Spectrofotometrische methoden voor de studie van eukaryote glycogeenmetabolisme

De protocollen zijn belangrijk, omdat ze het gebruik van radioactieve isotopen vermijden en een barrière verwijderen die veel werknemers kan beletten enzymen van glycogeenmetabolisme te bestuderen. De beschreven procedures zijn goedkoop en vereisen alleen toegang tot een eenvoudige spectrofotometer. Om te beginnen met de bepaling van glycogeensynthase-activiteit, ontdooi de eerder bereide stamoplossingen van UDP-glucose, ATP, fosfoenolpyruvaat en NDP-kinase op ijs.

Verwarm een waterbad voor tot 30 graden Celsius. Wanneer de stamoplossingen klaar zijn, bereidt u voldoende testmengsel volgens het aantal glycogeensynthasetests door de reagentia toe te voegen aan een buis van 15 milliliter, zoals beschreven in het tekstprotocol. Bereid een blancoreactie voor door de NADH uit het reactiemengsel te vervangen door het water en breng de reactie over op een wegwerpmethacrylaatcuvet.

Gebruik de blanco reactie om nul in te stellen op de spectrofotometer op de golflengte van 340 nanometer. Neem een aliquot van 770 microliter van het reactiemengsel in een buis van 1,5 milliliter en voeg achtereenvolgens twee microliter elk NDP-kinase en pyruvaatkinaselactaatdehydrogenasemengsel toe aan de buis. Incubeer na het mengen de buis voorzichtig op 30 graden Celsius in het waterbad gedurende drie minuten om het reactiemengsel voor te verwarmen.

Voeg vervolgens 30 microliter van het monster dat glycogeensynthase bevat toe in 20 millimol trisbuffer bij pH 7,8 en meng voorzichtig voordat u het reactiemengsel overbrengt naar een verwijderingsmethacrylaatcuvet. Plaats het cuvet in de spectrofotometer en noteer de absorptie op 340 nanometer met getimede intervallen gedurende 10 tot 20 minuten. Plot vervolgens de verkregen absorpties tegen de tijd.

Om de vrijgekomen glucose te meten, brengt u 40 microliter van het supernatant over van de verwarmde glycogeenmonsters naar de wegwerpmethacrylaatcuvetten. En voeg de gemeten volumes triethanolamine, hydrochloride magnesiumsulfaatbuffer, NADP ATP-mengsel en water toe zoals beschreven in het manuscript. Meng het mengsel door voorzichtig op en neer te pipetteren zonder luchtbellen te creëren.

Voeg 0,5 microliter glucose-6-fosfaatdehydrogenase toe aan elk cuvet. Na het mengen door pipetteren, incubeer het mengsel gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en noteer vervolgens de absorptie op 340 nanometer. Meng vervolgens 0,5 microliter hexokinase met elk cuvet zoals eerder beschreven en incubeer gedurende 15 minuten voordat u de absorberende set van 340 nanometer registreert.

Ga vervolgens vijf minuten door met de incubatie bij kamertemperatuur, gevolgd door het registreren van de absorptie. Als de absorptie is toegenomen ten opzichte van de absorptie na 15 minuten, ga dan vijf minuten door met de incubatie voordat u de uiteindelijke absorptie op 340 nanometer registreert. Om de glycogeenvertakking te bepalen, combineert u 650 microliter jodiumcalciumchloride kleurreagens met 100 microliter water in een buis van 1,5 milliliter en mengt u de oplossing grondig voordat u deze overbrengt op een wegwerpmethacrylaatcuvet.

Plaats het cuvet in de spectrofotometer om een run uit te voeren in een golflengtescanmodus voor het verzamelen van het achtergrondspectrum van 330 tot 800 nanometer. Combineer in een aparte buis van 1,5 milliliter 650 microliter van het werkende jodiumcalciumchloride kleurreagen met 50 microgram oesterglycogeen en vul het uiteindelijke volume aan tot 750 microliter met water. Breng de oplossing na het grondig mengen van het mengsel over naar een wegwerpmethacrylaatcuvet om een absorptiespectrum van 330 tot 800 nanometer te verzamelen.

Verkrijg op dezelfde manier een absorptiespectrum met 50 microgram amylopectine en 30 microgram amylose zoals eerder beschreven. Om een indicatie te krijgen van de vertakte structuur van een niet-gekarakteriseerd glycogeenmonster, combineert u 25 tot 50 microgram glycogeen met 650 microliter van het werkende jodiumcalciumchloridekleurreagens en gaat u verder zoals eerder uitgelegd om het absorptiespectrum te verkrijgen. In de glycogeensynthase-assays werd een lineaire afname van de absorptie op 340 nanometer in de loop van de tijd waargenomen.

Het toevoegen van te veel glycogeensynthase aan de test zorgde ervoor dat de reactie binnen de eerste twee minuten voltooid was. De controlereactie, die geen glycogeensynthase bevatte, vertoont geen meetbare afname van de absorptie. De gegevens van een glycogeenfosforylasetest met behulp van een gezuiverd enzym hadden een lineaire fase die drie minuten duurde.

Een absorptiesnelheid van ongeveer 0,01 tot 0,04 eenheden per minuut is optimaal. In de glycogeenonttakkingsenzymtest toonde de reactie een lineaire fase die minstens 10 minuten aanhield. De representatieve gegevens van de glycogeen vertakkende enzymtests toonden het verschil in absorptie tussen de controlemonsters zonder vertakkend enzym en de reacties die vertakkend enzym bevatten.

Het smalle dynamische bereik van de test wordt geïllustreerd. De maximale verandering in de absorptie die kan worden geproduceerd is 0,4 absorptie-eenheden en de lineariteit gaat verloren wanneer de verandering in de absorptie ongeveer 0,2 absorptie-eenheden is. De massa's glycogeen, amylopectine en amylose die werden gebruikt in de glycogeenvertakkingsbeoordeling vertoonden een maximale absorptiewaarde van ongeveer 0,7 tot 0,8, elk bij verschillende absorptiemaxima.

Het glycogeenmonster produceerde twee pieken op ongeveer 400 nanometer en 460 nanometer. Het jodiumcalciumchloride kleurreagens is zeer dicht. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de glycogeenmonsters volledig worden gemengd met het reagens voordat een absorptiespectrum wordt verzameld.