1) de grootte en het aantal focale verklevingen en 2) celvormindex en de verdeling ervan van confocale beelden van de confluent monolagen van MCF7-cellen.

Kwantificering van celsubstraatadhesiegebied en celvormverdelingen in MCF7-celmonolagen

Leer de adhesievoetafdruktest voor beeldvorming van moleculaire adhesie in rollende cellen met TIRF-microscopie. Deze methode kwantificeert fysiologisch relevante adhesiekrachten op moleculair niveau.

Beeldvorming van moleculaire adhesie in celrollen door adhesievoetafdruktest

Meer video's verkennen