Karakterisering van neuromusculaire juncties bij muizen door gecombineerde confocale en superresolutiemicroscopie

Dit protocol helpt kwantitatief de 3D-structuur van neuromusculaire juncties te analyseren met een resolutie die dicht bij elektronenmicroscopie ligt met behulp van een eenvoudige procedure. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat spiermonsters op dezelfde manier worden verwerkt en immunoactief worden gelabeld voor confocale en SOA-microscopie, waardoor de tijd voor nauwkeurige neuromusculaire junctiestructuurevaluatie in diermodellen wordt verkort. De morfologische kwantificering die we hebben ontwikkeld, kan eenvoudig worden aangepast om andere subcellulaire structuren te analyseren.

Het is mij een genoegen om Dr. Martina Marinello voor te stellen, een wetenschapper uit mijn team die zal laten zien hoe spierpesten en immunostainings worden uitgevoerd en enkele aanbevelingen zal geven voor de succesvolle toepassing van dit protocol. Ik ben verheugd om Dr.Jeremie Cosette van Genethon's beeldvormingsplatform te introduceren die beeldacquisitie en -analyse zal tonen met behulp van confocale en STED-microscopen. Begin na euthanasie met het plagen van de tibialis anterieure spieren in kleine vezelbundels van ongeveer een millimeter breed met behulp van twee fijne gekartelde tangen.

Breng vervolgens deze spierbundels over in een 24-wells plaat met 1% Triton X-100 bereid in PBS en laat het een uur zachtjes roeren bij kamertemperatuur of vijf uur bij vier graden Celsius. Na het driemaal wassen van de monsters gedurende vijf minuten met PBS bij kamertemperatuur, incubeer de monsters met een blokkerende oplossing bestaande uit 4% BSA bereid in PBS met 1% Triton X-100 gedurende vier uur bij vier graden Celsius onder zachte agitatie. Incubeer vervolgens de monsters 's nachts met dezelfde blokkerende oplossing die primaire monoklonale antilichamen bevat tegen neurofilament M of synaptisch blaasjeglycoproteïne 2 om respectievelijk presynaptische axonterminals of actieve zones te labelen.

Was de volgende dag de gelabelde spierbundels drie keer gedurende vijf minuten met PBS onder zachte agitatie. Incubeer ze vervolgens met geschikte secundaire antilichamen door ze twee uur op een shaker bij kamertemperatuur te plaatsen. Nadat je de spierbundels opnieuw hebt gewassen, plaats je ze op een schuif met bevestigingsmedium.

Plaats vervolgens een glazen afdekslip van 1,5 kwaliteit aan de bovenkant, gevolgd door cilindrische magneten aan beide zijden van de glijbaan om druk uit te oefenen en de spieren af te vlakken. Om beelden te verkrijgen met behulp van de confocale microscoop, start u de microscoopsoftware en kiest u de machine als configuratiemodus en verzamelt u beeldstapels van de neuromusculaire juncties in elke experimentele groep volgens de instellingen die in het tekstmanuscript worden vermeld. Klik aan het einde van de sessie op Openen in 3D-viewer en kies een neuromusculaire junctie die representatief is voor een experimentele groep om de 3D-labeling te visualiseren.

Om post-synaptische neuromusculaire junctie en plaatvolume, maximale intensiteit projectiegebied en relatieve tortuositeit te berekenen, sleept u de macro voor neuromusculaire junctievolumekwantificering naar het Image J-venster en wanneer de macro in een tweede venster wordt geopend, klikt u op Macro's en Macro uitvoeren. Selecteer de native map met de junction submappen die geanalyseerd moeten worden en klik op Select( Selecteren). Selecteer vervolgens in het pop-upmenu van de opslagmap de opslagmap en klik op Selecteren.

Selecteer in het nieuwe pop-upmenu Met de naam Afbeeldingstype de indeling van de Z-stackaankopen. Selecteer het RGB-kanaal dat overeenkomt met de kleuring van belang en geef X, Y pixelgrootte en Z stap aan. Als eigen bestandsindelingen zijn geselecteerd, leest de macro rechtstreeks de pixelgrootte en de Z-stap.

Om presynaptische neurofilamentaccumulatie te kwantificeren, sleept u de macro voor neuromusculaire junctieaccumulatiekwantificering naar het afbeelding J-venster en klikt u op Macro's en Macro uitvoeren. Selecteer de junction-submappen, opslagmap en de indeling van de Z-stackaankopen zoals eerder gedemonstreerd. Geef vervolgens in de pop-up Kleuring Infos het pre-synaptische en post-synaptische label en de kleur aan en klik op OK.In de pop-up Pixelgrootte, geef de X- en Y-pixelgrootte aan als 0,072 micrometer, de Z-stap als 0,5 micrometer en klik op OK. Als eigen bestandsindelingen zijn geselecteerd, leest de macro rechtstreeks de pixelgrootte en de Z-stap.

Als u de afstand tussen de acetylcholinereceptorstrepen wilt berekenen, selecteert u het menu Kwantificeren boven in het centrale venster. Klik op het tabblad Extra, selecteer intensiteit en klik op het pictogram van het regelprofiel. Stel Oversampling in op één en vink Sorteerkanalen aan.

Klik op het tabblad Projecten openen en selecteer de gefilterde afbeelding die u wilt analyseren. Klik vervolgens op het tekenlijnpictogram en traceer een lijn die loodrecht verschillende strepen of junctionele plooien kruist. Klik op de bovenkant van de eerste piek en beweeg de muisaanwijzer terwijl u op de linkermuisknop drukt totdat de volgende maximale piek is bereikt.

Let op de DX-waarde, die overeenkomt met de afstand tussen de twee pieken. Klik met de rechtermuisknop in de afbeelding van het rechtervenster en selecteer ROIs opslaan. Nadat u op het pijlpictogram hebt geklikt, klikt u op de ROI en verwijdert u deze door op het prullenbakpictogram te klikken.

Voor het berekenen van de breedte van de acetylcholinereceptorstreep selecteert u intensiteit in het linkerbovenhoekpaneel onder het tabblad Gereedschappen, klikt u op het pictogram FWHM bepalen en vinkt u de sorteerkanalen aan. Klik vervolgens op het tabblad Projecten openen en selecteer de gefilterde afbeelding die moet worden geanalyseerd. Klik vervolgens op het tekenrechthoekpictogram in het bovenste menu van het rechtervenster.

Selecteer een horizontale of verticale streep en teken een rechthoek loodrecht op de streep. Er verschijnt een profiel in het centrale venster. Klik op verticaal of horizontaal van het menu Gemiddelde projectie in het linkerdeelvenster, afhankelijk van of de streepstand verticaal of horizontaal is.

Klik op de statistieken in het centrale venster om de FWHM-waarde te lezen en sla vervolgens de ROI's op en verwijder deze zoals eerder gedemonstreerd. De post-synaptische motoreindplaat, gelabeld met fluorescerend alfa-Bungarotoxine, leek kleiner en gefragmenteerd in de mutanten van twee muislijnen. Kwantificering van de neuromusculaire junctie Z-stacks met behulp van de aangepaste Image J-macro's onthulde een duidelijke afname van het eindplaatvolume, maximale intensiteitsprojectie en relatieve tortuositeit in beide ziektemuismodellen in vergelijking met controles, wat wijst op neuromusculaire junctierijpingsdefecten.

Het kwantificeren van de presynaptische axon terminale branch distributie met behulp van de Image J aangepaste macro onthulde een veranderd patroon in neurofilament M-distributie in de twee diermodellen met verhoogde immunolabeling. Door synaptische blaasjesglycoproteïne 2-kleuring werd een vermindering van 43% van de bezettingsgraad van de acetylcholinereceptorbevattende regio's met aangrenzende zenuwterminale actieve zones waargenomen in Smn 2B / muizen. Het aspect van de neuromusculaire junction postsynaptische eindplaten werd duidelijk gevisualiseerd door fluorescerende alfa-Bungarotoxine-etikettering en intensiteitsprofielanalyse.

Evaluatie van de neuromusculaire junctieparameters onthulde een toename van de junctionele vouwafstand en breedte van acetylcholinereceptorstrepen in de gastrocnemiusspier van de mutanten. Om betrouwbare resultaten te verkrijgen, is het cruciaal om spieren goed te plagen, met bijzondere aandacht voor de toegepaste kracht om spierbundels te scheiden. Dit protocol kan helpen bij het verkrijgen van een meer diepgaande morfologische karakterisering van neuromusculaire junctie, die voorheen alleen werd verklaard door complexe en tijdrovende procedures, zoals transmissie-elektronenmicroscopie.

De SOA-beeldvormingsprocedure maakte de weg vrij voor het onderzoek naar nieuwe inzichten met betrekking tot pre- en post-synaptische markers, die bijdragen aan de pathofysiologie van ziekten die de neuromusculaire junctie beïnvloeden.