Techniek voor het verkrijgen van mesenchymale stamcel uit vetweefsel en stromale vasculaire fractiekarakterisering bij cryopreservatie op lange termijn
30 december 2021
Het huidige protocol beschrijft een verbeterde methodologie voor ADSC-isolatie, wat resulteert in een enorme cellulaire opbrengst met tijdwinst in vergelijking met de literatuur. Deze studie biedt ook een eenvoudige methode voor het verkrijgen van een relatief groot aantal levensvatbare cellen na cryopreservatie op lange termijn.
Hier hebben we het protocol gedemonstreerd voor het verkrijgen en behouden van de goede en levensvatbare cellen voor gebruik van therapeutische stappen, zoals de infusie van pluripotente mesenchymale cellen. Het belangrijkste voordeel hiervan is dat we met behulp van deze techniek het levensvatbare celvolume kunnen verkrijgen versus de tijd die is gewonnen in de isolatiestap van de cellen uit het verzamelde weefsel. Deze techniek kan worden uitgebreid naar alle ziekten of aandoeningen waarbij heterogene geneeskunde en celtherapie worden toegepast.
Deze methode kan ook worden toegepast op cytogenomische stabiliteitstests op gebieden zoals het testen van geneesmiddelen, waar celculturen op lange termijn kunnen worden aangemoedigd. Wanneer je de levende cellen manipuleert, wees dan kalm en zelfverzekerd. Wees uiterst voorzichtig met sepsis en wees constant alert met de ogen van een wetenschapper om eventuele tegenspoed te observeren en goede beslissingen te nemen.
Begin met het wegen van de zak en het meten van de temperatuur met een digitale contactloze infrarood klinische thermometer. Laat de zak vijf minuten in de laminaire stromingskamer om de vetmestende lagen neer te slaan en het weefsel met de cellen te scheiden. Injecteer 100 milliliter DPBS met calcium in de transferzak en meng deze met de handen.
Laat het vijf minuten staan. Gebruik vervolgens een spuit van 60 milliliter die aan de zakadapter is bevestigd om het grootste deel van de basale vloeistof die neerslaat weg te gooien. Herhaal dit proces twee keer.
Voeg 100 milliliter van de verteeroplossing toe aan de zak en laat deze 30 minuten onder langzaam roeren op 37 graden Celsius staan. Breng vervolgens alle inhoud van de zak over naar vier conische buizen van 50 milliliter en centrifugeer ze gedurende 10 minuten bij 22 graden Celsius op 400 G. Gooi het supernatant weg en voeg 5 milliliter DMEM lage glucose aangevuld met 20% foetaal runderserum toe aan de celpellet.
Meng een verse oplossing van 10 microliter trypanblauw op 0,05% in gedestilleerd water met 10 microliter cellulaire suspensie gedurende vijf minuten. Gebruik een microscoop met omgekeerd licht bij een vergroting van 20x en tel de levensvatbare cellen in een Neubauer-celtelkamer. Suspensie van de celpellet in een cryo-beschermend medium in een concentratie van 1 miljoen cellen per milliliter.
Plaats vervolgens 1 milliliter van dit mengsel in cryoflacons. Gebruik een vriescontainer met een koelsnelheid van 1 graad Celsius per minuut en bewaar een jaar bij 80 graden Celsius. Bewaar het na een jaar in standaard cassettedozen ondergedompeld in vloeibare stikstofdampfase.
Gegevens uit verschillende stappen van de procedure van de negen patiënten worden in deze tabel gepresenteerd. Volgens de initiële cellulaire opbrengst werd een variabel volume cellen voor elk monster bepaald. 1 milliliter monsters met een hogere celopbrengst, 1,1 milliliter voor monsters met een intermediaire celopbrengst en 2 milliliter per monster met een lagere celopbrengst.
De cellulaire opbrengst vóór passage één varieerde in grote lijnen, zelfs wanneer dezelfde samenvloeiing vóór trypsinisatie werd waargenomen. Daarom kunnen de cellen hier in lagen zijn gegroeid. De representatieve afbeelding toont de plastic-adherente mesenchymale ADSC's bij de eerste passage na isolatie bij lichtmicroscopie.
De cellen vertonen hechting aan de plastische en fibroblastachtige morfologie. De levensvatbare cellen die in de Neubauer-kamer in trypanblauwe assay zijn geteld, worden hier weergegeven. De flowcytometriegegevens van zes patiënten worden in deze tabel gepresenteerd.
Uit deze CD45-negatieve cellen werd het percentage ADSC's met verschillende combinaties van stamcelmarkers bepaald. De representatieve beelden tonen de subpopulatie van cellen die positief zijn voor stamcel-geassocieerde markers in SVF van geval negen na acht maanden cryo-conservering. Hier is R1 het totale cellulaire gebied dat wordt geanalyseerd in de forward scatter versus side scatter plot.
En R2 is het CD45-negatieve gebied. CD73-, CD90- en CD105-populaties zijn positief in deze regio. ADSC-differentiatie in chondrocyten, osteocyten en adipocyten worden hier weergegeven.
Vergeet bij het proberen van deze procedure niet om langzaam te roeren, bij voorkeur met de handen, terwijl u gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius blijft om de verklevingen en blaarvorming te observeren. Houd de werkkamertemperatuur rond de 25 graden Celsius en vermijd elke thermische schok bij veel grotere temperaturen. De techniek die we hier hebben laten zien, kan worden gebruikt om de pluripotente mesenchymale cellen met succes uit andere weefsels te isoleren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een verbeterde methodologie voor het isoleren van adipose-afgeleide stamcellen (ADSC's), waarmee een hogere celopbrengst en een kortere doorlooptijd worden gerealiseerd in vergelijking met de bestaande literatuur. Daarnaast wordt er een methode gedetailleerd voor het verkrijgen van een aanzienlijk aantal levensvatbare cellen na langdurige cryopreservatie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Stamcelonderzoek
- Therapeutische toepassingen
Achtergrond
- ADSC's zijn waardevol voor de regeneratieve geneeskunde.
- Isolatietechnieken kunnen de celviabiliteit en het rendement beïnvloeden.
- Cryopreservatie op lange termijn is cruciaal voor de opslag van cellen.
- Toepassingen in celtherapie vereisen hoogwaardige celpopulaties.
Doel van de studie
- Om het isolatieproces van ADSC's te optimaliseren.
- Om de levensvatbaarheid van cellen na cryopreservatie te verbeteren.
- Om een betrouwbare methode te bieden voor therapeutische toepassingen.
Gebruikte methoden
- Isolatie van ADSC's uit verzameld weefsel.
- Beoordeling van de cellevensvatbaarheid na cryopreservatie.
- Toepassing van de methode in therapeutische contexten.
- Monitoring van de cytogenomische stabiliteit tijdens de kweek.
Belangrijkste resultaten
- Significante toename van de opbrengst aan levensvatbare cellen.
- Vermindering van de benodigde tijd voor celisolatie.
- Succesvolle langetermijnbewaring van de cellevensvatbaarheid.
- Potentiële toepassingen in diverse therapeutische gebieden.
Conclusies
- Het verbeterde protocol is effectief voor de isolatie van ADSC's.
- Langdurige cryopreservatie kan de celviabiliteit behouden.
- Deze methode ondersteunt vorderingen in celtherapie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Efficiënte isolatie en langdurige cryopreservatie van uit vetweefsel afgeleide mesenchymale stamcellen (ADSC's) hebben een directe impact op de schaalbaarheid en betrouwbaarheid van celgebaseerd onderzoek en preklinische ontwikkeling. Dit protocol maakt hogere opbrengsten aan levensvatbare cellen en een robuuste viabiliteit na langdurige bewaring mogelijk, wat translationele workflows en de continuïteit van biofarmaceutische pijplijnen ondersteunt. Betrouwbare toegang tot goed gekarakteriseerde ADSC's vormt de basis voor voorspellend vertrouwen in vroege ontdekking en downstream therapeutische modellering.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt robuuste werving van levensvatbare ADSC's mogelijk voor hypothese-gestuurde analyse van signaalpaden.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door het leveren van consistente, hoogwaardige celpopulaties.
- Faciliteert functionele targetvalidatie door reproduceerbare celexpansie en differentiatie.
Screening & Assayontwikkeling
- Levert gestandaardiseerde, cryopreserveerde ADSC's voor de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van assays.
- Verbetert de betrouwbaarheid van de kwantitatieve output door de celviabiliteit na het ontdooien te behouden.
- Maakt de preparatie van gevalideerde biologische systemen mogelijk voor het screenen en evalueren van verbindingen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ondersteunt ziekterelevante modellering door toegang tot multipotente ADSC's na langdurige opslag te waarborgen.
- Handhaaft translationele continuïteit vanaf de celbron tot en met de preklinische validatiefasen.
- Vermindert het risico op biologische variabiliteit in preklinische studies door de kwaliteit van de celinput te standaardiseren.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol integreert alle fasen van vroege ontdekking tot preklinisch onderzoek, waardoor een consistente levering van ADSC's mogelijk wordt voor targetvalidatie, assayontwikkeling en translationele studies.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetests en het verduidelijken van pathways met betrouwbare ADSC-populaties.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve input voor celgebaseerde assays na cryopreservatie.
- Analytics: Biedt gegevens over levensvatbaarheid en immunofenotypering om de celkwaliteit over verschillende batches te benchmarken.
- Translationeel Onderzoek: Waarborgt de continuïteit van celkenmerken voor ziektemodellering en biomarkerstudies.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbare, cryopreserveerde ADSC-bron voor meerdere R&D-programma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in celgebaseerde studies.
- Operationele waarde: Standaardiseert celisolatie en -opslag, waardoor de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid worden verbeterd.
- Strategische waarde: Maakt betere go/no-go-beslissingen mogelijk door een consistente celkwaliteit en levensvatbaarheid te waarborgen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogebaseerde prioritering en verdere ontwikkeling van celgebaseerde therapeutische programma's.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in aseptische technieken en celkweek voor optimale resultaten.
- Toegang tot infrastructuur voor gecontroleerd invriezen en opslag in vloeibare stikstof is noodzakelijk.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor protocollen voor het tellen van cellen en het beoordelen van de levensvatbaarheid.
- Aanpassingen kunnen nodig zijn voor verschillende weefselbronnen of modelsystemen.
- De levensvatbaarheid neemt af bij langdurige cryopreservatie, wat monitoring bij langetermijnopslag vereist.
Veelgestelde vragen over biofarmacie
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:21
Processing of Lipoaspirate
2:29
Counting of the SVF Cells
3:19
Results: Morphology and Viability of ADSCs, bthe Subpopulation of Cells Positive for Stem Cell-Associated Markers in SVF, and the Differentiation Assay
5:05
Conclusion
