Name: Het detecteren van virus- en speekseleiwitten van een leafhoppervector in de plantengastheer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Leer een methode om speekseleiwitten en virale eiwitten van cicaden te detecteren in rijstplanten. Dit protocol maakt gebruik van Western blotting en SDS-PAGE om eiwitinteracties te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (31772124 en 31972239) en Fujian Agriculture and Forestry University (Grant KSYLX014).

De niet-virulifere volwassen leafhoppers werden verspreid in het Vector-borne Virus Research Center in Fujian Agriculture and Forestry University, China.
1. Niet-virulifere insectenkweek
<ol><li>Voed de volwassenen op rijstzaailingen op in een kubuskooi van 40 cm x 35 cm x 20 cm (lengte x breedte x hoogte). Houd één kant van de kooi bedekt met een insectenbestendig net voor ventilatie.<ol><li>Bewaar de kooien met leafhoppers in een incubator met een ingebouwde vochtigheidsregelaar op 26 °C met een relatieve vochtigheid van 60-75% onder een fotoperiode van 16 uur licht en 8 uur donker.</li>
	</ol></li>
	<li>Gebruik een aspirator om alle volwassenen voorzichtig uit hun kooi over te brengen naar een nieuwe kooi die elke week verse rijstzaailingen bevat.<ol><li>Laat meer dan 200 volwassenen paren en eieren leggen in de rijst.</li>
		<li>Bewaar de oude rijstzaailingen voor de nimfen om tevoorschijn te komen. Breng deze nieuwe niet-virulifere nimfen terug naar het 2-instar-stadium.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Virusverwerving en het verzamelen van virulifere insecten
<ol><li>Breng de 2-instar niet-virulifere nimfen voorzichtig over in een glazen kweekbuis (2,5 cm in diameter bij 15 cm hoog) gedurende 1-2 uur voor uithongering met behulp van de aspirator.<ol><li>Laat de nimfen los in een kooi met een RDV-geïnfecteerde rijstplant die in een pot is gekweekt.</li>
		<li>Laat de nimfen zich 2 dagen voeden met de geïnfecteerde rijstplant. OPMERKING: Geef de rijstplant voorzichtig water en vermijd het wegwassen van de nimfen. De 2-instar nimfen zijn ongeveer 1,6-2 mm lang.</li>
	</ol></li>
	<li>Breng deze nimfen voorzichtig over naar een nieuwe kooi met verse virusvrije rijstzaailingen met een relatieve luchtvochtigheid van 60-75% onder een fotoperiode van 16 uur licht en 8 uur donker. Laat de nimfen zich gedurende 12 dagen voeden met de geïnfecteerde rijstplant om de circulerende overdrachtsperiode van RDV te voltooien.</li>
</ol>3. Verzameling van speekseleiwitten met behulp van een voederkooi
<ol><li>Bereid vijf kleine pijpachtige voerkooien voor (2,5 cm in diameter bij 4 cm hoog) waarin het ene uiteinde is bedekt met insectenbestendig gaas.</li>
	<li>Beperk 15-20 leafhoppers in elke voerkooi en bedek vervolgens het andere uiteinde van de kooi met een dunne schuimmat.<ol><li>Bevestig een rijstzaailing (5-6 cm hoog) tussen het einde van de kooi en een schuimmat met tapes. Zorg ervoor dat de leafhoppers in de voederkooi zich kunnen voeden met de rijstzaailingen die zijn blootgesteld aan de binnenkant van de kooi.</li>
	</ol></li>
	<li>Dompel de zaailingwortels onder in water zodat de rijstplant in leven blijft. Laat de leafhoppers zich er 2 dagen mee voeden.</li>
	<li>Haal de leafhoppers uit hun voederkooien en verzamel de rijstzaailingen waarmee ze zich hebben gevoed. Knip de delen van zaailingen buiten de kooi en herstel de voedingsgebieden van zaailingen. OPMERKING: Dit monster kan maximaal 3 maanden bij -80 °C worden bewaard, als het niet onmiddellijk wordt gebruikt voor detectie.</li>
</ol>4. Reagensbereiding
<ol><li>Los 15,1 g Tris-base, 94 g glycine en 5 g SDS op in 1 L steriel water om 5xTris-glycinebuffer te bereiden. Verdun 200 ml 5xTris-glycinebuffer met 800 ml steriel water om 1xTris-glycinebuffer te bereiden (zie tabel 1 voor buffersamenstelling).</li>
	<li>Los 80 g NaCl, 30 g Tris-base en 2 g KCl op in 1 L steriel water om een 10xTris-gebufferde zoutoplossing (TBS) buffer te bereiden. Autoclaaf de oplossing bij 121 °C gedurende 15 min.</li>
	<li>Los 8 g SDS, 4 ml ß-mercaptoethanol, 0,02 g broomfenolblauw en 40 ml glycerol op in 40 ml 0,1 M Tris-HCl (pH 6,8) om 4x eiwitmonsterbuffer te bereiden.</li>
	<li>Meng 800 ml Tris-glycinebuffer met 200 ml methanol om de transferbuffer voor te bereiden.</li>
	<li>Voeg 100 ml 10xTBS-oplossing en 3 ml Tween 20 tot 900 ml steriel water toe om de TBS-buffer met Tween 20 (TBST)-oplossing voor te bereiden.</li>
</ol>5. Western blotting om het speeksel en virale eiwitten te detecteren
<ol><li>Maal 0,1 g van de rijstmonsters met vloeibare stikstof totdat het weefsel een poeder wordt. Voeg 200 μL 4x eiwitmonsterbuffer toe aan het monster en kook het gedurende 10 minuten. Centrifugeer de monsters op 12.000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.<ol><li>Verwijder het supernatant en plaats het in een nieuwe injectieflacon. Laad 10 μL van het monster in een SDS-PAGE-gel en voer het gedurende 45-60 minuten in Tris-glycinebuffer op 150 V uit. OPMERKING: Het residu na centrifugeren kan worden weggegooid.</li>
	</ol></li>
	<li>Doe een nitrocellulosemembraan van 0,45 μm en andere sandwichbenodigdheden gedurende 30 minuten in de transferbuffer. OPMERKING: Deze stap kan worden uitgevoerd voordat de gel zijn run heeft voltooid.</li>
	<li>Sandwich de gel en breng het gedurende 90-120 minuten over op 100 V in de transferbuffer.</li>
	<li>Neem het membraan en plaats het gedurende 20 minuten in een vetvrije droge melkblokkeringsoplossing in TBST-oplossing. Voeg het specifieke antilichaam tegen RDV P8 of Vg toe aan een 7% oplossing van vetvrije droge melk in TBST. Incubeer met het antilichaam voor het kleuren van het membraan gedurende 2 uur of 's nachts.</li>
	<li>Was het membraan drie keer met TBST-oplossing, met telkens 5 minuten wassen.</li>
	<li>Voeg de geit anti-konijn IgG als secundair antilichaam toe aan 7% vetvrije droge melk met TBST. Incubeer met het antilichaam gedurende 60-90 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Was het membraan met TBST-oplossing driemaal gedurende 5 minuten per keer.</li>
	<li>Gebruik de ECL Western kit voor de chemiluminescente methode. Mix detectiereagentia 1 en 2 in de kit in een verhouding van 1:1 in een buis. Breng het gemengde reagens op het membraan en incubeer de vlek gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Giet het overtollige reagens af en maak een colorimetrische foto van de chemiluminescente foto. Combineer ze om de ladder met eiwitbanden te zien.</li>
</ol>

<ol><li>Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li>
<li>Cranston, P. S., Gullan, P. J. Phylogeny of insects. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCranston%2C+PS+%22Encyclopedia+of+Insects%22">Encyclopedia of Insects</a>. Resh, V. H., Carde, R. T. , Academic. Amsterdam. (2003).</li>
<li>Ammar el, D., Tsai, C. W., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+aspects+of+rhabdovirus+interactions+with+insect+and+plant+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular aspects of rhabdovirus interactions with insect and plant hosts.</a> Annual Review of Entomology. 54, 447-468 (2009).</li>
<li>Wei, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rice+reoviruses+in+insect+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Rice reoviruses in insect vectors.</a> Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).</li>
<li>Hattori, M., Konishi, H., Tamura, Y., Konno, K., Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laccase-type+phenoloxidase+in+salivary+glands+and+watery+saliva+of+the+green+rice+leafhopper%2C+Nephotettix+cincticeps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Laccase-type phenoloxidase in salivary glands and watery saliva of the green rice leafhopper, Nephotettix cincticeps.</a> Journal of Insect Physiology. 51 (12), 1359-1365 (2005).</li>
<li>Ma, R., Reese, J. C., William, I. V., Bramel-Cox, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+pectinesterase+and+polygalacturonase+from+salivary+secretions+of+living+greenbugs%2C+schizaphis+graminum+%28Homoptera%3A+aphididae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Detection of pectinesterase and polygalacturonase from salivary secretions of living greenbugs, schizaphis graminum (Homoptera: aphididae).</a> Journal of Insect Physiology. 36 (7), 507-512 (1990).</li>
<li>Miles, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+aspects+of+the+chemical+relation+between+the+rose+aphid+and+rose+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Entomologia+Experimentalis+et+Applicata%22%5BJournal%5D)">Dynamic aspects of the chemical relation between the rose aphid and rose buds.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 37 (2), 129-135 (2011).</li>
<li>Urbanska, A., Tjallingii, W. F., Dixon, A., Leszczynski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenol+oxidising+enzymes+in+the+grain+aphid%27s+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Entomologia+Experimentalis+et+Applicata%22%5BJournal%5D)">Phenol oxidising enzymes in the grain aphid's saliva.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (2), 197-203 (1998).</li>
<li>Miles, P. W., Peng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+salivary+physiology+of+plant+bugs%3A+detoxification+of+phytochemicals+by+the+salivary+peroxidase+of+aphids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Studies on the salivary physiology of plant bugs: detoxification of phytochemicals by the salivary peroxidase of aphids.</a> Journal of Insect Physiology. 35 (11), 865-872 (1989).</li>
<li>Will, T., van Bel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+chemical+interactions+between+aphids+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Physical and chemical interactions between aphids and plants.</a> Journal of Experimental Botany. 57 (4), 729-737 (2006).</li>
<li>Ma, R. Z., Reese, J. C., Black, W. C., Bramel-Cox, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorophyll+loss+in+a+greenbug-susceptible+sorghum+due+to+pectinases+and+pectin+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Kansas+Entomological+Society%22%5BJournal%5D)">Chlorophyll loss in a greenbug-susceptible sorghum due to pectinases and pectin fragments.</a> Journal of the Kansas Entomological Society. 71 (1), 51-60 (1998).</li>
<li>Madhusudhan, V. V., Miles, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobility+of+salivary+components+as+a+possible+reason+for+differences+in+the+responses+of+alfalfa+to+the+spotted+alfalfa+aphid+and+pea+aphid%5BTitle%5D)+AND+%22Entomologia+Experimentalis+et+Applicata%22%5BJournal%5D)">Mobility of salivary components as a possible reason for differences in the responses of alfalfa to the spotted alfalfa aphid and pea aphid.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (1), 25-39 (1998).</li>
<li>Funk, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaline+phosphatase+activity+in+whitefly+salivary+glands+and+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Insect+Biochemistry+%26+Physiology%22%5BJournal%5D)">Alkaline phosphatase activity in whitefly salivary glands and saliva.</a> Archives of Insect Biochemistry & Physiology. 46 (4), 165-174 (2010).</li>
<li>Hogenhout, S. A., Bos, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector+proteins+that+modulate+plant-insect+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Effector proteins that modulate plant-insect interactions.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).</li>
<li>Tomkins, M., Kliot, A., Maree, A. F., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multi-layered+mechanistic+modelling+approach+to+understand+how+effector+genes+extend+beyond+phytoplasma+to+modulate+plant+hosts%2C+insect+vectors+and+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">A multi-layered mechanistic modelling approach to understand how effector genes extend beyond phytoplasma to modulate plant hosts, insect vectors and the environment.</a> Current Opinion in Plant Biology. 44, 39-48 (2018).</li>
<li>Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+transcriptomic%2Fproteomic+analysis+of+salivary+gland+and+secreted+saliva+in+three+planthopper+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species.</a> Journal of Proteomics. , (2018).</li>
<li>Hogenhout, S. A., Bos, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector+proteins+that+modulate+plant--insect+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Effector proteins that modulate plant--insect interactions.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).</li>
<li>Sun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mosquito+salivary+protein+promotes+flavivirus+transmission+by+activation+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A mosquito salivary protein promotes flavivirus transmission by activation of autophagy.</a> Nature Communications. 11 (1), 260(2020).</li>
<li>Sri-In, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+salivary+protein+of+Aedes+aegypti+promotes+dengue-2+virus+replication+and+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A salivary protein of Aedes aegypti promotes dengue-2 virus replication and transmission.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 111, 103181(2019).</li>
<li>Conway, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aedes+aegypti+D7+saliva+protein+inhibits+dengue+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Aedes aegypti D7 saliva protein inhibits dengue virus infection.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 10 (9), 0004941(2016).</li>
<li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whitefly+effector+Bsp9+targets+host+immunity+regulator+WRKY33+to+promote+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">A whitefly effector Bsp9 targets host immunity regulator WRKY33 to promote performance.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374 (1767), 20180313(2019).</li>
<li>Omura, T., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+outer+capsid+proteins+in+transmission+of+phytoreovirus+by+insect+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Role of outer capsid proteins in transmission of phytoreovirus by insect vectors.</a> Advances in Virus Research. 54, 15-43 (1999).</li>
<li>Chen, Q., Liu, Y., Long, Z., Yang, H., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+release+threshold+in+the+salivary+gland+of+leafhopper+vector+mediates+the+intermittent+transmission+of+rice+dwarf+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Viral release threshold in the salivary gland of leafhopper vector mediates the intermittent transmission of rice dwarf virus.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 639445(2021).</li>
<li>Fukushi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+studies+on+the+dwarf+disease+of+rice+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Faculty+of+Agriculture%2C+Hokkaido+Imperial+University%22%5BJournal%5D)">Further studies on the dwarf disease of rice plant.</a> Journal of the Faculty of Agriculture, Hokkaido Imperial University. 45 (3), 83-154 (1940).</li>
<li>Miyazaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+organization+of+the+internal+components+of+rice+dwarf+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The functional organization of the internal components of rice dwarf virus.</a> Journal of Biochemistry. 147, 843-850 (2010).</li>
<li>Wei, T., Shimizu, T., Hagiwara, K., Kikuchi, A., Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pns12+protein+of+rice+dwarf+virus+is+essential+for+formation+of+viroplasms+and+nucleation+of+viral-assembly+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Pns12 protein of rice dwarf virus is essential for formation of viroplasms and nucleation of viral-assembly complexes.</a> Journal of General Virology. 87, 429-438 (2006).</li>
<li>Chen, Q., Zhang, L., Chen, H., Xie, L., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonstructural+protein+Pns4+of+rice+dwarf+virus+is+essential+for+viral+infection+in+its+insect+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">Nonstructural protein Pns4 of rice dwarf virus is essential for viral infection in its insect vector.</a> Virology Journal. 12, 211(2015).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonstructural+protein+Pns12+of+rice+dwarf+virus+is+a+principal+regulator+for+viral+replication+and+infection+in+its+insect+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Nonstructural protein Pns12 of rice dwarf virus is a principal regulator for viral replication and infection in its insect vector.</a> Virus Research. 210, 54-61 (2015).</li>
<li>Chen, Q., Zhang, L., Zhang, Y., Mao, Q., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubules+of+plant+reoviruses+exploit+tropomodulin+to+regulate+actin-based+tubule+motility+in+insect+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Tubules of plant reoviruses exploit tropomodulin to regulate actin-based tubule motility in insect vector.</a> Scientific Reports. 7, 38563(2017).</li>
<li>Wei, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spread+of+Rice+dwarf+virus+among+cells+of+its+insect+vector+exploits+virus-induced+tubular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The spread of Rice dwarf virus among cells of its insect vector exploits virus-induced tubular structures.</a> Journal of Virology. 80 (17), 8593-8602 (2006).</li>
<li>Mao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+bacterial+symbiont-mediated+vitellogenin+uptake+into+oocytes+to+support+egg+development%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Insect bacterial symbiont-mediated vitellogenin uptake into oocytes to support egg development.</a> mBio. 11 (6), 01142(2020).</li>
<li>Tufail, M., Takeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characteristics+of+insect+vitellogenins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular characteristics of insect vitellogenins.</a> Journal of Insect Physiology. 54 (12), 1447-1458 (2008).</li>
<li>Sappington, T. W., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characteristics+of+insect+vitellogenins+and+vitellogenin+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular characteristics of insect vitellogenins and vitellogenin receptors.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 28 (5-6), 277-300 (1998).</li>
<li>Ji, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitellogenin+from+planthopper+oral+secretion+acts+as+a+novel+effector+to+impair+plant+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Vitellogenin from planthopper oral secretion acts as a novel effector to impair plant defenses.</a> New Phytologist. , (2021).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het speeksel dat direct wordt uitgescheiden door de speekselklieren van de piercing-zuigende insecten speelt een cruciale rol omdat het de weefsels van de gastheer en de cross-kingdom biologische factoren van de gastheer voorverteert en ontgift in de gastheren 1,3,4. De cross-kingdom biologische factoren, waaronder elicitors, effectoren en klein RNA, zijn van cruciaal belang voor de communicatie tussen insecten en gastheer<sup c...

De vector-host transmissiemodus van arbovirussen, een fundamenteel probleem, bevindt zich op de grens van de biologische wetenschap. Veel plantenvirussen van agrarisch belang worden horizontaal overgedragen door insectenvectoren1. Meer dan de helft van de plantenvirussen wordt overgebracht door hemipteran-insecten, waaronder bladluizen, witte vliegen, leafhoppers, planthoppers en trips. Deze insecten hebben verschillende kenmerken die hen in staat stellen om plantenvirussen efficiënt over te brengen1. Ze bezitten piercing-zuigende monddelen en voeden zich met het sap van floëem en xyleem, en scheiden hun speekselaf 1,2,3,4. Met de ontwikkeling en verbetering van technieken worden de identificatie en functionele analyses van speekselcomponenten een nieuwe focus van intensief onderzoek. De bekende speekseleiwitten in speeksel omvatten tal van enzymen, zoals pectinesterase, cellulase, peroxidase, alkalische fosfatase, polyfenoloxidase en sucrase, onder andere 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . De eiwitten in speeksel omvatten ook elicitoren die de afweerreactie van de gastheer activeren, waardoor de prestaties van insecten veranderen, en effectoren die de afweer van de gastheer onderdrukken, wat de fitheid van insecten verbetert en componenten die pathologische reacties van de gastheer induceren14,15,16,17. Daarom zijn speekseleiwitten vitale materialen voor communicatie tussen insecten en gastheren. Tijdens de overdracht van virussen bevat het speeksel dat wordt afgescheiden door de speekselklieren van piercing-zuigende virulifere insecten ook virale eiwitten. Virale componenten gebruiken de stroom van speeksel om ze vrij te geven van het insect naar de gastheer van de plant. Daarom overbrugt het insectenspeeksel de virus-vector-gastheer tritrofe interactie. Het onderzoeken van de biologische functie van speekseleiwitten die worden uitgescheiden door virulifere insecten helpt om de relatie van virus-vector-gastheer te begrijpen.
Voor dierlijke virussen wordt gemeld dat het speeksel van muggen de overdracht en pathogeniciteit van westnijlvirus (WNV) en denguevirus (DENV) bemiddelt. Het speekseleiwit AaSG34 bevordert de replicatie en overdracht van het dengue-2-virus, terwijl het speekseleiwit AaVA-1 de overdracht van DENV- en Zika-virus (ZIKV) bevordert door autofagie18,19 te activeren. Het speekseleiwit D7 van muggen kan DENV-infectie in vitro en in vivo remmen via directe interactie met de DENV-virionen en recombinant DENV-enveloppe-eiwit20. In plantenvirussen induceert het begomovirus tomaat geelbladkrulvirus (TYLCV) het wittevliegspeekseleiwit Bsp9, dat de WRKY33-gemedieerde immuniteit van de plantengastheer onderdrukt, om de voorkeur en prestaties van witte vliegen te verhogen, waardoor uiteindelijk de overdracht van virussen21 toeneemt. Omdat studies naar de rol die speekseleiwitten van insecten spelen in plantengastheren zijn achtergebleven bij die van dierlijke gastheren, is een stabiel en betrouwbaar systeem om de speekseleiwitten in plantengastheren te detecteren dringend nodig.
Het plantenvirus dat bekend staat als rijstdwergvirus (RDV) wordt overgedragen door de leafhopper Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) met een hoge efficiëntie en op een aanhoudend vermeerderende manier22,23. RDV werd voor het eerst gemeld als overgedragen door een insectenvector en veroorzaakt een ernstige ziekte van rijst in Azië24,25. Het virion is icosaëdrisch en dubbellaags bolvormig en de buitenste laag bevat het P8 buitenste capsid-eiwit22. De circulatieve transmissieperiode van RDV in N. cincticeps is 14 dagen 26,27,28,29,30. Wanneer de RDV bij speekselklieren aankomt, worden virionen vrijgegeven in speeksel-opgeslagen holtes in de speekselklieren via een exocytose-achtig mechanisme23. De vitellogenine (Vg) is de voorloper van het dooiereiwit die essentieel is voor de ontwikkeling van eicellen bij vrouwelijke insecten31,32,33. De meeste insectensoorten hebben ten minste één Vg-transcript van 6-7 kb, dat codeert voor een voorlopereiwit van ongeveer 220 kDa. De eiwitvoorlopers van Vg kunnen meestal worden gesplitst in grote (140 tot 190 kDa) en kleine (<50 kDa) fragmenten voordat ze de eierstok18,19 binnendringen. Eerdere proteomische analyse onthulde de aanwezigheid van de peptiden afgeleid van Vg in het uitgescheiden speeksel van de leafhopper Recilia dorsalis, hoewel hun functie onbekend is (ongepubliceerde gegevens). Onlangs is gemeld dat Vg, dat oraal wordt uitgescheiden door planthoppers, functioneert als een effector om de afweer van planten te beschadigen34. Het is onbekend of de Vg van N. cincticeps ook met speekselstroom aan de plantengastheer kan worden vrijgegeven en vervolgens een rol in de plant kan spelen om de afweer van de plant te verstoren. Om aan te pakken of N. cincticeps speekseleiwitten, zoals Vg, gebruikt om de afweer van planten te remmen of te activeren, is de eerste stap het identificeren van eiwitten die tijdens het voeden aan de plant worden vrijgegeven. Het begrijpen van de methode om de speekseleiwitten in de plant te identificeren is mogelijk essentieel om de functie van speekseleiwitten en de interacties tussen Hemiptera en planten te verklaren.
In het hier gepresenteerde protocol wordt N. cincticeps als voorbeeld gebruikt om een methode te bieden om de aanwezigheid van speekseleiwitten in de plantengastheer te onderzoeken die door insectenvoeding worden geïntroduceerd. Het protocol beschrijft voornamelijk de verzameling en detectie van speekseleiwitten en is nuttig voor verder onderzoek op de meeste hemipterans.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Roche</td><td>D609K69032</td><td>Voor de bereiding van 5&times;Tris-glycine buffer en 10&times;TBS buffer</td></tr><tr><td>glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WXBD0677V</td><td>Voor de bereiding van 5&times;Tris-glycine buffer</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLCB4394</td><td>Voor de bereiding van 5&times;Tris-glycine buffer</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10019318</td><td>Voor de bereiding van 10&times;TBS buffer</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10016318</td><td>Voor de bereiding van 10&times;TBS buffer</td></tr><tr><td>&szlig;-mercaptoethanol</td><td>Xiya Reagent</td><td>B14492</td><td>Voor de bereiding van 4&times; proteïne monster buffer</td></tr><tr><td>bromofenolblauw</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SHBL3668</td><td>Voor de bereiding van 4&times; proteïne monster buffer</td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10010618</td><td>Voor de bereiding van 4&times; proteïne monster buffer</td></tr><tr><td>methanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10014118</td><td>Voor de bereiding van transfer buffer</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Coolaber SCIENCE&amp;TeCHNoLoGY</td><td>CT30111220</td><td>Voor de bereiding van TBST</td></tr><tr><td>non-fat dry milk</td><td>Becton.Dickinso and company</td><td>252038</td><td>Voor membraan blokkering, antilichamen verdunning</td></tr><tr><td>goat anti-rabbit IgG</td><td>Sangon Biotech</td><td>D110058-0001</td><td>Herkenning van de primaire antilichamen</td></tr><tr><td>ECL Western kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>32209</td><td>Chemiluminescerende substraat</td></tr><tr><td>nitrocellulose membraan</td><td>Pall Corporation</td><td>25312915</td><td>Voor proteïne transfer</td></tr><tr><td>Buffers en oplossingen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffer</td><td>Samenstelling</td><td></td><td>Opmerkingen/Beschrijving</td></tr><tr><td>&nbsp;5&times;Tris-glycine buffer</td><td>15.1 g Tris base 94 g glycine &nbsp;5 g SDS in 1 L steriele water</td><td></td><td>&nbsp;Stock oplossing</td></tr><tr><td>1&times;Tris-glycine buffer</td><td>200 mL van 5&times;Tris-glycine buffer 800 mL steriele water</td><td></td><td>Werk oplossing, voor SDS-PAGE</td></tr><tr><td>10&times;Tris-buffered saline (TBS) buffer</td><td>80 g NaCl 30 g Tris base 2 g KCl in 1 L steriele water</td><td></td><td>Stock oplossing</td></tr><tr><td>TBS met Tween 20 (TBST) oplossing</td><td>100 mL 10&times;TBS oplossing 3 mL Tween 20 900 mL steriele water</td><td></td><td>Werk oplossing</td></tr><tr><td>4&times; proteïne monster buffer</td><td>8 g SDS 4 mL &szlig;-mercaptoethanol 0.02 g bromofenolblauw 40 mL glycerol in 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8)</td><td></td><td>Voor proteïne extractie</td></tr><tr><td>Transfer buffer</td><td>800 mL Tris-glycine buffer 200 mL methanol</td><td></td><td>Voor proteïne transfer</td></tr><tr><td>Instrumenten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bromofenolblauw</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SHBL3668</td><td>Voor de bereiding van 4x proteïne monster buffer</td></tr><tr><td>Constante temperatuur incubator</td><td>Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd.</td><td>PRX-1200B</td><td>Voor het fokken van leafhoppers</td></tr><tr><td>Elektroforese</td><td>Tanon Science &amp; Technology Co.,Ltd.</td><td>Tanon EP300</td><td>Voor SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Elektroforese overdracht kern module</td><td>BIO-RAD</td><td>1703935</td><td>Voor SDS-PAGE</td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10010618</td><td>Voor de bereiding van 4x proteïne monster buffer</td></tr><tr><td>glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WXBD0677V</td><td>Voor de bereiding van 5x Tris-glycine buffer</td></tr><tr><td>goat anti-rabbit IgG</td><td>Sangon Biotech</td><td>D110058-0001</td><td>Herkenning van de primaire antilichamen</td></tr><tr><td>High-pass weefsel maal instrument</td><td>Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.</td><td>JXFSIPRP-24</td><td>Voor het malen van plantweefsels</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10016318</td><td>Voor de bereiding van 10x TBS buffer</td></tr><tr><td>methanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10014118</td><td>Voor de bereiding van transfer buffer</td></tr><tr><td>Mini natte warmte overdracht goot</td><td>BIO-RAD</td><td>1703930</td><td>Voor SDS-PAGE</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10019318</td><td>Voor de bereiding van 10x TBS buffer</td></tr><tr><td>nitrocellulose membraan</td><td>Pall Corporation</td><td>25312915</td><td>Voor proteïne transfer</td></tr><tr><td>non-fat dry milk</td><td>Becton.Dickinso and company</td><td>252038</td><td>Voor membraan blokkering, antilichamen verdunning</td></tr><tr><td>Pierce ECL Western kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>32209</td><td>Chemiluminescerende substraat</td></tr><tr><td>Proteïne kleur instrument</td><td>GE Healthcare bio-sciences AB</td><td>Amersham lmager 600</td><td>Voor het detecteren van proteïnen</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLCB4394</td><td>Voor de bereiding van 5x Tris-glycine buffer</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Roche</td><td>D609K69032</td><td>Voor de bereiding van 5x Tris-glycine buffer en 10&times;TBS buffer</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Coolaber SCIENCE&amp;TeCHNoLoGY</td><td>CT30111220</td><td>Voor de bereiding van TBST</td></tr><tr><td>Verticale plaat elektroforese tank</td><td>BIO-RAD</td><td>1658001</td><td>Voor SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Waterbad</td><td>Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd.</td><td>XMTD-8222</td><td>Voor het koken van de proteïne monsters</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Xiya Reagent</td><td>B14492</td><td>Voor de bereiding van 4x proteïne monster buffer</td></tr></tbody></table>

het detecteren van virus- en speekseleiwitten van een leafhoppervector in de plantengastheer

Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host

Insectenvectoren brengen horizontaal veel plantenvirussen van agrarisch belang over. Meer dan de helft van de plantenvirussen wordt overgedragen door hemipteraninsecten die piercing-zuigende monddelen hebben. Tijdens virale overdracht overbrugt het insectenspeeksel de virus-vector-gastheer omdat de speekselvectoren, virussen en de insecteneiwitten de immuunrespons van planten van insecten in plantengastheren activeren of onderdrukken. De identificatie en functionele analyses van speekseleiwitten worden een nieuw aandachtsgebied in het onderzoeksveld van arbovirus-gastheerinteracties. Dit protocol biedt een systeem om eiwitten in het speeksel van leafhoppers te detecteren met behulp van de plantengastheer. De leafhoppervector Nephotettix cincticeps besmet met het rijstdwergvirus (RDV) dient als voorbeeld. Het vitellogenine en het belangrijkste buitenste capside-eiwit P8 van RDV, gevectoreerd door het speeksel van N. cincticeps, kunnen tegelijkertijd worden gedetecteerd in de rijstplant waar N. cincticeps zich mee voedt . Deze methode is toepasbaar voor het testen van de speekseleiwitten die tijdelijk in de plantengastheer worden vastgehouden na insectenvoeding. Er wordt aangenomen dat dit detectiesysteem de studie van hemipteran-virus-plant of hemipteran-plant interacties ten goede zal komen.

Figuur 1 illustreert alle stappen in dit protocol: insectenkweek, virusverwerving, het verzamelen van speekseleiwitten via rijstvoeding en de western blot. De resultaten van de western blots toonden aan dat specifieke en verwachte banden van ongeveer 220 kDa werden waargenomen in de monsters van het voeden van rijst en speekselklieren van insecten op het membraan geïncubeerd met antilichamen tegen Vg. Daarentegen werd geen band waargenomen in het niet-voedende rijstmonster. Het resu...

Dit protocol laat zien hoe de plantengastheer kan worden gebruikt om speekseleiwitten van leafhopper en plantaardige virale eiwitten te detecteren die worden vrijgegeven door leafhopper-vectoren.

Het detecteren van virus- en speekseleiwitten van een leafhoppervector in de plantengastheer

Insect vectors horizontally transmit many plant viruses of agricultural importance. More than one-half of plant viruses are transmitted by hemipteran ...

Dit protocol biedt een techniek voor het detecteren van de speekseleiwitten van leafhoppers en plantengastheren om de functie van deze eiwitten in de plantengastheren verder te onderzoeken. Deze techniek is eenvoudig uit te voeren en het systeem is stabiel en repliceerbaar. Deze methode kan ook nuttig zijn bij de detectie van speekseleiwitten van andere hemiptera- en plantengastheren.Om te beginnen, fok de volwassen leafhoppers op rijstzaailingen in een kubuskooi van 40 bij 35 bij 20 centimeter. Houd één kant van de kooi bedekt met een insectenbestendig net voor ventilatie. Plaats de kooien met de leafhoppers in een incubator met daarin een ingebouwde vochtigheidsregelaar op 26 graden Celsius met een relatieve luchtvochtigheid van 60 tot 75% onder een fotoperiode van 16 uur licht en acht uur donker.Gebruik eenmaal per week een aspirator om alle volwassenen voorzichtig uit hun kooi over te brengen naar een nieuwe kooi met verse rijstzaailingen. Laat meer dan 200 volwassenen paren en eieren leggen in de rijst. Bewaar de oude rijstzaailingen voor de nimfen om tevoorschijn te komen en deze nieuwe niet-virulifere nimfen naar het tweede instar-stadium te brengen.Gebruik de aspirator om de tweede instar niet-virulifere nimfen voorzichtig gedurende één tot twee uur over te brengen naar een glazen kweekbuis voor uithongering. Laat de nimfen vervolgens los in een kooi met een rijstdwergvirus geïnfecteerde rijstplant die in een pot is gekweekt en laat de nimfen zich twee dagen voeden met de geïnfecteerde rijstplant. Breng deze nimfen na twee dagen voorzichtig over naar een nieuwe kooi met verse virusvrije rijstzaailingen en laat de nimfen zich gedurende 12 dagen voeden met de virusvrije rijstzaailingen om de circulatoire overdrachtsperiode van het rijstdwergvirus te voltooien.Om de speekseleiwitten te verzamelen, bereidt u vijf kleine pijpachtige voedingskooien voor die aan één uiteinde zijn bedekt met insectenbestendig net. Nadat je 15 tot 20 leafhoppers in elke voerkooi hebt opgesloten, bedek je het andere uiteinde van de kooi met een dunne schuimmat. Bevestig een rijstzaailing tussen het einde van de kooi en een schuimmat met tapes, zodat de leafhoppers in de voederkooi zich kunnen voeden met de rijstzaailingen die aan de binnenkant van de kooi zijn blootgesteld.Dompel de zaailingwortels onder in water zodat de rijstplant in leven blijft en laat de leafhoppers zich er twee dagen mee voeden. Verwijder na twee dagen de leafhoppers uit hun voederkooien en verzamel de rijstzaailingen waarmee de leafhoppers zich voedden. Knip de zaailingen buiten de kooi en herstel de voedingsgebieden van de zaailingen.Bereid 1x Tris-Glycine buffer door 200 milliliter van de bereide 5x buffer te verdunnen met 800 milliliter steriel water. Bereid vervolgens 10x TBS-buffer voor en autoclaaf de oplossing bij 121 graden Celsius gedurende 15 minuten. Bereid vervolgens de 4x eiwitmonsterbuffer voor.Bereid vervolgens de transferbuffer voor door 800 milliliter van de Tris-Glycine-buffer te mengen met 200 milliliter methanol. Bereid ten slotte de TBST-oplossing door 100 milliliter 10x TBS en drie milliliter Tween 20 tot 900 milliliter steriel water toe te voegen. Om de speeksel- en virale eiwitten te detecteren, maalt u 0,1 gram van de rijstmonsters met vloeibare stikstof totdat het weefsel een poeder wordt.Voeg vervolgens 200 microliter van de 4x eiwitmonsterbuffer toe aan het monster en kook gedurende 10 minuten. Centrifugeer de monsters en breng het supernatant over in een nieuwe injectieflacon. Laad 10 microliter van het monster op een SDS-PAGE-gel en laat het gedurende 45 tot 60 minuten in Tris-Glycine-buffer op 150 volt lopen.Terwijl de gel loopt, plaatst u een nitrocellulosemembraan van 0,45 micron en andere sandwichbenodigdheden gedurende 30 minuten in de overdrachtsbuffer. Sandwich de gel na de run en breng deze gedurende 90 tot 120 minuten over op 100 volt in de transferbuffer. Nadat het vlekken is voltooid, plaatst u het membraan in een 7% vetvrije droge melkblokkeringsoplossing in TBST en incubeer u gedurende 20 minuten.Voeg daarna een antilichaam toe tegen het rijstdwergvirus P8 of vitellogenine en incubeer het membraan gedurende twee uur of 's nachts. Na de incubatie, was het membraan met TBST drie keer met een incubatie van vijf minuten tussen elke wasbeurt. Voeg vervolgens Goat anti-Rabbit IgG toe als secundair antilichaam en incubeer het membraan gedurende 60 tot 90 minuten.Gebruik de ECL Western-kit voor chemiluminescente detectie in gemengde detectiereagentia één en twee in de kit in een verhouding van één op één. Breng het membraan op het gemengde reagens en incubeer de vlek gedurende vijf minuten. Giet het overtollige reagens af en maak een chemiluminescente en colorimetrische foto van het membraan.Combineer de foto's om de laatste te zien met eiwitbanden. Western blot-analyse voor detectie van vitellogenine toonde specifieke en verwachte banden van ongeveer 220 kilodalton in het voeden van rijstplanten en speekselklieren van de insecten. Daarentegen werd geen band waargenomen in de niet-voedende planten, wat aangeeft dat vitellogenine in de plantengastheer werd vrijgegeven als een speekseleiwit.Western blot-analyse voor detectie van het rijstdwergvirus P8-eiwit toonde een specifieke en verwachte band van ongeveer 46 kilodalton in voedingsplanten en virulifere insectenlichamen. Daarentegen werd geen band waargenomen in niet-voedende planten en niet-virulifere leafhopperlichamen, wat bewijst dat de virale eiwitten ook in de voedende planten konden worden gedetecteerd. De virale lading in de leafhoppers, de detectietiming en replicaties moeten in aanmerking worden genomen bij het uitvoeren van dit protocol.Deze methode kan ook worden toegepast voor het bestuderen van muggen die arbovirussen overbrengen.

detecting-virus-salivary-proteins-leafhopper-vector-plant

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Bladluizen zijn effectief zenders van plantenvirussen. Bladluis micro-injectie van het virus, de procedure zullen wij tonen u vandaag, is een techniek waarmee onderzoekers van het virus te injecteren direct in de hemocoel van de bladluis, het omzeilen van de darm, een van de twee grootste barrières voor overdracht van het virus in een circulative manier. Dezelfde techniek wordt ook gebruikt om dsRNA injecteren RNAi.

Het testen van de Fysiologische Belemmeringen voor virale transmissie in Bladluizen Met behulp van micro-injectie

Source: Zhang, L., et al. Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts. J. Vis. Exp. (2021)The video demonstrates the preparation of gut tissue from a plant virus–infected insect vector for fluorescence imaging. Fixed guts were washed, permeabilized, and incubated with two fluorescent antibodies in a blocking solution—one targeting a viral antigen in vesicles, the other a vesicle-associated membrane protein. The tissue was counterstained for actin...

Immunostaining to Visualize Viral Antigen and Host Protein Colocalization in the Insect Gut

We beschrijven hier een eenvoudige fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) werkwijze voor de lokalisatie van virussen en bacteriën in insecten en plantenweefsels. Dit protocol kan worden verlengd voor de visualisatie van mRNA in ganse berg en preparaten.

Fluorescentie<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisaties (FISH) voor de lokalisatie van Virussen en Endosymbiotic Bacteriën in Plant en Insect Tissues

Plant intercellulaire verbindingen, de plasmodesmata (Pd), spelen een centrale rol in plant fysiologie en plant-virus interacties. Kritische Pd vervoer zijn signalen dat rechtstreekse eiwitten aan Pd sorteren. Onze kennis over deze sequenties is echter nog in de kinderschoenen. Beschrijven we een strategie om te identificeren Pd lokalisatie signalen in Pd-gerichte eiwitten.

Identificatie van Plasmodesmal lokalisatie sequenties in eiwitten In Planta

Hier presenteren we een protocol om de host-weefselverdeling, transmissiemodus en gevolgen voor de gastheer geschiktheid van een densovirus binnen Lepidoptera species, de katoenkever onderzoeken. Dit protocol kan ook worden gebruikt voor het bestuderen van de interactie tussen andere oraal overdraagbare virussen en insecten hun gastheer.

Protocollen voor het onderzoeken van de host-weefsel Distribution, transmissie-mode, en het effect op de Host Geschiktheid van een Densovirus in de katoenkever

Hier presenteren we een nieuwe aanpak om te identificeren plantenvirussen met dubbele streng DNA genomen. Wij gebruiken standaard methoden uittreksel DNA en RNA van besmette bladeren en uitvoeren van de volgende generatie sequencing. Bioinformatic hulpmiddelen assembleren sequenties in contigs, identificeren van contigs vertegenwoordigen virus genomen en genomen aan taxonomische groepen toewijzen.

Het combineren van de analyse van DNA in een ruwe Virion extractie met de analyse van RNA van besmette bladeren om te ontdekken van nieuwe Virus Genomes

Hier presenteren we de protocollen om te identificeren 1) virus-gecodeerde immunomodulators ter bevordering van arbovirus replicatie en 2) eukaryotische gastheer factoren die arbovirus replicatie beperken. Deze fluorescentie - en luminescentie gebaseerde methoden toestaan onderzoekers snel verkrijgen van kwantitatieve uitlezingen van arbovirus replicatie in simplistische testen met lage signaal-ruis verhouding.

Arbovirus infecties als Screening van hulpmiddelen voor de identificatie van de virale Immunomodulators en Host antivirale factoren

Hier presenteren we een aangepaste screeningmethode die uitgebreid kan worden gebruikt om RNA-uitschakelingssuppressors in plantenpathogenen snel te screenen.

Screening en identificatie van RNA Silencing Suppressors van secreted effectors of Plant Pathogens

Dit protocol voor immunofluorescente etikettering van zowel plantaardige viruseiwitten als vectorinsecteneiwitten in weggesneden insectendarmen kan worden gebruikt om interacties tussen virus- en vectorinsecten, insecteneiwitfuncties en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan virusoverdracht te bestuderen.

Immunofluorescente etikettering van plantenvirussen en insectenvectoreiwitten in hemipterandarmen

Het huidige protocol beschrijft een methode om voldoende speeksel van priemzuigende insecten te verzamelen met behulp van een kunstmatig medium. Dit is een handige methode voor het verzamelen van insectenspeeksel en het bestuderen van speekselfunctie op insectenvoedingsgedrag en vectoroverdraagbare virusoverdracht.

Tweelaagse membraansandwichmethode voor Laodelphax striatellus Speekselcollectie

We beschrijven een methode om kwantificeerbare hemolymfe efficiënt te verzamelen uit kleine geleedpotigen voor latere analyse.

Een nauwkeurige en kwantificeerbare methode voor het verzamelen van hemolymfe van kleine geleedpotigen

Leer een methode om speekseleiwitten en virale eiwitten van cicaden te detecteren in rijstplanten. Dit protocol maakt gebruik van Western blotting en SDS-PAGE om eiwitinteracties te bestuderen.

Het detecteren van virus- en speekseleiwitten van een leafhoppervector in de plantengastheer

Meer video's verkennen