Name: On-chip kristallisatie en grootschalige seriële diffractie bij kamertemperatuur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Leer eiwitkristallisatie op een chip-apparaat voor röntgendiffractie bij kamertemperatuur. Deze methode maakt geautomatiseerde datacollectie mogelijk zonder fysiek contact met de kristallen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het gebruik van Advanced Photon Source, een Office of Science User Facility die door argonne National Laboratory voor het Amerikaanse ministerie van Energie wordt geëxploiteerd, werd ondersteund door contract DE-AC02-06CH11357. Het gebruik van BioCARS werd ondersteund door het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder subsidienummer R24GM111072. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health. Het gebruik van LS-CAT Sector 21 werd ondersteund door Michigan Economic Development Corporation en Michigan Technology Tri-Corridor grant 085P1000817. Dit werk wordt ondersteund door subsidies van de Universiteit van Illinois in Chicago, National Institutes of Health (R01EY024363) en National Science Foundation (MCB 2017274) aan XY.

1. Voormontage van het apparaat
<ol><li>Label de buitenste ring (30 mm diameter) voor monsteridentificatie. Vermeld indien nodig de projectnaam, het apparaatnummer, de kristallisatievoorwaarde en de datum (figuur 1A). Plaats de buitenste ring ondersteboven op een schoon oppervlak (figuur 1B) en plaats voorzichtig een kwartswafer in de ring (figuur 1C). Deze eerste kwartswafer dient als toegangspoort voor de incidentele röntgenfoto's.</li>
	<li>Giet een kleine hoeveelheid microscoop-dompelolie (viscositeit van 150 cSt) in een petrischaaltje. Dompel een shim in de olie en zorg ervoor dat beide zijden van de shim goed geolied zijn (figuur 1D). Verwijder de overtollige olie door de shim op een schoon oppervlak te deppen.</li>
	<li>Plaats de geoliede shim op de eerste kwartswafer (figuur 1E). OPMERKING: Dompelolie is een uitstekende kit die de kristallisatiekamer beschermt tegen mogelijk dampverlies. Goed geassembleerde chips gaan meestal weken mee zonder zichtbaar te drogen. Deze voormontagestap wordt uitgevoerd onder ruimtelicht. Voor lichtgevoelige monsters moeten alle volgende stappen, met inbegrip van het laden van monsters, de opslag van het apparaat en observatie, onder veiligheidslicht worden uitgevoerd.</li>
</ol>2. Monster laden en apparaatassemblage
<ol><li>Gebruik een pipet om de eiwitoplossing en kristallisatiebuffer op de eerste kwartswafer grondig te mengen. De volumeverhouding tussen het eiwitmonster en de buffer varieert doorgaans van 2:1 tot 1:2 (figuur 1F). Zorg ervoor dat het totale volume van de kristallisatieoplossing de maximale capaciteit van de kristallisatiekamer, bepaald door de grootte en dikte van de shim, niet overschrijdt. Vermijd luchtbellen tijdens het mengen. OPMERKING: De samenstelling van een kristallisatiebuffer varieert van experiment tot experiment. Raadpleeg tabel 1 voor kristallisatiecondities.</li>
	<li>Plaats de tweede kwartswafer over de gemengde oplossing terwijl de oplossing zich begint uit te spreiden (figuur 1G). Deze tweede kwartswafer dient als uitgang van de gediffracteerde röntgenstralen.</li>
	<li>Tik de tweede kwartswafel lichtjes op de rand om de olie te verspreiden terwijl je lucht naar buiten duwt. Bevestig het apparaat door een bevestigingsring in de buitenste ring te schroeven (figuur 1H). Gebruik indien nodig een aanhaalgereedschap (figuur 1I). Houd er rekening mee dat te strak aanspannen ervoor kan zorgen dat delicate kwartswafers vervormen of zelfs barsten.</li>
</ol>3. Optimalisatie van apparaatopslag en kristallisatie
<ol><li>Bewaar de geassembleerde apparaten (figuur 1J) in een doos bij kamertemperatuur of in een incubator met temperatuurregeling. OPMERKING: Eiwitkristallen kunnen verschijnen in een paar uur tot dagen nadat een kristallisatieapparaat is geassembleerd. Typische resultaten van on-chip kristallisatie worden getoond voor verschillende representatieve eiwitmonsters (figuur 2).</li>
	<li>Monitor de kristalgroei door het kristallisatieapparaat onder een microscoop te observeren. Optimaliseer indien nodig de kristallisatiecondities door iteraties van secties 1-3.</li>
</ol>4. Kalibratie
OPMERKING: De programma's en opdrachten die in de onderstaande secties worden genoemd, worden uitgevoerd in inSituX-software.
<ol><li>Installeer een dun kristal van gedopeerde yttrium aluminium granaat op de chiphouder (figuur 3). Installeer de balkstop. Maak röntgenfluorescentiebeelden van de directe bundel door het programma uit te voeren: burnmark.py <device>.param waarbij <device> een door de gebruiker geselecteerde naam is voor het kristallisatieapparaat. <device>.param is een bestandsnaam die apparaatspecifieke besturingsparameters bevat. De standaardwaarden worden geleidelijk vervangen door specifieke waarden langs het protocol. Een voorbeeld <bestand>.param wordt weergegeven in Aanvullend bestand 1.</li>
	<li>Vind de precieze positie van de directe röntgenstraal door het bundelprofielaanpassingsprogramma uit te voeren: beam.py <brand afbeelding> -d <device> waarbij <brandbeeld> de bestandsnaam is van de röntgenfluorescentieafbeelding (figuur 4). OPMERKING: Dit programma berekent de precieze directe straalposities en de straalgrootte. De straalpositie markeert de translocatiebestemming voor alle kristallen van hetzelfde apparaat. De balkgrootte wordt ook gebruikt voor doelplanning.</li>
</ol>5. Optisch scannen
<ol><li>Plaats een kristallisatieapparaat in de chiphouder en bevestig het apparaat met een duimschroef (figuur 3A).</li>
	<li>Monteer de chiphouder op de vertaalfase van de diffractometer via een kinematisch mechanisme (figuur 3B).</li>
	<li>Installeer een goede lichtbron voor het maken van microfoto's vanuit het optische venster van het apparaat. Wit licht, IR-licht of ander licht naar keuze kan worden gebruikt, afhankelijk van de lichtgevoeligheid van het eiwitmonster en het doel van het experiment.</li>
	<li>Voer het scanprogramma uit: scan.py <device>.param Dit programma legt een set micrografieën vast die automatisch worden overgebracht naar opgegeven gebruikerscomputers.</li>
	<li>Voer het tegelprogramma uit op een gebruikerscomputer: tile.py <device> -x <x> -y <y> waarbij <x> en <y> de beginwaarden zijn voor respectievelijk kolom- en rijverplaatsingen van microfoto's. Dit programma voegt alle microfoto's samen tot een montage van 1-3 μm/pixel resolutie (figuur 5). OPMERKING: Stap 5.4 en 5.5 duren meestal enkele minuten. Het totale aantal microfoto's varieert van enkele tientallen tot honderden, afhankelijk van het scangebied en de vergroting.</li>
	<li>Voer het kristalzoekprogramma uit: findX.py <montage> -c <lengte> <breedte> -w <wedge> -x <beam grootte> waar <montage> het betegelde beeld is. Dit programma voert kristalherkenning en shotplanning uit. <lengte> en <breedte> geven de te vinden kristalgrootte aan. Als de gebruiker kleinere kristallen wil vermijden, kan <breedte> worden gebruikt als afsnijding door een getal in te stellen dat groter is dan de grootte van ongewenste kleine kristallen. <wedge> is een hoekwaarde die de tolerantie voor kristallen van onregelmatige vorm instelt. <balkgrootte> verwijst naar de directe straalgrootte die wordt verkregen uit de profielfitting hierboven (stap 4.2; Figuur 4). Ook kan een nominale waarde door gebruikers worden ingesteld om gerichte opnamen verder uit te plaatsen. Deze belangrijke parameters maken specifieke kristalselectie en doelplanning mogelijk (figuur 6).</li>
</ol>6. Röntgendiffractie
<ol><li>Verwijder de lichtbron en installeer de bundelstop. Stel een geschikte detectorafstand in. Volg het veiligheidsprotocol beamline om het röntgenhok te doorzoeken. Open de röntgensluiter en lasersluiter indien van toepassing.</li>
	<li>Voer het programma voor gegevensverzameling voor seriële diffractie uit: collect.py <device>.param -l <lichtduur> Deze opdracht activeert gegevensverzameling waarbij alle geplande opnamen achter elkaar worden bezocht volgens een voorgeprogrammeerde volgorde. Elk gericht kristal wordt getransloceerd naar de straalpositie (stap 4.2). Bij elke stop wordt röntgenblootstelling genomen met of zonder laserverlichting met een geplande tijdsvertraging. Film 1 toont een geautomatiseerde gegevensverzamelingsreeks met een frequentie van 1 Hz. Routinematig worden tientallen tot honderden diffractiebeelden verzameld van een enkel kristallisatieapparaat (film 2). OPMERKING: Sectie 4 kalibratie en sectie 5 optische scan zijn op zichzelf staand in het inSituX-platform en zijn daarom volledig overdraagbaar naar een andere beamline. Sectie 6 Röntgendiffractie moet enige details bevatten bij de werking van de bundellijn.</li>
</ol>

<ol><li>Brändén, G., Neutze, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+challenges+in+time-resolved+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Advances and challenges in time-resolved macromolecular crystallography.</a> Science. 373, (2021).</li>
<li>Fischer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+room+temperature+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Macromolecular room temperature crystallography.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 54, (2021).</li>
<li>Schaffer, J. E., Kukshal, V., Miller, J. J., Kitainda, V., Jez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+X-rays%3A+an+overview+of+emerging+structural+biology+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Topics+in+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Beyond X-rays: an overview of emerging structural biology methods.</a> Emerging Topics in Life Sciences. 5 (2), 221-230 (2021).</li>
<li>Nogales, E., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM%3A+A+unique+tool+for+the+visualization+of+macromolecular+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM: A unique tool for the visualization of macromolecular complexity.</a> Molecular Cell. 58, 677-689 (2015).</li>
<li>Chapman, H. N., Caleman, C., Timneanu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffraction+before+destruction%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Diffraction before destruction.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 369, 20130313(2014).</li>
<li>Kisselman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-CHIP%3A+an+integrated+platform+for+high-throughput+protein+crystallization+and+on-the-chip+X-ray+diffraction+data+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">X-CHIP: an integrated platform for high-throughput protein crystallization and on-the-chip X-ray diffraction data collection.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (6), 533-539 (2011).</li>
<li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+combined+crystallization+plate+for+high-throughput+crystal+screening+and+in+situ+data+collection+at+a+crystallography+beamline%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F+Structural+Biology+Communications%22%5BJournal%5D)">Novel combined crystallization plate for high-throughput crystal screening and in situ data collection at a crystallography beamline.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 77, 319-327 (2021).</li>
<li>le Maire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-plate+protein+crystallization%2C+in+situ+ligand+soaking+and+X-ray+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">In-plate protein crystallization, in situ ligand soaking and X-ray diffraction.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67, 747-755 (2011).</li>
<li>Perry, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+serial+Laue+diffraction+on+a+microfluidic+crystallization+device%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">In situ serial Laue diffraction on a microfluidic crystallization device.</a> Journal of Applied Crystallography. 47, 1975-1982 (2014).</li>
<li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal-on-crystal+chips+for+in+situ+serial+diffraction+at+room+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Crystal-on-crystal chips for in situ serial diffraction at room temperature.</a> Lab on a Chip. 18, 2246-2256 (2018).</li>
<li>Ren, Z. Single crystal quartz chips for protein crystallization and X-ray diffraction data collection and related methods. US patent. , 9632042 (2017).</li>
<li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+platform+for+in+situ+serial+crystallography+at+room+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">An automated platform for in situ serial crystallography at room temperature.</a> IUCrJ. 7, 1009-1018 (2020).</li>
<li>Croes, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+solving+traveling+salesman+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Operations+Research%22%5BJournal%5D)">A method for solving traveling salesman problems.</a> Operations Research. 6, 791-812 (1958).</li>
<li>Bandara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+far-red-sensing+cyanobacteriochrome+reveals+an+atypical+bilin+conformation+and+spectral+tuning+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a far-red-sensing cyanobacteriochrome reveals an atypical bilin conformation and spectral tuning mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118, 2025094118(2021).</li>
<li>Shin, H., Ren, Z., Zeng, X., Bandara, S., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+molecular+logic+OR+in+a+dual-sensor+histidine+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Structural basis of molecular logic OR in a dual-sensor histidine kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116, 19973-19982 (2019).</li>
<li>Yang, X., Ren, Z., Kuk, J., Moffat, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-scan+cryocrystallography+reveals+reaction+intermediates+in+bacteriophytochrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Temperature-scan cryocrystallography reveals reaction intermediates in bacteriophytochrome.</a> Nature. 479, 428-432 (2011).</li>
<li>Zhang, F., Scheerer, P., Oberpichler, I., Lamparter, T., Krauss, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+prokaryotic+%286-4%29+photolyase+with+an+Fe-S+cluster+and+a+6%2C7-dimethyl-8-ribityllumazine+antenna+chromophore%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a prokaryotic (6-4) photolyase with an Fe-S cluster and a 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine antenna chromophore.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 7217-7222 (2013).</li>
<li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+crystallography+reveals+early+signaling+events+in+ultraviolet+photoreceptor+UVR8%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Dynamic crystallography reveals early signaling events in ultraviolet photoreceptor UVR8.</a> Nature Plants. 1, 14006(2015).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+base+selectivity+from+the+1.8+%C3%85+resolution+structure+of+an+RB69+DNA+polymerase+ternary+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Insights into base selectivity from the 1.8 Å resolution structure of an RB69 DNA polymerase ternary complex.</a> Biochemistry. 50, 581-590 (2011).</li>
<li>Rodgrs, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryocrystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Cryocrystallography.</a> Structure. 2, 1135-1140 (1994).</li>
<li>Zhao, F. -Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+sample+delivery+systems+for+serial+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22TheFEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">A guide to sample delivery systems for serial crystallography.</a> TheFEBS Journal. 286, 4402-4417 (2019).</li>
</ol>

ZR is de uitvinder van de kristal-op-kristalchips op het Amerikaanse patent 9632042 verleend aan Renz Research, Inc.

Eiwitkristallografie in de beginjaren uitgevoerd bij kamertemperatuur ondervond enorme moeilijkheden bij het bestrijden van röntgenstralingsschade. Het is dus vervangen door de robuustere cryocrystallografiemethode toen synchrotron röntgenbronnen direct beschikbaarkwamen 20. Met de komst van röntgenvrije elektronenlasers is de eiwitkristallografie op kamertemperatuur de afgelopen jaren nieuw leven ingeblazen, met veel nieuwe ontwikkelingen gedreven door de wens om de structurele dynamiek van eiwit...

Vanwege de ioniserende effecten van röntgenstraling is eiwitkristallografie in de afgelopen drie decennia voor een groot deel beperkt gebleven tot cryogene omstandigheden. Daarom komt de huidige kennis van eiwitbewegingen tijdens zijn functie grotendeels voort uit vergelijkingen tussen statische structuren die in verschillende toestanden onder cryogene omstandigheden worden waargenomen. Cryogene temperaturen belemmeren echter onvermijdelijk de progressie van een biochemische reactie of interconversie tussen verschillende conformatietoestanden terwijl eiwitmoleculen aan het werk zijn. Om de structurele dynamiek van eiwitten direct te observeren bij atomaire resolutie door kristallografie, zijn robuuste en routinematige methoden nodig voor het uitvoeren van diffractie-experimenten bij kamertemperatuur, wat technische innovaties vereist in monsterafgifte, gegevensverzameling en posterieure gegevensanalyse. Daartoe hebben recente ontwikkelingen in seriële kristallografie nieuwe mogelijkheden geboden om de moleculaire beelden van tussenproducten en kortlevende structurele soorten bij kamertemperatuur 1,2,3 vast te leggen. In tegenstelling tot de "one-crystal-one-dataset"-strategie die veel wordt gebruikt in conventionele cryocrystallografie, hanteert seriële kristallografie een strategie voor gegevensverzameling die vergelijkbaar is met die van cryo-elektronenmicroscopie met één deeltje. In het bijzonder worden de experimentele gegevens in seriële kristallografie verzameld in kleine fracties van een groot aantal individuele monsters, gevolgd door intensieve gegevensverwerking waarbij gegevensfracties worden geëvalueerd en gecombineerd tot een volledige dataset voor 3D-structuurbepaling4. Deze "one-crystal-one-shot" strategie verlicht effectief de röntgenstralingsschade aan eiwitkristallen bij kamertemperatuur via een diffractie vóór vernietigingsstrategie5.
Aangezien seriële kristallografie een groot aantal eiwitkristallen vereist om een dataset te voltooien, vormt dit grote technische uitdagingen voor veel biologische systemen waar eiwitmonsters beperkt zijn en / of delicate kristalverwerking betrokken is. Een andere belangrijke overweging is hoe de kristalintegriteit het beste kan worden bewaard in seriële diffractie-experimenten. De in situ diffractiemethoden pakken deze zorgen aan door eiwitkristallen rechtstreeks te laten diffracteren van waar ze groeien zonder de verzegeling van de kristallisatiekamerte verbreken 6,7,8,9. Deze handlingvrije methoden zijn natuurlijk compatibel met grootschalige seriële diffractie. We hebben onlangs het ontwerp en de implementatie gemeld van een kristallisatie-apparaat voor in situ diffractie op basis van een kristal-op-kristalconcept - eiwitkristallen die rechtstreeks op monokristallijn kwartszijn gekweekt 11. Dit "kristal-op-kristal" apparaat biedt verschillende voordelen. Ten eerste beschikt het over een röntgen- en lichttransparant venster gemaakt van een monokristallijn kwartssubstraat, dat weinig achtergrondverstrooiing produceert, wat resulteert in uitstekende signaal-ruisverhoudingen in diffractiebeelden van eiwitkristallen. Ten tweede is het kwarts met één kristal een uitstekend dampscherm dat gelijkwaardig is aan glas, waardoor het een stabiele omgeving biedt voor eiwitkristallisatie. Daarentegen zijn andere kristallisatieapparaten die op polymeren gebaseerde substraten gebruiken gevoelig voor droging als gevolg van dampdoorlaatbaarheid, tenzij het polymeermateriaal een aanzienlijke dikte heeft, wat bijgevolg bijdraagt aan een hoge achtergrondverstrooiing10. Ten derde maakt dit apparaat de levering van een groot aantal eiwitkristallen aan de röntgenstraal mogelijk zonder enige vorm van kristalmanipulatie of oogsten, wat van cruciaal belang is voor het behoud van de kristalintegriteit11.
Om seriële röntgendiffractie-experimenten met behulp van de kristal-op-kristalapparaten te stroomlijnen, hebben we een diffractometerprototype ontwikkeld om eenvoudig schakelen tussen de optische scan- en röntgendiffractiemodi12 te vergemakkelijken. Deze diffractometer heeft een kleine voetafdruk en is gebruikt voor seriële gegevensverzameling op twee bundellijnen van de Advanced Photon Source (APS) in het Argonne National Laboratory. Specifiek gebruikten we BioCARS 14-ID-B voor Laue-diffractie en LS-CAT 21-ID-D voor monochromatische oscillatie. Deze diffractometerhardware is niet vereist als een synchrotron- of röntgenvrije elektronenlaserbundellijn is uitgerust met twee belangrijke mogelijkheden: (1) gemotoriseerde monsterpositionering met een reisbereik van ±12 mm rond de röntgenstraal in alle richtingen; en (2) een on-axis digitale camera voor het bekijken van kristallen onder lichtverlichting die veilig is voor eiwitkristallen die worden bestudeerd. Het monokristallijne kwartsapparaat vormt samen met een draagbare diffractometer en de besturingssoftware voor optische scanning, kristalherkenning en geautomatiseerde in situ gegevensverzameling gezamenlijk het inSituX-platform voor seriële kristallografie. Hoewel deze ontwikkeling voornamelijk wordt gemotiveerd door de dynamische kristallografietoepassingen met behulp van een polychromatische röntgenbron, hebben we het potentieel van deze technologie aangetoond om monochromatische oscillatiemethoden te ondersteunen10,12. Met automatisering biedt dit platform een methode voor het verzamelen van seriële gegevens met hoge doorvoer bij kamertemperatuur met betaalbaar eiwitverbruik.
In deze bijdrage beschrijven we in detail hoe we on-chip kristallisatie in een nat laboratorium kunnen instellen en hoe we seriële röntgengegevensverzameling kunnen uitvoeren op een synchrotron-bundellijn met behulp van het inSituX-platform.
De batchmethode wordt gebruikt om on-chip kristallisatie in te stellen onder een toestand die vergelijkbaar is met die van de dampdiffusiemethode die voor hetzelfde eiwitmonster is verkregen (tabel 1). Als uitgangspunt raden we aan om precipitant te gebruiken met een concentratie van 1,2-1,5x daarvan voor de dampdiffusiemethode. Indien nodig kan de kristallisatieconditie van de batch verder worden geoptimaliseerd via fijnrasterscreening. Kwartswafers zijn niet nodig voor optimalisatieproeven; in plaats daarvan kunnen glazen coverslips worden gebruikt (zie hieronder). Gedeeltelijk geladen kristallisatieapparaten worden aanbevolen om optimalisatieproeven op kleinere schaal te houden. Een aantal eiwitmonsters is met succes gekristalliseerd op dergelijke apparaten met behulp van de batchmethode10 (tabel 1).
Het apparaat zelf bestaat uit de volgende onderdelen: 1) een buitenste ring; 2) twee kwartswafers; 3) een wasmachine-achtige shim van plastic of roestvrij staal; 4) een keerring; 5) microscoop-dompelolie als afdichtmiddel (figuur 1). Het totale volume van de kristallisatieoplossing die op één chip wordt geladen, is afhankelijk van het doel van het experiment. De capaciteit van de kristallisatiekamer kan worden aangepast door een shim van verschillende diktes en /of binnendiameter te kiezen. We zetten routinematig kristallisatieapparaten op met een capaciteit van 10-20 μL met behulp van shims van 50-100 μm in dikte. Een typisch apparaat kan tienduizenden tot duizenden eiwitkristallen produceren die geschikt zijn voor seriële gegevensverzameling (figuur 2).
Wanneer succesvol, zal on-chip kristallisatie tientallen tot honderden of zelfs duizenden eiwitkristallen produceren op elk kwartsapparaat dat klaar is voor röntgendiffractie. Bij een synchrotronbundellijn wordt een dergelijk apparaat met behulp van een kinematisch mechanisme op een drieassige translatiefase van de diffractometer gemonteerd. Het kristallisatievenster van een gemonteerd apparaat wordt optisch gescand en afgebeeld in tientallen tot honderden microfoto's. Deze microfoto's worden vervolgens gestikt tot een montage met hoge resolutie. Voor lichtgevoelige kristallen kan optisch scannen worden uitgevoerd onder infrarood (IR) licht om onbedoelde foto-activering te voorkomen. Er is computer vision-software ontwikkeld om eiwitkristallen te identificeren en te lokaliseren die willekeurig op het apparaat zijn verdeeld. Deze kristallen worden vervolgens gerangschikt op basis van hun grootte, vorm en positie om de strategie voor gegevensverzameling in seriële kristallografie te informeren of te begeleiden. Er kunnen bijvoorbeeld enkele of meerdere opnamen op elk gericht kristal worden gevonden. Gebruikers konden een enkele pas of meerdere routes door gerichte kristallen plannen. We hebben software geïmplementeerd om verschillende reisroutes te berekenen. De kortste route wordt bijvoorbeeld berekend met behulp van algoritmen die het probleem van de reizende verkoper aanpakken13. Voor pomp-sonde dynamische kristallografische toepassingen kunnen de timing en duur van laser(pomp) en röntgenfoto's (sonde) worden gekozen. Een geautomatiseerde seriële gegevensverzameling is geprogrammeerd om elk gericht kristal achter elkaar in de röntgenstraal te transloceren.
De belangrijkste componenten van de insituX diffractometer zijn: 1) een apparaathouder; 2) een drieassige vertaalfase; 3) een lichtbron voor optisch scannen; 4) een röntgenstraalstop; 5) pomplasers als lichtgevoelige eiwitten worden bestudeerd; 6) Raspberry Pi microcomputer uitgerust met een IR-gevoelige camera; 7) besturingssoftware om motoren, camera, lichtbronnen, pomplaser te synchroniseren en te communiceren met beamline-bedieningselementen.

<table><tbody><tr><td>Analysis software</td><td>In-house ontwikkeld</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cerium doped yttrium aluminum garnet</td><td>MSE Supplies</td><td></td><td>Ce:Y3Al5O12, YAG enkele kristal substraten</td></tr><tr><td>Chip houder</td><td>In-house ontwikkeld</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Controle software</td><td>In-house ontwikkeld</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersie olie</td><td>Cargille Laboratories</td><td>16482</td><td>Type A lage viscositeit 150 cSt</td></tr><tr><td>inSituX platform</td><td>In-house ontwikkeld</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IR lichtbron</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>LED1085L</td><td>LED met een glazen lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18</td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Zeiss</td><td></td><td>SteREO Discovery V8</td></tr><tr><td>Buitendraad</td><td>In-house ontwikkeld</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Pipet</td><td>Pipetman</td><td>F167380</td><td>P10</td></tr><tr><td>Pomp lasers</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>LD785-SE400</td><td>785 nm, 400 mW, &Oslash;9 mm, E Pin Code, Laser Diode</td></tr><tr><td>Raspberry Pi</td><td>Raspberry Pi Foundation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Veerring</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>SM1RR</td><td>SM1 veerring voor &Oslash;1" lens tubes en mounts</td></tr><tr><td>Zadenloze kwarts kristal</td><td>University Wafers, Inc.</td><td>U01-W2-L-190514</td><td>25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm dikte dubbelzijdige polijst 8 mm op -X</td></tr><tr><td>Shim</td><td>In-house ontwikkeld</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-ray straal stop</td><td>In-house ontwikkeld</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

on-chip kristallisatie en grootschalige seriële diffractie bij kamertemperatuur

On-Chip Crystallization and Large-Scale Serial Diffraction at Room Temperature

Biochemische reacties en biologische processen kunnen het best worden begrepen door aan te tonen hoe eiwitten overgaan tussen hun functionele toestanden. Aangezien cryogene temperaturen niet-fysiologisch zijn en de structurele dynamiek van eiwitten kunnen voorkomen, afschrikken of zelfs veranderen, is een robuuste methode voor routinematige röntgendiffractie-experimenten bij kamertemperatuur zeer wenselijk. Het kristal-op-kristalapparaat en de bijbehorende hardware en software die in dit protocol wordt gebruikt, zijn ontworpen om in situ röntgendiffractie bij kamertemperatuur mogelijk te maken voor eiwitkristallen van verschillende groottes zonder enige monstermanipulatie. Hier presenteren we de protocollen voor de belangrijkste stappen van apparaatassemblage, on-chip kristallisatie, optische scanning, kristalherkenning tot röntgenopnameplanning en geautomatiseerde gegevensverzameling. Omdat dit platform geen kristaloogst of andere monstermanipulatie vereist, kunnen honderden tot duizenden eiwitkristallen die op chip worden gekweekt, op een programmeerbare en snelle manier in een röntgenstraal worden geïntroduceerd.

Verschillende representatieve datasets zijn gepubliceerd In de afgelopen jarenzijn 10,12 samen met de kristallografische resultaten en wetenschappelijke bevindingen van een breed scala aan eiwitmonsters gepubliceerd, waaronder fotoreceptoreiwitten en enzymen, bijvoorbeeld een plant UV-Breceptor UVR8, een lichtgestuurde DNA-reparatiefotolyase PhrB10, een nieuw verrood licht detecterend eiwit uit een multi-domein sensorische histidinekinase<...

Deze bijdrage beschrijft hoe eiwitkristallisatie op kristal-op-kristalapparaten kan worden ingesteld en hoe geautomatiseerde seriële gegevensverzameling bij kamertemperatuur kan worden uitgevoerd met behulp van het on-chip kristallisatieplatform.

On-chip kristallisatie en grootschalige seriële diffractie bij kamertemperatuur

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since ...

Dit protocol demonstreert eiwitkristallisatie op een chipachtig apparaat in röntgendiffractiegegevensherinnering. Dit apparaat wordt een kristal-op-kristal genoemd omdat eiwitkristallen groeien op een enkel kwartskristal. Na succesvolle groei van eiwitkristallen op dergelijke apparaten worden duizenden diffractiebeelden verzameld van elk apparaat bij kamertemperatuur zonder zelfs de eiwitkristallen aan te raken.Röntgendiffractie bij kamertemperatuur is zeer essentieel voor het bestuderen van de eiwitfunctie waarbij veel conformatietoestanden betrokken zijn. Deze informatieve eiwitveranderingen of eiwitwerkingen kunnen worden bevroren, dus niet detecteerbaar in cryo-kristallografie. Deze apparaten kunnen worden gebruikt om door licht geïnduceerde signaleringsprocessen en redoxveranderingen te bestuderen.Slechts een handvol apparaten geeft complete en redundante datasets. Om de voormontage van het apparaat te starten, labelt u de buitenste ring voor de monsteridentificatie. Vermeld de projectnaam, het apparaatnummer, de kristallisatievoorwaarde en de gewenste datum.Plaats vervolgens de gelabelde ring ondersteboven op een schoon oppervlak en plaats een kwartswafer in de buitenste ring. Giet vervolgens een kleine hoeveelheid microscoop-dompelolie in een petrischaal en dompel een shim in de olie om ervoor te zorgen dat beide zijden van de shim goed zijn gecoat. Verwijder overtollige olie door de shim op een schoon oppervlak te deppen.Leg vervolgens de geoliede shim op de eerste kwartswafer. Meng de eiwitoplossing en kristallisatiebuffer op de eerste kwartswafer met behulp van een pipet. Probeer luchtbellen te vermijden bij het mengen.Het totale volume van de kristallisatieoplossing mag de maximale capaciteit van de kristallisatiekamer, bepaald door de grootte en dikte van de shim, niet overschrijden. Leg de tweede kwartswafel over de gemengde oplossing. De oplossing zal zich spontaan verspreiden.Tik vervolgens de tweede kwartswafel lichtjes op de rand om de olie te verspreiden terwijl de lucht naar buiten wordt geduwd. Bevestig het apparaat door een bevestigingsring in de buitenste ring te schroeven. Gebruik indien nodig een aanhaalgereedschap.Vermijd overspannen, omdat dit ervoor kan zorgen dat delicate kwartswafers vervormen of barsten. Bewaar de geassembleerde apparaten in een doos bij kamertemperatuur of in een temperatuurgecontroleerde incubator. Plaats na een paar uur of dagen het kristallisatieapparaat onder een microscoop en controleer de kristalgroei.Optimaliseer indien nodig de kristallisatiecondities zoals beschreven in het manuscript. Installeer voor kalibratie een dun YAG-kristal op de chiphouder en installeer vervolgens de bundelstop. Open vervolgens de Insitux-software en voer het aangegeven programma uit om röntgenfluorescentiebeelden te maken van de directe straal waarbij het apparaat een door de gebruiker geselecteerde naam is voor het kristallisatieapparaat en -apparaat.param is de bestandsnaam die apparaatspecifieke besturingsparameters bevat. Zoek vervolgens de precieze positie van de directe röntgenstraal door het bundelprofielaanpassingsprogramma uit te voeren waarbij het brandbeeld de bestandsnaam is van het röntgenfluorescentiebeeld. Voor optisch scannen plaatst u een kristallisatieapparaat in de chiphouder en bevestigt u het met een duimschroef.Monteer vervolgens de chiphouder op de vertaalfase van de diffractometer via een kinematisch mechanisme. Afhankelijk van de lichtgevoeligheid van het eiwitmonster en het doel van het experiment, installeert u een witte of infrarode lichtbron om microfoto's te maken van het optische venster van het apparaat. Zodra de installatie klaar is, voert u het scanprogramma uit door de aangegeven opdracht in te voeren voor scannen in beweging op de straallijn.Voer vervolgens het tegelprogramma uit op een gebruikerscomputer waarbij x de beginwaarde voor de kolom is en y de beginwaarde voor frauduleuze verplaatsingen van micrografieën. Het programma voegt alle microfoto's samen in een montage van één tot drie micrometer pixelresolutie. Nadat u de microfoto's hebt gestikt, voert u de aangegeven opdracht in om het kristalzoekprogramma uit te voeren.Dit programma voert kristalherkenning en schotplanning uit en de belangrijkste parameters in dit programma maken specifieke kristalselectie en doelplanning mogelijk. Verwijder de lichtbron en plaats de bundelstop. Voer vervolgens het programma voor gegevensverzameling uit voor seriële diffractie.De voorgestelde opdracht activeert gegevensverzameling door de geplande opnamen in een voorgeprogrammeerde volgorde te bezoeken. Elk gericht kristal wordt verplaatst naar de straalpositie. Bij elke stop wordt röntgenblootstelling genomen met of zonder laserverlichting met een geplande tijdsvertraging.In de studie werden de kristallisatiecondities tussen dampdiffusie en een on-chip batch vergeleken. Vier casestudy's van on-chip kristallisatie en representatieve datasets die rechtstreeks van kwartsapparaten zijn verzameld, worden hier gedemonstreerd. De dynamische kristallografie-experimenten onthulden door licht geïnduceerde veranderingen in verrood fotoreceptoreiwit door gegevens te vergelijken van 4.352 kristallen in het donker en 8.287 kristallen na lichtverlichting.De donkere dataset van in situ seriële Laue-diffractie resulteerde in beter opgeloste elektronendichtheden, waardoor zelfverzekerde modelvorming van een bilinchromofoor in een volledig Z-tekenconformatie mogelijk werd. De door licht geïnduceerde verschilkaarten hebben gecoördineerde bewegingen in het centrale bètablad onthuld, wat het belang suggereert van de pi-pi-stapeling tussen de pyrroolringen van de chromofoor en verschillende aromatische residuen. Dit platform heet Insitux.Het unieke voordeel van dit platform is dat men geen kristalmanipulatie hoeft te doen zodra de kristallisatie is voltooid. Het is noodzakelijk om veel datasets te verzamelen onder veranderende omstandigheden om de eiwitbewegingen vast te leggen. En dit wordt mogelijk met Insitux omdat het grootschalige gegevensverzameling van duizenden eiwitkristallen bij kamertemperatuur mogelijk maakt.Met deze nieuwe mogelijkheid, waaronder kristallografie, kunnen de lichtgevoelige systemen in het apparaat worden geactiveerd en kan het lichtinerte systeem worden bestudeerd als het kristal-op-kristalapparaat wordt omgezet in uitstromen.

on-chip-crystallization-large-scale-serial-diffraction-at-room

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dit protocol beschrijft in detail hoe te fabriceren en te exploiteren van microfluidic apparaten voor röntgendiffractie gegevensverzameling bij kamertemperatuur. Bovendien, het beschrijft hoe eiwitten kristallisatie controleren door Dynamische lichtverstrooiing en hoe om te verwerken en analyseren diffractie gegevens verkregen.

Microfluidic Chips voor In Situ Crystal röntgendiffractie en In Situ Dynamische lichtverstrooiing voor seriële kristallografie

Dit artikel beschrijft het fabricageprotocol van microfluïdische chips ontwikkeld voor on-chip eiwitkristallisatie met de dialysemethode en in situ röntgendiffractie-experimenten. Het microfabricatieproces maakt het mogelijk om een semipermeabel geregenereerd cellulosedialysemembraan te integreren met elke moleculaire gewichtsafsnijd, tussen twee lagen van de chip.

Kristallisatie van eiwitten op chip door microdialyse voor in Situ röntgendiffractiestudies

Een veelzijdig microfluïdisch apparaat wordt beschreven dat de kristallisatie van een enzym mogelijk maakt met behulp van de contradiffusiemethode, de introductie van een substraat in de kristallen door weken en de 3D-structuurbepaling van het enzym: substraatcomplex door een seriële analyse van kristallen in de chip bij kamertemperatuur.

Kristallisatie en structurele bepaling van een enzym: substraatcomplex door seriële kristallografie in een veelzijdige microfluïdische chip

We presenteren een protocol voor de kristallisatie van eiwitten met behulp van de kristallisatiefaciliteit in het Research Complex in Harwell en de daaropvolgende in situ röntgenkristallografische gegevensverzameling van kristallen in de platen bij Diamond's Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) beamline. We beschrijven monstervereisten, kristallisatieprotocollen en richtlijnen voor gegevensverzameling.

Kristallisatie en in situ verzameling van gegevens over kamertemperatuur met behulp van de kristallisatiefaciliteit in Harwell en Beamline VMXi, Diamond Light Source

We beschrijven procedures voor de bereiding en aflevering van membraaneiwitmicrokristallen in lipidische kubieke fase voor seriële kristallografie bij röntgenvrije-elektronlasers en synchrotronbronnen. Deze protocollen kunnen ook worden toegepast voor de incorporatie en aflevering van oplosbare eiwitmicrokristallen, wat leidt tot een aanzienlijk verminderde sampleconsumptie in vergelijking met vloeibare injectie.

Voorbereiding en Levering van Protein Microcrystals in lipidische Cubic fase voor Serial Femtoseconde Kristallografie

Geautomatiseerde systemen en protocollen voor de routinematige bereiding van een groot aantal schermen en nanoliter kristallisatie druppels voor damp diffusie experimenten zijn beschreven en besproken.

Geautomatiseerd protocollen voor macromoleculaire kristallisatie bij het MRC Laboratory of Molecular Biology

Een protocol wordt gepresenteerd voor röntgenkristallografie onder toepassing van eiwitmicrokristallen. Twee voorbeelden die in vivo- gegroeide microkristallen analyseren na zuivering of in cellulose worden vergeleken.

Microkristallografie van eiwitkristallen en<em&gt; In Cellulo</em&gt; Diffractie

Dit protocol beschrijft een methode voor de grootschalige teelt van Caenorhabditis elegans op solide media. Als alternatief voor vloeibare cultuur kunnen dit protocol verkrijgen van parameters voor verschillende schalen onder plaat gebaseerde teelt. Dit verhoogt de vergelijkbaarheid van de resultaten door het weglaten van de morfologische en metabole verschillen tussen vloeibare en vaste mediacultuur.

Plaat gebaseerde grootschalige teelt van Caenorhabditis elegans: bereiding van de monsters voor de studie van de metabole veranderingen bij Diabetes

Elektron paramagnetisch resonantie (EPR) spectroscopie is een eenduidige methode voor het meten van vrije radicalen. Het gebruik van selectieve spin sondes zorgt voor detectie van vrije radicalen in andere cellulaire compartimenten. Presenteren we een praktische, efficiënte methode voor het verzamelen van biologische monsters die behandeling, opslaan en overzetten van monsters voor EPR metingen te vergemakkelijken.

Gebruik van Electron paramagnetisch resonantie in biologische monsters bij kamertemperatuur en 77 K

Hier presenteren we een protocol voor de productie van grote hoeveelheden van recombinante RNA in Escherichia coli mede uitspreken een chimeer RNA waarin het RNA van belang in een Viroïde steiger en een plant tRNA ligase. Het hoofdproduct is een circulaire molecuul dat zuivering aan homogeniteit wordt vergemakkelijkt.

De grootschalige productie van recombinante RNAs op een circulaire steiger met behulp van een systeem van Viroïde afkomstige in Escherichia coli

Leer eiwitkristallisatie op een chip-apparaat voor röntgendiffractie bij kamertemperatuur. Deze methode maakt geautomatiseerde datacollectie mogelijk zonder fysiek contact met de kristallen.

On-chip kristallisatie en grootschalige seriële diffractie bij kamertemperatuur

Meer video's verkennen