Het detecteren van virus- en speekseleiwitten van een leafhoppervector in de plantengastheer

Dit protocol biedt een techniek voor het detecteren van de speekseleiwitten van leafhoppers en plantengastheren om de functie van deze eiwitten in de plantengastheren verder te onderzoeken. Deze techniek is eenvoudig uit te voeren en het systeem is stabiel en repliceerbaar. Deze methode kan ook nuttig zijn bij de detectie van speekseleiwitten van andere hemiptera- en plantengastheren.

Om te beginnen, fok de volwassen leafhoppers op rijstzaailingen in een kubuskooi van 40 bij 35 bij 20 centimeter. Houd één kant van de kooi bedekt met een insectenbestendig net voor ventilatie. Plaats de kooien met de leafhoppers in een incubator met daarin een ingebouwde vochtigheidsregelaar op 26 graden Celsius met een relatieve luchtvochtigheid van 60 tot 75% onder een fotoperiode van 16 uur licht en acht uur donker.

Gebruik eenmaal per week een aspirator om alle volwassenen voorzichtig uit hun kooi over te brengen naar een nieuwe kooi met verse rijstzaailingen. Laat meer dan 200 volwassenen paren en eieren leggen in de rijst. Bewaar de oude rijstzaailingen voor de nimfen om tevoorschijn te komen en deze nieuwe niet-virulifere nimfen naar het tweede instar-stadium te brengen.

Gebruik de aspirator om de tweede instar niet-virulifere nimfen voorzichtig gedurende één tot twee uur over te brengen naar een glazen kweekbuis voor uithongering. Laat de nimfen vervolgens los in een kooi met een rijstdwergvirus geïnfecteerde rijstplant die in een pot is gekweekt en laat de nimfen zich twee dagen voeden met de geïnfecteerde rijstplant. Breng deze nimfen na twee dagen voorzichtig over naar een nieuwe kooi met verse virusvrije rijstzaailingen en laat de nimfen zich gedurende 12 dagen voeden met de virusvrije rijstzaailingen om de circulatoire overdrachtsperiode van het rijstdwergvirus te voltooien.

Om de speekseleiwitten te verzamelen, bereidt u vijf kleine pijpachtige voedingskooien voor die aan één uiteinde zijn bedekt met insectenbestendig net. Nadat je 15 tot 20 leafhoppers in elke voerkooi hebt opgesloten, bedek je het andere uiteinde van de kooi met een dunne schuimmat. Bevestig een rijstzaailing tussen het einde van de kooi en een schuimmat met tapes, zodat de leafhoppers in de voederkooi zich kunnen voeden met de rijstzaailingen die aan de binnenkant van de kooi zijn blootgesteld.

Dompel de zaailingwortels onder in water zodat de rijstplant in leven blijft en laat de leafhoppers zich er twee dagen mee voeden. Verwijder na twee dagen de leafhoppers uit hun voederkooien en verzamel de rijstzaailingen waarmee de leafhoppers zich voedden. Knip de zaailingen buiten de kooi en herstel de voedingsgebieden van de zaailingen.

Bereid 1x Tris-Glycine buffer door 200 milliliter van de bereide 5x buffer te verdunnen met 800 milliliter steriel water. Bereid vervolgens 10x TBS-buffer voor en autoclaaf de oplossing bij 121 graden Celsius gedurende 15 minuten. Bereid vervolgens de 4x eiwitmonsterbuffer voor.

Bereid vervolgens de transferbuffer voor door 800 milliliter van de Tris-Glycine-buffer te mengen met 200 milliliter methanol. Bereid ten slotte de TBST-oplossing door 100 milliliter 10x TBS en drie milliliter Tween 20 tot 900 milliliter steriel water toe te voegen. Om de speeksel- en virale eiwitten te detecteren, maalt u 0,1 gram van de rijstmonsters met vloeibare stikstof totdat het weefsel een poeder wordt.

Voeg vervolgens 200 microliter van de 4x eiwitmonsterbuffer toe aan het monster en kook gedurende 10 minuten. Centrifugeer de monsters en breng het supernatant over in een nieuwe injectieflacon. Laad 10 microliter van het monster op een SDS-PAGE-gel en laat het gedurende 45 tot 60 minuten in Tris-Glycine-buffer op 150 volt lopen.

Terwijl de gel loopt, plaatst u een nitrocellulosemembraan van 0,45 micron en andere sandwichbenodigdheden gedurende 30 minuten in de overdrachtsbuffer. Sandwich de gel na de run en breng deze gedurende 90 tot 120 minuten over op 100 volt in de transferbuffer. Nadat het vlekken is voltooid, plaatst u het membraan in een 7% vetvrije droge melkblokkeringsoplossing in TBST en incubeer u gedurende 20 minuten.

Voeg daarna een antilichaam toe tegen het rijstdwergvirus P8 of vitellogenine en incubeer het membraan gedurende twee uur of 's nachts. Na de incubatie, was het membraan met TBST drie keer met een incubatie van vijf minuten tussen elke wasbeurt. Voeg vervolgens Goat anti-Rabbit IgG toe als secundair antilichaam en incubeer het membraan gedurende 60 tot 90 minuten.

Gebruik de ECL Western-kit voor chemiluminescente detectie in gemengde detectiereagentia één en twee in de kit in een verhouding van één op één. Breng het membraan op het gemengde reagens en incubeer de vlek gedurende vijf minuten. Giet het overtollige reagens af en maak een chemiluminescente en colorimetrische foto van het membraan.

Combineer de foto's om de laatste te zien met eiwitbanden. Western blot-analyse voor detectie van vitellogenine toonde specifieke en verwachte banden van ongeveer 220 kilodalton in het voeden van rijstplanten en speekselklieren van de insecten. Daarentegen werd geen band waargenomen in de niet-voedende planten, wat aangeeft dat vitellogenine in de plantengastheer werd vrijgegeven als een speekseleiwit.

Western blot-analyse voor detectie van het rijstdwergvirus P8-eiwit toonde een specifieke en verwachte band van ongeveer 46 kilodalton in voedingsplanten en virulifere insectenlichamen. Daarentegen werd geen band waargenomen in niet-voedende planten en niet-virulifere leafhopperlichamen, wat bewijst dat de virale eiwitten ook in de voedende planten konden worden gedetecteerd. De virale lading in de leafhoppers, de detectietiming en replicaties moeten in aanmerking worden genomen bij het uitvoeren van dit protocol.

Deze methode kan ook worden toegepast voor het bestuderen van muggen die arbovirussen overbrengen.