Name: Een op reporter gebaseerde cellulaire test voor het bewaken van splicing-efficiëntie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Leer een cellulaire reportertest voor het monitoren van splicing-efficiëntie met HeLa-cellen. Deze methode helpt onderzoekers ziektegerelateerde mutaties te bestuderen en therapeutische strategieën te ontwikkelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door fondsen aan S.S. van de National Institutes of Health (R21CA170786 en R01GM127464) en de American Cancer Society (de Institutional Research Grant 74-001-34-IRG) en aan S.S. en W.M. van het Valley Research Partnership Program (P1-4009 en VRP77). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

<ol><li>Zhuang, Y., Weiner, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compensatory+base+change+in+U1+snRNA+suppresses+a+5%27+splice+site+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A compensatory base change in U1 snRNA suppresses a 5' splice site mutation.</a> Cell. 46 (6), 827-835 (1986).</li>
<li>Scotti, M. M., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+mis-splicing+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA mis-splicing in disease.</a> Nature Review Genetics. 17 (1), 19-32 (2016).</li>
<li>Ward, A. J., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathobiology+of+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">The pathobiology of splicing.</a> Journal of Pathology. 220 (2), 152-163 (2010).</li>
<li>Scalet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-causing+variants+of+the+conserved+%2B2T+of+5%27+splice+sites+can+be+rescued+by+engineered+U1snRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutatation%22%5BJournal%5D)">Disease-causing variants of the conserved +2T of 5' splice sites can be rescued by engineered U1snRNAs.</a> Human Mutatation. 40 (1), 48-52 (2019).</li>
<li>Yamazaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+modified+U1+small+nuclear+RNA+for+rescue+from+exon+7+skipping+caused+by+5%27-splice+site+mutation+of+human+cathepsin+A+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Use of modified U1 small nuclear RNA for rescue from exon 7 skipping caused by 5'-splice site mutation of human cathepsin A gene.</a> Gene. 677, 41-48 (2018).</li>
<li>Yanaizu, M., Sakai, K., Tosaki, Y., Kino, Y., Satoh, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+nuclear+RNA-mediated+modulation+of+splicing+reveals+a+therapeutic+strategy+for+a+TREM2+mutation+and+its+post-transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Small nuclear RNA-mediated modulation of splicing reveals a therapeutic strategy for a TREM2 mutation and its post-transcriptional regulation.</a> Science Reports. 8 (1), 6937(2018).</li>
<li>Balestra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+mutations+impairing+CDKL5+expression+and+activity+can+be+efficiently+rescued+by+U1snRNA-based+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Splicing mutations impairing CDKL5 expression and activity can be efficiently rescued by U1snRNA-based therapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 20174130(2019).</li>
<li>Donadon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon-specific+U1+snRNAs+improve+ELP1+exon+20+definition+and+rescue+ELP1+protein+expression+in+a+familial+dysautonomia+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exon-specific U1 snRNAs improve ELP1 exon 20 definition and rescue ELP1 protein expression in a familial dysautonomia mouse model.</a> Human Molecular Genetics. 27 (14), 2466-2476 (2018).</li>
<li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), e2565(2010).</li>
<li>Summer, H., Gramer, R., Droge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denaturing+urea+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28Urea+PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE).</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1485(2009).</li>
<li>Dominski, Z., Kole, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+splice+sites+in+pre-mRNAs+with+short+internal+exons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Selection of splice sites in pre-mRNAs with short internal exons.</a> Molecular Cell Biology. 11 (12), 6075-6083 (1991).</li>
<li>Amir-Ahmady, B., Boutz, P. L., Markovtsov, V., Phillips, M. L., Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon+repression+by+polypyrimidine+tract+binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Exon repression by polypyrimidine tract binding protein.</a> RNA. 11 (5), 699-716 (2005).</li>
<li>Le Guedard-Mereuze, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+contexts+that+determine+the+pathogenicity+of+base+substitutions+at+position+%2B3+of+donor+splice-sites%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">Sequence contexts that determine the pathogenicity of base substitutions at position +3 of donor splice-sites.</a> Human Mutation. 30 (9), 1329-1339 (2009).</li>
<li>Sharma, S., Wongpalee, S. P., Vashisht, A., Wohlschlegel, J. A., Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-loop+4+of+U1+snRNA+is+essential+for+splicing+and+interacts+with+the+U2+snRNP-specific+SF3A1+protein+during+spliceosome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Stem-loop 4 of U1 snRNA is essential for splicing and interacts with the U2 snRNP-specific SF3A1 protein during spliceosome assembly.</a> Genes and Development. 28 (22), 2518-2531 (2014).</li>
<li>Steitz, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSteitz%2C+JA+%22Functions+of+the+abundant+U-snRNPs.+Structure+and+function+of+major+and+minor+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles%22">Functions of the abundant U-snRNPs. Structure and function of major and minor small nuclear ribonucleoprotein particles</a>. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. 115-154 (1988).</li>
<li>Fortes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+expression+of+specific+genes+in+mammalian+cells+with+5%27+end-mutated+U1+small+nuclear+RNAs+targeted+to+terminal+exons+of+pre-mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Inhibiting expression of specific genes in mammalian cells with 5' end-mutated U1 small nuclear RNAs targeted to terminal exons of pre-mRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 100 (14), 8264-8269 (2003).</li>
<li>Roca, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+recognition+of+5%27+splice+sites+by+noncanonical+base-pairing+to+U1+snRNA+involving+bulged+nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Widespread recognition of 5' splice sites by noncanonical base-pairing to U1 snRNA involving bulged nucleotides.</a> Genes and Development. 26 (10), 1098-1109 (2012).</li>
<li>Roca, X., Krainer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+atypical+5%27+splice+sites+by+shifted+base-pairing+to+U1+snRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Recognition of atypical 5' splice sites by shifted base-pairing to U1 snRNA.</a> Nature Structural Molecular Biology. 16 (2), 176-182 (2009).</li>
<li>Taladriz-Sender, A., Campbell, E., Burley, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splice-switching+small+molecules%3A+A+new+therapeutic+approach+to+modulate+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Splice-switching small molecules: A new therapeutic approach to modulate gene expression.</a> Methods. 167, 134-142 (2019).</li>
<li>Hamid, F. M., Makeyev, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+underlying+position-specific+regulation+of+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A mechanism underlying position-specific regulation of alternative splicing.</a> Nucleic Acids Research. 45 (21), 12455-12468 (2017).</li>
<li>Martelly, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+roles+for+human+U1+snRNA+stem-loops+in+pre-mRNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Synergistic roles for human U1 snRNA stem-loops in pre-mRNA splicing.</a> RNA Biology. , 1-18 (2021).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De test kan worden aangepast voor splicinganalyse in andere cellijnen dan HeLa, maar factoren die van invloed zijn op de transfectie-efficiëntie, zoals celconfluentie en hoeveelheid DNA, moeten mogelijk worden geoptimaliseerd. De reporter-U1-constructverhouding is een andere kritische parameter die mogelijk moet worden bepaald, afhankelijk van de expressieniveaus die in andere celtypen worden waargenomen. De kwaliteit van geëxtraheerd RNA is van cruciaal belang voor splicinganalyse; daarom wordt het gebruik van RNase-vri...

Pre-mRNA splicing is een essentiële verwerkingsstap die niet-coderende introns verwijdert en nauwkeurig coderende exonen bindt om volwassen mRNA te vormen. Herkenning van consensussequenties op exon-intron juncties, aangeduid als 5′-splice site en 3′-splice site, door componenten van de splicing machinerie initieert het splicing proces. Het U1 kleine nucleaire ribonucleoproteïne (snRNP) herkent de 5′-splice site door base paring van het U1 snRNA aan het pre-mRNA1. Genetisch overgeërfde mutaties die 5′-splice site sequences veranderen, zijn geassocieerd met vele ziekten2,3. Er wordt voorspeld dat het verlies van basepairing van U1-snRNA met de mutante 5′-splice-sites afwijkende splicing veroorzaakt, wat de vertaling van het aangetaste transcript in gevaar kan brengen. Een mogelijke therapeutische benadering om de splicingdefecten te corrigeren, omvat onderdrukking van mutaties door gemodificeerd U1-snRNA met compenserende nucleotideveranderingen in het 5′-gebied dat basepairs met de 5′-spliceplaats. Dergelijke gemodificeerde U1-snRNA's, ook wel exonspecifieke U1-snRNA's genoemd, zijn effectief gebleken bij het omkeren van splicingdefecten, wat resulteert in verhoogde eiwitexpressie van het geredde mRNA4,5,6,7,8.
Hier beschrijven we de U1 snRNP-complementatietest, een op reporter gebaseerde cellulaire splicing-assay die een beoordeling mogelijk maakt van het effect van 5′-ss-mutaties op splicing van een exon en ook kan worden gebruikt voor de ontwikkeling van gemodificeerde U1-snRNA's om de redding van exon-inclusie mogelijk te maken. We bieden ook protocollen voor het monitoren van de gesplitste reporter transcripties door primer extensie en RT-PCR, en voor het bepalen van de expressie van gemodificeerde U1 snRNA's door primer extensie en RT-qPCR.

<table><tbody><tr><td>Reagent Grade Deionized Water</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23-751628</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder packet</td><td>Gibco</td><td>12100-046</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS), Australian Source, Heat Inactivated</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-22</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (P/S)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide, Standard Solution 1.0N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2567-16A</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus, 36.5 to 38.0%</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>Disposable PES Bottle Top Filters</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FB12566510</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Disodium Salt Dihydrate</td><td>Amresco</td><td>0105-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>2.5% Trypsin (10x), no phenol red</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisher Bioreagent</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Fisher Bioreagent</td><td>BP366-1</td><td></td></tr><tr><td>Disodium Hydrogen Phosphate Heptahydrate</td><td>Fisher Bioreagent</td><td>BP332-1</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Dihydrogen Phosphate</td><td>Fisher Bioreagent</td><td>BP362-1</td><td></td></tr><tr><td>Transfection medium - Opti-MEM&trade; I Reduced Serum Medium, no phenol red</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Transfection Reagent - Lipofectamine&trade; 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol&trade; Reagent</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol, Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP2618-212</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen (5 mg/ml)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA Miniprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>R2052</td><td></td></tr><tr><td>ATP, [&gamma;-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Lead, 1 mCi</td><td>PerkinElmer</td><td>NEG035C001MC</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynucleotide Kinase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>Size exclusion beands - Sephadex&reg; G-25</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2580-10G</td><td></td></tr><tr><td>Size exclusion mini columns</td><td>USA Scientific</td><td>1415-0600</td><td></td></tr><tr><td>pBR322 DNA-MspI Digest</td><td>New England Biolabs</td><td>N3032S</td><td></td></tr><tr><td>Low Molecular Weight Marker, 10-100 nt</td><td>Affymetrix</td><td>76410 100 UL</td><td></td></tr><tr><td>Rnase inactivating reagents - RNaseZAP&trade;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2020-250ML</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix (10 mM ea)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18427013</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT&trade; Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>Reverse Transcriptase - M-MLV Reverse Transcriptase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28025013</td><td>used for primer extension</td></tr><tr><td>Taq DNA Polymerase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10342020</td><td></td></tr><tr><td>Random Hexamers (50 &micro;M)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N8080127</td><td></td></tr><tr><td>Real time PCR mix - SYBR&trade; Select Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4472903</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript&trade; III Reverse Transcriptase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080093</td><td>used for cDNA preparation</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080093</td><td></td></tr><tr><td>5X First-Strand Buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080093</td><td></td></tr><tr><td>Formamide (&ge;99.5%)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP228-100</td><td>Review Material Safety Data Sheets</td></tr><tr><td>Bromophenol Blue sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114405-5G</td><td></td></tr><tr><td>Xylene Cyanol FF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2650-17-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid (Crystalline/Electrophoresis)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP168-500</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:1 (40% Solution/Electrophoresis)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP1406-1</td><td>Review Material Safety Data Sheets</td></tr><tr><td>Urea (Colorless-to-White Crystals or Crystalline Powder/Mol. Biol.)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP169-212</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium peroxodisulphate (APS) &ge;98%, Pro-Pure, Proteomics Grade</td><td>VWR</td><td>M133-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-100ML</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) &ge;99%, Ultrapure</td><td>VWR</td><td>0761-25ML</td><td>Review Material Safety Data Sheets</td></tr><tr><td>Adjustable Slab Gel Systems, Expedeon</td><td>VWR</td><td>ASG-400</td><td></td></tr><tr><td>Vertical Gel Wrap&trade; Glass Plate Sets, 16.5 x 14.5cm</td><td>VWR</td><td>NGP-125NR</td><td></td></tr><tr><td>Vertical Gel Wrap&trade; Glass Plate Sets, 16.5 x 22.0cm</td><td>VWR</td><td>NGP-200NR</td><td></td></tr><tr><td>Vertical Gel Wrap&trade; Glass Plate Sets, 16.5 x 38.7cm</td><td>VWR</td><td>NGP-400NR</td><td></td></tr><tr><td>GE Storage Phosphor Screens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE28-9564</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon&trade; FLA 7000 Biomolecular Imager</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9610-73 AB</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter LS6500 Liquid Scintillation Counter</td><td>GMI</td><td>8043-30-1194</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR Systems</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

een op reporter gebaseerde cellulaire test voor het bewaken van splicing-efficiëntie

A Reporter Based Cellular Assay for Monitoring Splicing Efficiency

Tijdens genexpressie omvat de vitale stap van pre-mRNA-splicing nauwkeurige herkenning van spliceplaatsen en efficiënte assemblage van spliceosomale complexen om exonen te verenigen en introns te verwijderen voorafgaand aan cytoplasmatische export van het volwassen mRNA. De splicingefficiëntie kan worden gewijzigd door de aanwezigheid van mutaties op spliceplaatsen, de invloed van trans-acterende splicingfactoren of de activiteit van therapeutica. Hier beschrijven we het protocol voor een cellulaire assay die kan worden toegepast voor het bewaken van de splicing-efficiëntie van een bepaald exon. De test maakt gebruik van een aanpasbare plasmide gecodeerde 3-exon / 2-intron minigene reporter, die kan worden uitgedrukt in zoogdiercellen door voorbijgaande transfectie. Posttransfectie wordt totaal cellulair RNA geïsoleerd en de efficiëntie van exon splicing in het reporter mRNA wordt bepaald door primer extension of semi-kwantitatieve reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). We beschrijven hoe de impact van ziekte geassocieerde 5′ splice-site mutaties kan worden bepaald door ze in de reporter te introduceren; en hoe de onderdrukking van deze mutaties kan worden bereikt door co-transfectie met U1 klein nucleair RNA (snRNA) construct met compenserende mutaties in zijn 5 ′-regio die basepairs met de 5′-splice sites op exon-intron juncties in pre-mRNA's. Zo kan de reporter worden gebruikt voor het ontwerpen van therapeutische U1-deeltjes om de herkenning van mutante 5′splice-sites te verbeteren. Het invoegen van cis-acterende regulerende sites, zoals splicing enhancer of silencer sequences, in de reporter kan ook worden gebruikt om de rol van U1 snRNP in regulatie te onderzoeken, gemedieerd door een specifieke alternatieve splicingfactor. Ten slotte kunnen reporter-expressiecellen worden geïncubeerd met kleine moleculen om het effect van potentiële therapieën op constitutieve pre-mRNA-splicing of op exonen met mutante 5′-spliceplaatsen te bepalen. Over het algemeen kan de reporter-test worden toegepast om de splicing-efficiëntie in verschillende omstandigheden te controleren om fundamentele splicing-mechanismen en splicing-geassocieerde ziekten te bestuderen.

De splicing reporter Dup51, een drie exon-twee intron minigen, is afgeleid van het menselijke β-globine gen en is eerder beschreven (Figuur 1A)11,12 . We creëerden een mutante reporter, Dup51p, door ushersyndroom geassocieerde 5'-splice site mutaties te introduceren die voorkomen in exon 3 van het protocadherine 15 (PCDH15) gen13. De 5'-splice site sequence op de exon 2-intron 2 junctie werd veranderd...

Dit protocol beschrijft een minigene reporter assay om de impact van 5'-splice site mutaties op splicing te monitoren en ontwikkelt suppressor U1 snRNA voor de redding van mutatie-geïnduceerde splicing remming. De reporter en suppressor U1 snRNA constructen worden uitgedrukt in HeLa cellen, en splicing wordt geanalyseerd door primer extensie of RT-PCR.

Een op reporter gebaseerde cellulaire test voor het bewaken van splicing-efficiëntie

During gene expression, the vital step of pre-mRNA splicing involves accurate recognition of splice sites and efficient assembly of spliceosomal complexes ...

Dit protocol beschrijft een cellulaire assay voor het bewaken van splicing-efficiëntie, met behulp van een aanpasbare beherende verslaggever. Deze reporter Assay kan worden gebruikt om de effecten van ziekte geassocieerde mutaties in de Exxon of splice sites te bestuderen, en om therapie te ontwerpen, met name één deeltjes, om de herkenning van mutant tot vijf punts splice sites te verbeteren. De passage in Hela-cellen zuigt het gebruikte medium op en incubeert de cellen met drie milliliters van 0,2 5% trips in het bevatten van één millimolar EDTA, bij 37 graden Celsius gedurende drie minuten.Na incubatie bij zeven milliliter verse DMEM en breng de celsuspensie over naar een buis van 10 milliliter. Centrifugeer de cellen. Resuspend de celkorrel vervolgens in 10 milliliter verse DMEM en plaats de cellen op een nieuwe weefselkweekschaal met 20% confluentie, voor voorbijgaande transsfectie's.Tel de helacellen met een schone hemocytometerschuif en bereid een suspensie met een dichtheid van 2,5 keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter, zaai een milliliter van de celsuspensie in elke put van een 12-putplaat en incubeer 's nachts bij 37 graden Celsius. Zuig de volgende dag het gebruikte medium op en voeg 800 microliter verse DMEM met serum toe aan de plaat. Bereid de transfectiemengsels en vortex ze gedurende 15 seconden.Centrifugeer vervolgens de mengsels en incubeer ze gedurende vijf minuten op kamertemperatuur. Voeg na de incubatie alle 200 microliter van het transfectiemengsel toe aan één put van de 12 put hela-celplaat om een eindvolume van één milliliter per put te bereiken en incubeer de plaat bij 37 graden Celsius gedurende 48 uur. De voorbereide etiketteringsreacties zijn broedend.Resuspend de 25 kilo Dalton moleculair gewicht cutoff grootte uitsluiting kralen door zachte vortexing gedurende 10 seconden. Breng vervolgens 600 microliter van de geresuspendeerde kralen over naar een wegwerp minikolom, geplaatst in een opvangbuis van 1,5 milliliter, en breng de kralenvoorraad terug naar vier graden Celsius. Centrifugeer de kolom en gooi de stroom erdoorheen weg.Was de kralen vervolgens twee keer door 300 microliter RNA-vrij water aan de kolom toe te voegen. Breng na de tweede wasbeurt de minikolom over naar een nieuwe centrifugebuis van 1,5 milliliter en voeg de kinasereactiemix toe aan de kolom. Centrifugeer de kolom en vang de stroom op die de P32-gelabelde oligonucleotiden bevat.Voeg twee microgram RNA geëxtraheerd uit de helicellen toe aan microcentrifugebuizen van 200 microliter en voeg RNA-vrij water toe om het volume tot 6,55 microliter te maken. Voeg vervolgens 0,9 microliter een mastermix toe aan elke PCR-buis met de RNA-monsters en incubeer de buizen eerst bij 65 graden Celsius gedurende vijf minuten en vervolgens gedurende één minuut op ijs. Vervolgens op 2,55 microliter, een mastermix twee, naar elke buis met het RNA en mastermix één, en incubaleer de buizen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.Breng na de incubatie de buizen over naar een thermische cycler en incubeer eerst bij 50 graden Celsius gedurende 60 minuten en vervolgens bij 70 graden Celsius gedurende 15 minuten. Voeg na de incubatie 10 microliter 2X formamide RNA-ladende kleurstof toe aan elk monster en ga verder met het scheiden van de fragmenten per UIA-pagina. Percy DNA synthese.Voeg twee microgram RNA geëxtraheerd uit de getranscteerde hela-cellen toe aan microncentrifugebuizen van 200 microliter en voeg RNA-vrij water toe om het volume tot een lage 11 microliter te maken. Voeg vervolgens twee microliter toe, een mastermix één aan elk monster en incubeer eerst bij 65 graden Celsius gedurende vijf minuten en vervolgens een minuut op ijs. Voeg vervolgens zeven microliter toe, een mastermix twee aan elke buis en incubeer de buizen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten, gevolgd door incubatie bij 50 graden Celsius gedurende 60 minuten en 70 graden Celsius gedurende 15 minuten.Vervolgens verdunt PCR de C DNA-reactie om een concentratie van 100 nanogram per microliter op te leveren en breng één microliter van elk CDNA-monster over naar nieuwe PCR-buizen. Voeg 10,5 microliter van de mastermix toe aan elke buis die CDNA bevat en voer de PCR uit. Een thermocycler gebruiken Nadat de PCR is voltooid.Voeg 12,5 microliter 2X formamide DNA-ladingskleurstof toe aan elke buis. Verwarm de monsters gedurende vijf minuten op 95 graden Celsius en ga verder met het uitvoeren van een UIA-pagina. Pipetteer vijf microliter verdund CDNA in afzonderlijke putten van een 96-well qpcr plaat drievoud.Voeg vervolgens 10 microliter realtime PCR-mix toe aan elke put, sluit de platen af met een optische film en centrifugeer om de reacties op de bodem van de wells te verzamelen, voer vervolgens de qpcr uit terwijl de drempelwaardekwantificeringscycluswaarden van doelamplicon worden verzameld. Voordat u de markers en monsters laadt, spoelt u de putten uit met TBE-buffer om het bezonken ureum te verwijderen. Laad vervolgens 10 microliter van elk monster per put en laat de gel twee tot drie uur op 300 tot 500 volt lopen, of totdat het xyleen de bodem bereikt.Verwijder na de elektroforese de glasplaten van het elektroforeseapparaat en scheid de twee platen zorgvuldig zodat de gel plat op een van beide glazen oppervlakken ligt, breng de gel vervolgens over op een filterpapier en bedek het met een plasticfolie, met behulp van een geldroger vacuüm droog de gel op 80 graden Celsius gedurende 30 minuten, plaats de gedroogde gel vervolgens in een fosforbeeldcassette voor incubatie 's nachts bij kamertemperatuur. Uitgedrukt in hela-cellen drukt de slicing reporter dup 51 minnijean het volwassen transcript van volledige lengte uit waarin Exxon twee efficiënt wordt gesplitst. De vijf mutaties op de prime splice site en dup 51 P verminderen exxon twee inclusie van 95 naar 30%, wat leidt tot de vorming van een korter transcript.Co-expressie van dup 51 P met U15A SNRNA redt Exxon twee splicing en herstelt de vorming van het transcript over de volledige lengte. Daarentegen heeft co-expressie met wild type U1- of U15G-variant niet hetzelfde effect op dup 51P-splicing. Detectie van U15A-variant transcripten, door primaire extensie maakt gebruik van de U1 zeven tot 26 oligo nucleotide, dat is 20 nucleotiden lang en basenparen in de buurt van de adenine op de vijfde positie van U1 SNRNA.Alleen al in aanwezigheid van DATP maakt U1 zeven tot en met 26 het mogelijk om twee tot drie nucleotiden op te nemen voor het endogene wilde type U1 SNRNA dat een 22 of 23 nucleotide lang product oplevert. Voor U15A- en U15G-varianten eindigt de uitbreiding na het toevoegen van een enkele adenosine die een 21-nucleotideproduct produceert. Na normalisatie naar U2 SNRNA-expressie werden getransfecteerde U1 wild-type U1 5g- en U15A-varianten tot expressie gebracht met drie tot vijf vouwen over het endogene SNRNA.De kwaliteit van het geëxtraheerde RNA is van cruciaal belang voor splicinganalyse. Daarom wordt het gebruik van RNA-vrij water en decontaminatie van diensten met RNA's inactiverende middelen ten zeerste aanbevolen. Het hier beschreven rapportsysteem kan worden toegepast om de rol van U1 SN RNA's te bestuderen bij het splitsen van voorschriften voor het omkeren van het effect van flashprijssplitsingsmutaties voor gen-uitschakeling met behulp van modify U1SN RNA's.

a-reporter-based-cellular-assay-for-monitoring-splicing-efficiency

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Een protocol voor de voorbereiding van robuuste, kleinschalige HeLa nucleaire extracten wordt beschreven. Dit protocol is waardevol voor testen die het gebruik van kleine populaties van cellen, zoals cellen behandeld met medicijnen of RNAi vereisen. De methode moet voor diverse genexpressie assays en andere celtypes, die onder andere cellen.

Kleinschalige nucleaire extracten voor functionele testen van gen-expressie Machines

Het is aangetoond dat de regulatie van alternatieve splicing bijdraagt aan de epitheel-mesenchymale overgang (EMT), een essentieel cellulair programma in verschillende fysiologische en pathologische processen. Hier beschrijven we een methode die gebruikmaakt van een induceerbaar EMT-model voor de detectie van alternatieve splicing tijdens EMT.

Detectie van alternatieve splicing Tijdens-mesenchymale transitie

Tandem-splijsgebeurtenissen vinden plaats op plaatsen die minder dan 12 nucleotiden uit elkaar liggen. Het kwantificeren van verhoudingen van dergelijke splitsvarianten is haalbaar met behulp van een absolute kwantitatieve PCR-benadering. Dit manuscript beschrijft hoe splitsvarianten van het gen STAT3, waarbij twee splitsgebeurtenissen resulteren in Serine-701 inclusie/uitsluiting en α/β C-termini, kunnen worden gekwantificeerd.

Het samenvoegen van absolute en relatieve kwantitatieve PCR gegevens te kwantificeren STAT3 Splice Variant Afschriften

Hier beschrijven we een protocol gericht op onderzoek naar de gevolgen van afwijkende splicing op resistentie in solide tumoren en hematologische maligniteiten. Om dit doel te bereiken, analyseerden we het transcriptoom profielen van de ouders en bestand in vitro modellen door middel van RNA-seq en vestigde een qRT-PCR-methode om kandidaatgenen te valideren.

Met behulp van RNA-sequencing te detecteren Novel Splice varianten Gerelateerd aan Drug Resistance in<em&gt; In Vitro</em&gt; Cancer Models

Een in situ hybridisatie (ISH) protocol dat gebruikmaakt van korte antisense oligonucleotides voor alternatieve pre-mRNA-splicing patronen kunt ontdekken in muis hersenen secties wordt beschreven.

Kwantitatieve analyse van alternatieve Pre-mRNA-Splicing in muis hersenen secties met behulp van RNA In Situ hybridisatie Assay

SINEUPs zijn synthetische antisense niet-coderende RNAs, die bevatten een bindend domein (BD) en een effector domein (ED) en up-reguleren vertaling van mRNA richten. Hier beschrijven we detectiemethoden voor SINEUPs in gekweekte cellijnen, analyse van hun vertaling-bevordering van activiteiten door Western-blot en een semi-automatische hoge doorvoer imaging systeem.

Cel gebaseerde analyses van SINEUP niet-coderende RNAs die specifiek mRNA vertaling kunnen verbeteren

Dit protocol biedt een snel en nuttig hulpmiddel voor het evalueren van de rol van een eiwit met een niet-gekarakteriseerde functie in alternatieve splicing-regulatie na chemotherapeutische behandeling.

De E1A Minigene Tool gebruiken om mRNA-splicingwijzigingen te bestuderen

De ACT1-CUP1-test, een kopergroeitest, biedt een snelle uitlezing van precursor messenger RNA (pre-mRNA) splicing en de impact die mutante splicingfactoren hebben op de spliceosomale functie. Deze studie biedt een protocol en benadrukt het maatwerk dat mogelijk is om de splicingvraag van belang aan te pakken.

ACT1-CUP1-testen bepalen de substraatspecifieke gevoeligheden van spliceosomale mutanten in ontluikende gist

We ontwikkelden een intronische microRNA-biogenese-reportertest voor gebruik in cellen in vitro met vier plasmiden: één met intronisch miRNA, één met het doelwit, één om een regulerend eiwit te overexpresseren en één voor Renilla luciferase. Het miRNA werd verwerkt en kon de expressie van luciferase controleren door zich aan de doelsequentie te binden.

Een Reporter Assay om intronische microRNA-rijping in zoogdiercellen te analyseren

We presenteren protocollen voor de beoordeling van de vaardigheid van de dubbelstrengsbreukherstelroute in cellen met behulp van een reeks op luminescentie gebaseerde extrachromosomale reportersubstraten.

Beoordeling van de reparatieactiviteit van DNA-dubbelstrengsbreuken met behulp van high-throughput en kwantitatieve luminescentie-gebaseerde reporter-assays

Leer een cellulaire reportertest voor het monitoren van splicing-efficiëntie met HeLa-cellen. Deze methode helpt onderzoekers ziektegerelateerde mutaties te bestuderen en therapeutische strategieën te ontwikkelen.

Een op reporter gebaseerde cellulaire test voor het bewaken van splicing-efficiëntie

Meer video's verkennen