On-chip kristallisatie en grootschalige seriële diffractie bij kamertemperatuur

Dit protocol demonstreert eiwitkristallisatie op een chipachtig apparaat in röntgendiffractiegegevensherinnering. Dit apparaat wordt een kristal-op-kristal genoemd omdat eiwitkristallen groeien op een enkel kwartskristal. Na succesvolle groei van eiwitkristallen op dergelijke apparaten worden duizenden diffractiebeelden verzameld van elk apparaat bij kamertemperatuur zonder zelfs de eiwitkristallen aan te raken.

Röntgendiffractie bij kamertemperatuur is zeer essentieel voor het bestuderen van de eiwitfunctie waarbij veel conformatietoestanden betrokken zijn. Deze informatieve eiwitveranderingen of eiwitwerkingen kunnen worden bevroren, dus niet detecteerbaar in cryo-kristallografie. Deze apparaten kunnen worden gebruikt om door licht geïnduceerde signaleringsprocessen en redoxveranderingen te bestuderen.

Slechts een handvol apparaten geeft complete en redundante datasets. Om de voormontage van het apparaat te starten, labelt u de buitenste ring voor de monsteridentificatie. Vermeld de projectnaam, het apparaatnummer, de kristallisatievoorwaarde en de gewenste datum.

Plaats vervolgens de gelabelde ring ondersteboven op een schoon oppervlak en plaats een kwartswafer in de buitenste ring. Giet vervolgens een kleine hoeveelheid microscoop-dompelolie in een petrischaal en dompel een shim in de olie om ervoor te zorgen dat beide zijden van de shim goed zijn gecoat. Verwijder overtollige olie door de shim op een schoon oppervlak te deppen.

Leg vervolgens de geoliede shim op de eerste kwartswafer. Meng de eiwitoplossing en kristallisatiebuffer op de eerste kwartswafer met behulp van een pipet. Probeer luchtbellen te vermijden bij het mengen.

Het totale volume van de kristallisatieoplossing mag de maximale capaciteit van de kristallisatiekamer, bepaald door de grootte en dikte van de shim, niet overschrijden. Leg de tweede kwartswafel over de gemengde oplossing. De oplossing zal zich spontaan verspreiden.

Tik vervolgens de tweede kwartswafel lichtjes op de rand om de olie te verspreiden terwijl de lucht naar buiten wordt geduwd. Bevestig het apparaat door een bevestigingsring in de buitenste ring te schroeven. Gebruik indien nodig een aanhaalgereedschap.

Vermijd overspannen, omdat dit ervoor kan zorgen dat delicate kwartswafers vervormen of barsten. Bewaar de geassembleerde apparaten in een doos bij kamertemperatuur of in een temperatuurgecontroleerde incubator. Plaats na een paar uur of dagen het kristallisatieapparaat onder een microscoop en controleer de kristalgroei.

Optimaliseer indien nodig de kristallisatiecondities zoals beschreven in het manuscript. Installeer voor kalibratie een dun YAG-kristal op de chiphouder en installeer vervolgens de bundelstop. Open vervolgens de Insitux-software en voer het aangegeven programma uit om röntgenfluorescentiebeelden te maken van de directe straal waarbij het apparaat een door de gebruiker geselecteerde naam is voor het kristallisatieapparaat en -apparaat.

param is de bestandsnaam die apparaatspecifieke besturingsparameters bevat. Zoek vervolgens de precieze positie van de directe röntgenstraal door het bundelprofielaanpassingsprogramma uit te voeren waarbij het brandbeeld de bestandsnaam is van het röntgenfluorescentiebeeld. Voor optisch scannen plaatst u een kristallisatieapparaat in de chiphouder en bevestigt u het met een duimschroef.

Monteer vervolgens de chiphouder op de vertaalfase van de diffractometer via een kinematisch mechanisme. Afhankelijk van de lichtgevoeligheid van het eiwitmonster en het doel van het experiment, installeert u een witte of infrarode lichtbron om microfoto's te maken van het optische venster van het apparaat. Zodra de installatie klaar is, voert u het scanprogramma uit door de aangegeven opdracht in te voeren voor scannen in beweging op de straallijn.

Voer vervolgens het tegelprogramma uit op een gebruikerscomputer waarbij x de beginwaarde voor de kolom is en y de beginwaarde voor frauduleuze verplaatsingen van micrografieën. Het programma voegt alle microfoto's samen in een montage van één tot drie micrometer pixelresolutie. Nadat u de microfoto's hebt gestikt, voert u de aangegeven opdracht in om het kristalzoekprogramma uit te voeren.

Dit programma voert kristalherkenning en schotplanning uit en de belangrijkste parameters in dit programma maken specifieke kristalselectie en doelplanning mogelijk. Verwijder de lichtbron en plaats de bundelstop. Voer vervolgens het programma voor gegevensverzameling uit voor seriële diffractie.

De voorgestelde opdracht activeert gegevensverzameling door de geplande opnamen in een voorgeprogrammeerde volgorde te bezoeken. Elk gericht kristal wordt verplaatst naar de straalpositie. Bij elke stop wordt röntgenblootstelling genomen met of zonder laserverlichting met een geplande tijdsvertraging.

In de studie werden de kristallisatiecondities tussen dampdiffusie en een on-chip batch vergeleken. Vier casestudy's van on-chip kristallisatie en representatieve datasets die rechtstreeks van kwartsapparaten zijn verzameld, worden hier gedemonstreerd. De dynamische kristallografie-experimenten onthulden door licht geïnduceerde veranderingen in verrood fotoreceptoreiwit door gegevens te vergelijken van 4.352 kristallen in het donker en 8.287 kristallen na lichtverlichting.

De donkere dataset van in situ seriële Laue-diffractie resulteerde in beter opgeloste elektronendichtheden, waardoor zelfverzekerde modelvorming van een bilinchromofoor in een volledig Z-tekenconformatie mogelijk werd. De door licht geïnduceerde verschilkaarten hebben gecoördineerde bewegingen in het centrale bètablad onthuld, wat het belang suggereert van de pi-pi-stapeling tussen de pyrroolringen van de chromofoor en verschillende aromatische residuen. Dit platform heet Insitux.

Het unieke voordeel van dit platform is dat men geen kristalmanipulatie hoeft te doen zodra de kristallisatie is voltooid. Het is noodzakelijk om veel datasets te verzamelen onder veranderende omstandigheden om de eiwitbewegingen vast te leggen. En dit wordt mogelijk met Insitux omdat het grootschalige gegevensverzameling van duizenden eiwitkristallen bij kamertemperatuur mogelijk maakt.

Met deze nieuwe mogelijkheid, waaronder kristallografie, kunnen de lichtgevoelige systemen in het apparaat worden geactiveerd en kan het lichtinerte systeem worden bestudeerd als het kristal-op-kristalapparaat wordt omgezet in uitstromen.