Digitale druppel PCR-methode voor de kwantificering van AAV-transductie-efficiëntie in murine retina

In deze video laten we zien hoe aav-transductie in het netvlies van muizen kan worden gekwantificeerd met behulp van de digitale druppel-PCR-methode, die extreem gevoelig is en absolute kwantificering van het doel-DNA doet. We hebben deze methode voornamelijk ontwikkeld voor grote AVV-constructies waarmee we geen reportage-gen zoals CRISPR-gebaseerde constructen kunnen gebruiken. Door deze methode te gebruiken, kunnen we eenvoudig de transductiesnelheid van AAV's in het netvlies kwantificeren.

Deze methode is gebaseerd op gevoeligheid en absolute kwantificering van de digitale druppel PCR en levert eenvoudige resultaten op. In deze video laten we zien hoe aav-transductie in het netvlies van muizen kan worden gekwantificeerd met behulp van de digitale druppel-PCR-methode, die extreem gevoelig is en absolute kwantificering van het doel-DNA doet. We hebben deze methode voornamelijk ontwikkeld voor constructies met een groot gebied waarmee we geen reportage-gen zoals CRISPR-gebaseerde constructies kunnen gebruiken.

Door deze methode te gebruiken, kunnen we eenvoudig de transductiesnelheid van AAV's in het netvlies kwantificeren. Deze methode is gebaseerd op gevoeligheid en absolute kwantificering van de twee druppels PCR en levert eenvoudige resultaten op. Vanwege de efficiëntie van de digitale druppel PCR-methodologie schakelen verschillende laboratoria al over van kwantitatieve real-time PCR naar digitale druppel-PCR- of AAV-titrering.

Deze methode kan ook een basis bieden voor mitochondriale DNA-kwantificering in het netvlies, evenals het controleren van de efficiëntie van de op CRISPR gebaseerde mutatiecorrectie voor gentherapie in het netvlies van de muis. Bereid transfectiemengsel met AAV-helperplasmide, AAV-capsidplasmide, AAV-vector en PI-oplossing in vijf milliliter vraag. Voeg de vijf milliliter bereide transfectiemengsel toe aan kweekmedia.

Incubeer getransfecteerde cellen bij 37 graden Celsius. Verzamel de media 48 tot 60 uur na transfectie. Verteer de media met DNA's in een eindconcentratie van 250 eenheden per milliliter gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius en centrifugeer het gedurende 30 minuten bij 4.000 g vier graden Celsius.

Bevochtig het geregenereerde cellulosemembraan voor met PBS. Filtreer de media met 0,22 micrometer spuitfilter in het voorbevochtigde geregenereerde cellulosemembraan voor 100 kilo Dalton. Centrifugeer het geregenereerde cellulosemembraan bij 4.000 G vier graden Celsius gedurende 30 minuten en gooi de media weg.

Was en centrifugeer het geregenereerde cellulosemembraan met PBS dat 0,001% pluronic F68 bevat driemaal bij 4000 G vier graden Celsius gedurende 30 minuten. Verzamel geconcentreerde AAV's uit het bovenste deel van het geregenereerde cellulosemembraan en wijs toe voor verder gebruik. Hier hebben we laten zien hoe je een kleinschaligere AAV-productie kunt maken.

Na het doorlichten van dit protocol, zou u avv's moeten kunnen maken die voldoende zijn om de expressie van de verslaggever in het netvlies te zien. U kunt ook het protocol voor digitale PCR volgen om de AAV's te kunnen titeren. Breng een druppel van 0,5% tropicamide en 2,5% fenylefrinehydrochloride bevattende oogdruppel vóór anesthesie aan om pupillen te verwijden.

Verdoof muizen met isofluraan en verifieer de reflexen. Breng 0,3% tobramycine en 0,1% dexamethason steriele oogdruppel van de oogdruppel aan op elk oog vóór de injectieprocedure. Gebruik de chirurgische haak om het bovenste ooglid te stabiliseren.

Trek iets naar achteren om het dorsale deel van het oog bloot te leggen. Plak de haak vast aan de band om op zijn plaats te houden. Verwijder conjunctiva met de gebogen irisschaar om de sclera van het oog bloot te leggen.

Gebruik een verse en steriele insulinespuit van 30 G om de sclera te doorboren. Steek de naald van de microspuit door dezelfde punctie met behulp van een micromanipulator. Plaats de punt van de naald achter de lens in het midden van de oogschelp.

Injecteer een micro liter AAV-oplossing langzaam in het glasvocht van het oog. Laat de naald een minuut op zijn plaats en trek de naald langzaam terug. Breng ontstekingsremmende en antibacteriële topische gelbehandeling met 0,3% tobramycine en 0,1% dexamethason aan op de oogschelp.

Breng één druppel 0,5% tropicamide aan. En 2,5% fenylefrinehydrochloride bevattende oogdruppel vóór anesthesie om pupillen te verwijden. Breng carbamide twee milligram per gram topische gel aan op het oppervlak van de ogen.

Pas de muisstandaard indien nodig aan om het muisoog te centreren. Voer fundus- en fluorescentiebeeldvorming uit op beide ogen om de TdTomato-expressie één week en twee weken na intravitreale injectie te volgen. Euthanaseer de dieren met behulp van kooldioxide-inhalatie vóór de procedure.

Schuif de oogbol naar voren met behulp van een splittertang van 13,5 centimeter. Verwijder de lens samen met het overgebleven glasvocht. Knip de verbinding van de oogbol met de oogzenuw met een nauwkeurig gebogen tang en knijp zachtjes in het netvlies met dezelfde gebogen tang.

Isoleer genomisch DNA met een gecommercialiseerde proteïnase K verteer film-gebaseerde weefsel genomische DNA kit. Verteer het netvlies bij 55 graden Celsius 200 G gedurende 30 minuten met proteïnase K.Lyse retina volledig en volg het protocol van de fabrikant. In deze protocollen hebben we intravitreale injectie fundus florescence imaging aangetoond, evenals retina- en genomische DNA-isolatie.

Dit zijn zeer kritieke procedures voor het netvlies en door dit protocol te volgen, zou u in staat moeten zijn om de geproduceerde AAV's te injecteren en hun expressieprofiel op te volgen. En schep die transductie-efficiëntie door AAV-genomen in retinaal genomisch DNA te kwantificeren. Hier zie je de basistoepassing van digitale druppel PCR, waarbij je een absolute kwantificering kunt maken van het AAV-genoom dat transduceert in de retinale cellen.

Verdun genomische DNA's uit geïnjecteerde netvliezen in 0,05% pluronische F 68-oplossing om een eindconcentratie van één nanogram per microliter voor elk monster te bereiken. Voer druppelgeneratie uit in een PCR-reactiemix van 20 microliter, inclusief één nanogram genomisch DNA 125 nanomol primers en 2x groenblijvende supermix. Laad de monstermix naar het middelste deel van de cartridge voor het genereren van druppels.

Voeg daarna 70 microliter druppelgeneratie olie toe aan de onderste rij van de cartridge. Leg de pakking op de cartridge. Zorg ervoor dat er geen opening is tussen de pakking en de patroon.

Plaats het vervolgens in de druppelgenerator. Neem voorzichtig ongeveer 40 microliter druppels die in de bovenste bel worden gegenereerd. Voeg druppeloplossing toe aan de semi-omrande 96-Well PCR-reactieplaat.

Sluit de PCR-plaat af met een PCR-platensealer met behulp van aluminium afdichtfolie. Plaats de PCR-plaat in de 96-Well warmte afgedichte thermische cycler. Gebruik het ddPCR-protocol dat in het artikel wordt aangegeven.

Plaats de PCR-plaat in de druppellezer om gegevens te analyseren. Na het bekijken van deze video zou u in staat moeten zijn om de basis digitale PCR-techniek uit te voeren. U kunt ook gebruikte cellen met kleine hoeveelheden materiaal gebruiken, wat ideaal is voor digitale PCR-techniek.

U moet echter de hoeveelheid doel-DNA zorgvuldig aanpassen om de limiet van digitale druppel PCR niet te overschrijden. Hier is het stroomdiagram voor de experimentele procedure. We voerden kleinschalige AAV-productie uit, gevolgd door AAV-titering.

Vervolgens voerden we intravitreale injectie uit. Daarna hebben we de fluorescerende intensiteit gekwantificeerd door fundusfluorescentiebeeldvorming. Vervolgens isoleerde de netvliezen van de muis en haalde genomisch DNA uit netvliezen voor ddPCR.

Het titeren van AAV is ook van cruciaal belang om AAV-transductie correct te kunnen kwantificeren. ddPCR is afhankelijk van het genereren van druppels die de doel-AAV-genom hebben verdund. Representatieve ddPCR-resultaten tonen positieve en negatieve druppels voor het AVV-genoom.

Positief boven de drempel en negatief is eronder. Na vermenigvuldiging met de verdunningsfactoren bleek de titer van AAV's 10 tot de 12 in genoomkopieën per milliliter te zijn. Om de efficiëntie van AAV-tranductie correct te kwantificeren, werden verschillende netvliezen geïnjecteerd.

Geïnjecteerde dieren werden in beeld gebracht en de gemiddelde intensiteit van fluorescentie werd berekend. Op een tijdstip van twee weken werden de netvliezen geïsoleerd. En ddPCR werd uitgevoerd met behulp van WPRE en 18 S primers.

Fluorescentie-intensiteit van AAV-geïnjecteerde netvliezen was gecorreleerd met AAV-genoomberekeningen, wat de kracht van de methodologie aantoont. Hier hebben we verschillende technieken getoond, waaronder kleinschalige AAV-voorbereiding intravitreale injectie.