Name: Spectrofotometrische methoden voor de studie van eukaryote glycogeenmetabolisme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Leer spectrofotometrische methoden voor het meten van glycogeensynthase-activiteit en eukaryot glycogeenmetabolisme zonder radioactieve isotopen. Deze kosteneffectieve technieken maken biochemisch onderzoek toegankelijker en veiliger voor wetenschappers.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteur wil Karoline Dittmer en Andrew Brittingham bedanken voor hun inzichten en vele nuttige discussies. Dit werk werd mede ondersteund door subsidies van het Iowa Osteopathic Education and Research Fund (IOER 03-17-05 en 03-20-04).

<ol><li>Wilson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glycogen+metabolism+in+yeast+and+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Regulation of glycogen metabolism in yeast and bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 34 (6), 952-985 (2010).</li>
<li>Ralton, J. E., Sernee, M. F., McConville, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+function+of+carbohydrate+reserve+biosynthesis+in+parasitic+protists%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Evolution and function of carbohydrate reserve biosynthesis in parasitic protists.</a> Trends in Parasitology. 1471 (21), 00144-00146 (2021).</li>
<li>Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+and+its+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Glycogen and its metabolism.</a> Current Molecular Medicine. 2 (2), 101-120 (2002).</li>
<li>Thomas, J. A., Schlender, K. K., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+filter+paper+assay+for+UDPglucose-glycogen+glucosyltransferase%2C+including+an+improved+biosynthesis+of+UDP-14C-glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid filter paper assay for UDPglucose-glycogen glucosyltransferase, including an improved biosynthesis of UDP-14C-glucose.</a> Analytical Biochemistry. 25 (1), 486-499 (1968).</li>
<li>Fox, J., Kawaguchi, K., Greenberg, E., Preiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+bacterial+glycogen.+Purification+and+properties+of+the+Escherichia+coli+B+ADPglucose%3A1%2C4-alpha-D-glucan+4-alpha-glucosyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli B ADPglucose:1,4-alpha-D-glucan 4-alpha-glucosyltransferase.</a> Biochemistry. 15 (4), 849-857 (1976).</li>
<li>Gilboe, D. P., Larson, K. L., Nuttall, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioactive+method+for+the+assay+of+glycogen+phosphorylases%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Radioactive method for the assay of glycogen phosphorylases.</a> Analytical Biochemistry. 47 (1), 20-27 (1972).</li>
<li>Brown, D. H., Illingworth, B., Cori, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+the+de+novo+synthesis+of+polysaccharide+by+phosphorylase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The mechanism of the de novo synthesis of polysaccharide by phosphorylase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 47 (4), 479-485 (1961).</li>
<li>Nelson, T. E., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+micro+assay+method+for+amylo-1%2C6-glucosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid micro assay method for amylo-1,6-glucosidase.</a> Analytical Biochemistry. 33 (1), 87-101 (1970).</li>
<li>Leloir, L. F., Olavarria, J. M., Goldemberg, S. H., Carminatti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+glycogen+from+uridine+diphosphate+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of glycogen from uridine diphosphate glucose.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 81 (2), 508-520 (1959).</li>
<li>Danforth, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+synthetase+activity+in+skeletal+muscle.+Interconversion+of+two+forms+and+control+of+glycogen+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Glycogen synthetase activity in skeletal muscle. Interconversion of two forms and control of glycogen synthesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 240, 588-593 (1965).</li>
<li>Wayllace, N. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-coupled+continuous+spectrophotometric+assay+for+glycogen+synthases%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+Reports%22%5BJournal%5D)">An enzyme-coupled continuous spectrophotometric assay for glycogen synthases.</a> Molecular Biology Reports. 39 (1), 585-591 (2012).</li>
<li>Shapiro, B., Wertheimer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorolysis+and+synthesis+of+glycogen+in+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Phosphorolysis and synthesis of glycogen in animal tissues.</a> Biochemical Journal. 37 (3), 397-403 (1943).</li>
<li>Mezl, V. A., Knox, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+methods+for+the+assay+of+glycogen+phosphorylase+in+tissue+homogenates%5BTitle%5D)+AND+%22Enzyme%22%5BJournal%5D)">Comparison of two methods for the assay of glycogen phosphorylase in tissue homogenates.</a> Enzyme. 13 (4), 197-202 (1972).</li>
<li>Mendicino, J., Afou-Issa, H., Medicus, R., Kratowich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fructose-1%2C+6-diphosphatase%2C+phosphofructokinase%2C+glycogen+synthetase%2C+phosphorylase%2C+and+protein+kinase+from+swine+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Fructose-1, 6-diphosphatase, phosphofructokinase, glycogen synthetase, phosphorylase, and protein kinase from swine kidney.</a> Methods in Enzymology. 42, 375-397 (1975).</li>
<li>Schreiber, W. E., Bowling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+assay+of+glycogen+phosphorylase+in+the+direction+of+phosphorolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An automated assay of glycogen phosphorylase in the direction of phosphorolysis.</a> Annals of Clinical Biochemistry. 27, Pt 2 129-132 (1990).</li>
<li>Nelson, T. E., Kolb, E., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+properties+of+rabbit+muscle+amylo-1%2C6-glucosidase-oligo-1%2C4-1%2C4-transferase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and properties of rabbit muscle amylo-1,6-glucosidase-oligo-1,4-1,4-transferase.</a> Biochemistry. 8 (4), 1419-1428 (1969).</li>
<li>Taylor, C., Cox, A. J., Kernohan, J. C., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Debranching+enzyme+from+rabbit+skeletal+muscle.+Purification%2C+properties+and+physiological+role%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Debranching enzyme from rabbit skeletal muscle. Purification, properties and physiological role.</a> European Journal of Biochemistry. 51 (1), 105-115 (1975).</li>
<li>Makino, Y., Omichi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+glycogen+debranching+enzyme+from+porcine+brain%3A+evidence+for+glycogen+catabolism+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience%2C+Biotechnology%2C+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Purification of glycogen debranching enzyme from porcine brain: evidence for glycogen catabolism in the brain.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 70 (4), 907-915 (2006).</li>
<li>Lee, E. Y. C., Whelan, W. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLee%2C+EYC+%22The+Enzymes+Vol.+5%22">The Enzymes Vol. 5</a>. Boyer, P. D. , Academic Press. 191-234 (1971).</li>
<li>Yu, X., Houtman, C., Atalla, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+of+amylose+and+iodine%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Research%22%5BJournal%5D)">The complex of amylose and iodine.</a> Carbohydrate Research. 292, 129-141 (1996).</li>
<li>Boyer, C., Preiss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+bacterial+glycogen.+Purification+and+properties+of+the+Escherichia+coli+b+alpha-1%2C4%2C-glucan%3A+alpha-1%2C4-glucan+6-glycosyltansferase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli b alpha-1,4,-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltansferase.</a> Biochemistry. 16 (16), 3693-3699 (1977).</li>
<li>Krisman, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+colorimetric+estimation+of+glycogen+with+iodine%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A method for the colorimetric estimation of glycogen with iodine.</a> Analytical Biochemistry. 4, 17-23 (1962).</li>
<li>Friedman, D. L., Larner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+UDPG-alpha-glucan+transglucosylase.+iii.+Interconversion+of+two+forms+of+muscle+UDPG-alpha-glucan+transglucosylase+by+a+phosphorylation-dephosphorylation+reaction+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Studies on UDPG-alpha-glucan transglucosylase. iii. Interconversion of two forms of muscle UDPG-alpha-glucan transglucosylase by a phosphorylation-dephosphorylation reaction sequence.</a> Biochemistry. 2, 669-675 (1963).</li>
<li>Hanashiro, I., Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+of+muscle+glycogen+synthase+that+disable+activation+by+glucose+6-phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Mutations of muscle glycogen synthase that disable activation by glucose 6-phosphate.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 397 (2), 286-292 (2002).</li>
<li>Huang, K. P., Cabib, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+glycogen+synthetase+in+the+glucose+6-phosphate-dependent+form.+I.+Purification+and+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Yeast glycogen synthetase in the glucose 6-phosphate-dependent form. I. Purification and properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 249 (12), 3851-3857 (1974).</li>
<li>Pederson, B. A., Cheng, C., Wilson, W. A., Roach, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glycogen+synthase.+Identification+of+residues+involved+in+regulation+by+the+allosteric+ligand+glucose-6-P+and+by+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of glycogen synthase. Identification of residues involved in regulation by the allosteric ligand glucose-6-P and by phosphorylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (36), 27753-27761 (2000).</li>
<li>Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+and+its+metabolism%3A+some+new+developments+and+old+themes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes.</a> Biochemical Journal. 441 (3), 763-787 (2012).</li>
<li>Gosselin, S., Alhussaini, M., Streiff, M. B., Takabayashi, K., Palcic, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous+spectrophotometric+assay+for+glycosyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A continuous spectrophotometric assay for glycosyltransferases.</a> Analytical Biochemistry. 220 (1), 92-97 (1994).</li>
<li>Wilson, W. A., Pradhan, P., Madhan, N., Gist, G. C., Brittingham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+synthase+from+the+parabasalian+parasite+Trichomonas+vaginalis%3A+An+unusual+member+of+the+starch%2Fglycogen+synthase+family%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Glycogen synthase from the parabasalian parasite Trichomonas vaginalis: An unusual member of the starch/glycogen synthase family.</a> Biochimie. 138, 90-101 (2017).</li>
<li>Krisman, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-1%2C4-glucan%3A+alpha-1%2C4-glucan+6-glycosyltransferase+from+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">alpha-1,4-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltransferase from liver.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 65, 307-315 (1962).</li>
<li>Sandhya Rani, M. R., Shibanuma, K., Hizukuri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fine+structure+of+oyster+glucogen%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Research%22%5BJournal%5D)">The fine structure of oyster glucogen.</a> Carbohydrate Research. 227, 183-194 (1992).</li>
<li>Dittmer, K. E., Pradhan, P., Tompkins, Q. C., Brittingham, A., Wilson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+glycogen+branching+and+debranching+enzymes+from+the+parasitic+protist+Trichomonas+vaginalis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of glycogen branching and debranching enzymes from the parasitic protist Trichomonas vaginalis.</a> Biochimie. 186, 59-72 (2021).</li>
</ol>

Er zijn geen belangenconflicten bekend die verband houden met dit werk en er is geen financiële steun voor dit werk geweest die de uitkomst ervan had kunnen beïnvloeden.

Over het algemeen zijn de belangrijkste voordelen van alle gepresenteerde methoden hun lage kosten, gemak, snelheid en gebrek aan afhankelijkheid van gespecialiseerde apparatuur. Het grote nadeel dat ze allemaal delen is gevoeligheid in vergelijking met andere beschikbare methoden. De gevoeligheid van de procedures die betrekking hebben op de productie of consumptie van NADH/NADPH zijn gemakkelijk in te schatten. Aangezien de extinctiecoëfficiënt van NADH/NADPH 6,22 M-1 cm-1 is, geeft een eenvoudige...

Glycogeen is wijd verspreid in de natuur, waarbij de verbinding wordt aangetroffen in bacteriën, vele protisten, schimmels en dieren. In micro-organismen is glycogeen belangrijk voor de overleving van cellen wanneer voedingsstoffen beperkend zijn en in hogere organismen zoals zoogdieren, de synthese en afbraak van glycogeen dienen om de bloedsuikerspiegelte bufferen 1,2,3. De studie van het glycogeenmetabolisme is daarom van belang voor zulke uiteenlopende gebieden als microbiologie en zoogdierfysiologie. Het begrijpen van glycogeenmetabolisme vereist het bestuderen van de belangrijkste enzymen van glycogeensynthese (glycogeensynthase en het vertakkende enzym) en glycogeenafbraak (glycogeenfosforylase en debranching enzym). De gouden standaard assays van glycogeensynthase, fosforylase, vertakking en debranching enzymactiviteiten maken gebruik van radioactieve isotopen. Glycogeensynthase wordt bijvoorbeeld over het algemeen gemeten in een gestopte radiochemische test door de opname van glucose uit UDP-[14C]glucose (in het geval van dierlijke en schimmelenzymen) of ADP-[14C]glucose (in het geval van bacteriële enzymen) in glycogeen 4,5 te volgen. Evenzo wordt glycogeenfosforylase gemeten in de richting van glycogeensynthese, na de opname van glucose uit [14C] glucose-1-fosfaat in glycogeen6. Het vertakkende enzym wordt getest door het vermogen van dit enzym te meten om de opname van [14C]glucose uit glucose-1-fosfaat in α1,4-gekoppelde ketens te stimuleren door glycogeenfosforylase7, en de debranching enzymactiviteit wordt bepaald door het volgen van het vermogen van het enzym om [14C]glucose op te nemen in glycogeen8 . Hoewel zeer gevoelig, waardoor hun gebruik in ruwe celextracten met lage niveaus van enzymactiviteit mogelijk is, zijn de radioactieve substraten duur en onderworpen aan de wettelijke vereisten die gepaard gaan met het gebruik van radio-isotopen. Deze barrières plaatsen het gebruik van bepaalde testen buiten het bereik van veel werknemers. In de loop van vele jaren is echter een indrukwekkende verscheidenheid aan spectrofotometrische benaderingen voor het meten van deze enzymen beschreven. Over het algemeen zijn deze benaderingen uiteindelijk afhankelijk van het meten van de productie of consumptie van NADH / NADPH, of het genereren van gekleurde complexen tussen glycogeen en jodium. Ze zijn dus eenvoudig en kunnen worden uitgevoerd met behulp van eenvoudige spectrofotometers die zijn uitgerust met alleen wolfraam- of xenonflitslampen.
Spectrofotometrische testen van glycogeensynthase zijn gebaseerd op het meten van het nucleosidedifosfaat dat vrijkomt uit de suikernucleotidedonor als glucose wordt toegevoegd aan de groeiende glycogeenketen 9,10. De procedure voor het meten van glycogeensynthase-activiteit beschreven in sectie 1 van het protocol, hieronder, is een wijziging van die beschreven door Wayllace et al.11, en het koppelingsschema wordt hieronder weergegeven:
(Glucose) n + UPD-glucose → (Glucose)n+1 + UDP
UDP + ATP → ADP + UTP
ADP + fosfoenolpyruvaat → pyruvaat + ATP
Pyruvaat + NADH + H+ → Lactaat + NAD+
Glycogeensynthase voegt glucose uit UDP-glucose toe aan glycogeen. De UDP die in dit proces wordt gegenereerd, wordt omgezet in UTP door nucleosidedifosfaatkinase (NDP-kinase), in een reactie die ADP genereert. De ADP dient dan op zijn beurt als substraat voor pyruvaatkinase, dat de ADP fosforyleert met behulp van fosfoenolpyruvaat als fosfaatdonor. Het resulterende pyruvaat wordt door het enzym lactaatdehydrogenase omgezet in lactaat in een reactie die NADH verbruikt. De test kan daarom op een continue manier worden uitgevoerd, waarbij de afname van de absorptie bij 340 nm wordt gevolgd als NADH wordt geconsumeerd. Het is gemakkelijk aangepast voor gebruik met enzymen die ADP-glucose als glucosedonor nodig hebben. Hier zijn de koppelingsstappen eenvoudiger omdat de ADP die vrijkomt door de werking van glycogeensynthase direct wordt beïnvloed door pyruvaatkinase.
Er zijn verschillende spectrofotometrische testen beschikbaar voor de bepaling van glycogeenfosforylase-activiteit. In de klassieke versie wordt het enzym naar achteren gedreven, in de richting van glycogeensynthese, zoals hieronder weergegeven:
(Glucose) n + Glucose-1-fosfaat → (Glucose)n+1 + Pi
Met getimede tussenpozen worden aliquots van het reactiemengsel verwijderd en wordt de hoeveelheid vrijgekomen fosfaat gekwantificeerd12,13. In onze handen is deze test van beperkt nut geweest vanwege de aanwezigheid van gemakkelijk meetbaar vrij fosfaat in veel commerciële preparaten van glucose-1-fosfaat, gecombineerd met de hoge concentraties glucose-1-fosfaat die nodig zijn voor fosforylasewerking. In plaats daarvan hebben we routinematig een alternatieve test gebruikt die het glucose-1-fosfaat meet dat vrijkomt als glycogeen wordt afgebroken door fosforylase13. Er wordt gebruik gemaakt van een gekoppeld reactieschema, dat hieronder wordt geïllustreerd.
(Glucose) n + Pi → (Glucose)n-1 + Glucose-1-fosfaat
Glucose-1-fosfaat → Glucose-6-fosfaat
Glucose-6-fosfaat + NADP+ → 6-fosfogluconolacton + NADPH + H+
Het glucose-1-fosfaat wordt omgezet in glucose-6-fosfaat door fosfoglucomutase en het glucose-6-fosfaat wordt vervolgens geoxideerd tot 6-fosfogluconolacton, met de gelijktijdige reductie van NADP + tot NADPH. De procedure die in paragraaf 2 van het protocol hieronder wordt beschreven, is afgeleid van methoden beschreven door Mendicino et al.14 en Schreiber & Bowling15. De test kan gemakkelijk op een continue manier worden uitgevoerd, met de toename van de absorptie bij 340 nm in de loop van de tijd, waardoor de reactiesnelheid kan worden bepaald.
Spectrofotometrische bepaling van de debranching enzymactiviteit is afhankelijk van de meting van de glucose die vrijkomt door de werking van het enzym op fosforylaselimiet dextrine16. Deze verbinding wordt gemaakt door glycogeen uitputtend te behandelen met glycogeenfosforylase. Omdat de werking van glycogeenfosforylase 4 glucoseresiduen weg van een α1,6-takkenpunt stopt, bevat de limietdextrine glycogeen, waarvan de buitenste ketens zijn verkort tot ~ 4 glucoseresiduen. De bereiding van fosforylaselimiet dextrine wordt hier beschreven, met behulp van een procedure die is afgeleid van die ontwikkeld door Taylor et al.17 en Makino & Omichi18.
Debranching is een proces in twee stappen. De 4-α-glucanotransferase-activiteit van het bifunctionele debranching-enzym brengt eerst drie glucoseresiduen over van het aftakkingspunt naar het niet-reducerende uiteinde van een nabijgelegen α1,4-gekoppelde glucoseketen. Het enkele, α1,6-gebonden glucoseresidu dat op het vertakkingspunt achterblijft, wordt vervolgens gehydrolyseerd door de α1,6-glucosidase-activiteit19. De test wordt meestal op een gestopte manier uitgevoerd, waarbij de glucose die na een bepaalde tijd (of reeks van tijden) vrijkomt, wordt gemeten in een gekoppelde enzymtest zoals hieronder weergegeven:
(Glucose) n → (Glucose)n-1 + Glucose
Glucose + ATP → Glucose-6-fosfaat + ADP
Glucose-6-fosfaat + NADP+ → 6-fosfogluconolacton + NADPH + H+
De bepaling van de geproduceerde NADPH geeft een maat voor de glucoseproductie. De procedure beschreven in sectie 3 van het protocol, hieronder, is gebaseerd op een procedure beschreven door Nelson et al.16. Net als de andere methoden die afhankelijk zijn van de consumptie of generatie van NADH / NADPH, is de test vrij gevoelig. De aanwezigheid van amylasen of andere glucosidasen, die ook vrije glucose uit fosforylaselimietdextrine kunnen vrijmaken, zal echter aanzienlijke interferentie veroorzaken (zie Discussie).
De colorimetrische bepaling van vertakkende enzymactiviteit is gebaseerd op het feit dat α1,4-gekoppelde glucoseketens spiraalvormige structuren aannemen die binden aan jodium en gekleurde complexen vormen20. De kleur van het gevormde complex hangt af van de lengte van de α1,4-gekoppelde ketens. Zo vormt amylose, dat bestaat uit lange, grotendeels onvertakte ketens van α1,4-gebonden glucose, een diepblauw complex met jodium. Glycogenen daarentegen, waarvan de buitenste ketens over het algemeen in de orde van grootte van slechts 6 tot 8 glucoseresiduen lang zijn, vormen oranjerode complexen. Als een oplossing van amylose wordt geïncubeerd met vertakkend enzym, resulteert de introductie van takken in het amylose in de generatie van kortere α1,4-gekoppelde glucoseketens. Zo verschuift het absorptiemaximum van de amylose/jodiumcomplexen naar kortere golflengten. De hier besproken procedure is afgeleid van die beschreven door Boyer &Preiss21 en vertakkende enzymactiviteit wordt gekwantificeerd als een vermindering van de absorptie van het amylose / jodiumcomplex bij 660 nm in de loop van de tijd.
Zoals duidelijk zou moeten zijn uit de bovenstaande discussie, betekent het feit dat de kleuren van de complexen gevormd tussen jodium- en α1,4-glucoseketens variëren met de ketenlengte dat de absorptiespectra van glycogeen / jodiumcomplexen moeten variëren met de mate van glycogeenvertakking. Dit is inderdaad het geval, en minder vertakte glycogenen/glycogenen met langere buitenste ketens absorberen licht op een langere golflengte dan glycogenen die meer vertakt zijn /kortere buitenste ketens hebben. De jodiumkleuringsreactie kan daarom worden gebruikt om snelle, kwalitatieve gegevens te verkrijgen over de mate van glycogeenvertakking22. De oranjebruine kleur vormt zich wanneer glycogeencomplexen met jodium niet bijzonder intens zijn. De kleurontwikkeling kan echter worden verbeterd door de toevoeging van verzadigde calciumchlorideoplossing22. Dit verhoogt de gevoeligheid van de methode ongeveer 10-voudig en maakt een kant-en-klare analyse van microgramhoeveelheden glycogeen mogelijk. De in paragraaf 4 van het protocol beschreven test voor de bepaling van vertakkingen is gebaseerd op een procedure ontwikkeld door Krisman22. Het wordt eenvoudig uitgevoerd door het glycogeenmonster te combineren met jodiumoplossing en calciumchloride in een cuvette en het absorptiespectrum van 330 nm tot 800 nm te verzamelen. Het absorptiemaximum verschuift naar langere golflengten naarmate de mate van vertakking afneemt.
Gezamenlijk bieden de hier beschreven methoden eenvoudige, betrouwbare middelen om de activiteiten van de belangrijkste enzymen van het glycogeenmetabolisme te beoordelen en om kwalitatieve gegevens te verkrijgen over de mate van glycogeenvertakking.

<table><tbody><tr><td>Amylopectin (amylose free) from waxy corn</td><td>Fisher Scientific</td><td>A0456</td><td></td></tr><tr><td>Amylose</td><td>Biosynth Carbosynth</td><td>YA10257</td><td></td></tr><tr><td>ATP, disodium salt</td><td>MilliporeSigma</td><td>A3377</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose-1,6-bisphosphate, potassium salt</td><td>MilliporeSigma</td><td>G6893</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose-6-phosphate, sodium salt</td><td>MilliporeSigma</td><td>G7879</td><td></td></tr><tr><td>Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Grade I, from yeast</td><td>MilliporeSigma</td><td>10127655001</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen, Type II from oyster</td><td>MilliporeSigma</td><td>G8751</td><td></td></tr><tr><td>Hexokinase</td><td>MilliporeSigma</td><td>11426362001</td><td></td></tr><tr><td>Methacrylate cuvettes, 1.5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-128</td><td>Methacrylate is vereist omdat sommige procedures worden uitgevoerd bij 340 nm of lager</td></tr><tr><td>&beta;-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt</td><td>MilliporeSigma</td><td>N0505</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt</td><td>MilliporeSigma</td><td>43420</td><td></td></tr><tr><td>Nucleoside 5'-diphosphate kinase</td><td>MilliporeSigma</td><td>N0379</td><td></td></tr><tr><td>Phosphoenolpyruvate, monopotassium salt</td><td>MilliporeSigma</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>Phosphoglucomutase from rabbit muscle</td><td>MilliporeSigma</td><td>P3397</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorylase A from rabbit muscle</td><td>MilliporeSigma</td><td>P1261</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle</td><td>MilliporeSigma</td><td>P0294</td><td></td></tr><tr><td>UDP-glucose, disodium salt</td><td>MilliporeSigma</td><td>U4625</td><td></td></tr></tbody></table>

spectrofotometrische methoden voor de studie van eukaryote glycogeenmetabolisme

Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism

Glycogeen wordt gesynthetiseerd als een opslagvorm van glucose door een breed scala aan organismen, variërend van bacteriën tot dieren. Het molecuul bestaat uit lineaire ketens van α1,4-gebonden glucoseresiduen met takken die worden geïntroduceerd door de toevoeging van α1,6-verbindingen. Begrijpen hoe de synthese en afbraak van glycogeen worden gereguleerd en hoe glycogeen zijn karakteristieke vertakte structuur bereikt, vereist de studie van de enzymen van glycogeenopslag. De methoden die het meest worden gebruikt om deze enzymactiviteiten te bestuderen, maken echter meestal gebruik van reagentia of technieken die niet voor alle onderzoekers beschikbaar zijn. Hier bespreken we een reeks procedures die technisch eenvoudig, kosteneffectief en toch in staat zijn om waardevol inzicht te geven in de controle van glycogeenopslag. De technieken vereisen toegang tot een spectrofotometer, die werkt in het bereik van 330 tot 800 nm, en worden beschreven ervan uitgaande dat de gebruikers wegwerpbare, plastic cuvetten zullen gebruiken. De procedures zijn echter gemakkelijk schaalbaar en kunnen worden aangepast voor gebruik in een microplaatlezer, waardoor zeer parallelle analyse mogelijk is.

Bepaling van glycogeensynthase-activiteit Figuur 1 toont representatieve resultaten van glycogeensynthase-assays met gezuiverde enzymen. In paneel A was er, na een lichte vertraging, een lineaire afname van de absorptie bij 340 nm in de tijd gedurende een periode van ongeveer 12 minuten. De snelheid van verandering in absorptie in figuur 1A was ~0,12 absorptie-eenheden/min. Een snelheid van verandering in absorptie tussen ~ 0,010 en ~ 0,20 ab...

Technieken om de activiteit van belangrijke enzymen van glycogeenmetabolisme te meten, worden gepresenteerd, met behulp van een eenvoudige spectrofotometer die in het zichtbare bereik werkt.

Spectrofotometrische methoden voor de studie van eukaryote glycogeenmetabolisme

Glycogen is synthesized as a storage form of glucose by a wide array of organisms, ranging from bacteria to animals. The molecule comprises linear chains ...

De protocollen zijn belangrijk, omdat ze het gebruik van radioactieve isotopen vermijden en een barrière verwijderen die veel werknemers kan beletten enzymen van glycogeenmetabolisme te bestuderen. De beschreven procedures zijn goedkoop en vereisen alleen toegang tot een eenvoudige spectrofotometer. Om te beginnen met de bepaling van glycogeensynthase-activiteit, ontdooi de eerder bereide stamoplossingen van UDP-glucose, ATP, fosfoenolpyruvaat en NDP-kinase op ijs.Verwarm een waterbad voor tot 30 graden Celsius. Wanneer de stamoplossingen klaar zijn, bereidt u voldoende testmengsel volgens het aantal glycogeensynthasetests door de reagentia toe te voegen aan een buis van 15 milliliter, zoals beschreven in het tekstprotocol. Bereid een blancoreactie voor door de NADH uit het reactiemengsel te vervangen door het water en breng de reactie over op een wegwerpmethacrylaatcuvet.Gebruik de blanco reactie om nul in te stellen op de spectrofotometer op de golflengte van 340 nanometer. Neem een aliquot van 770 microliter van het reactiemengsel in een buis van 1,5 milliliter en voeg achtereenvolgens twee microliter elk NDP-kinase en pyruvaatkinaselactaatdehydrogenasemengsel toe aan de buis. Incubeer na het mengen de buis voorzichtig op 30 graden Celsius in het waterbad gedurende drie minuten om het reactiemengsel voor te verwarmen.Voeg vervolgens 30 microliter van het monster dat glycogeensynthase bevat toe in 20 millimol trisbuffer bij pH 7,8 en meng voorzichtig voordat u het reactiemengsel overbrengt naar een verwijderingsmethacrylaatcuvet. Plaats het cuvet in de spectrofotometer en noteer de absorptie op 340 nanometer met getimede intervallen gedurende 10 tot 20 minuten. Plot vervolgens de verkregen absorpties tegen de tijd.Om de vrijgekomen glucose te meten, brengt u 40 microliter van het supernatant over van de verwarmde glycogeenmonsters naar de wegwerpmethacrylaatcuvetten. En voeg de gemeten volumes triethanolamine, hydrochloride magnesiumsulfaatbuffer, NADP ATP-mengsel en water toe zoals beschreven in het manuscript. Meng het mengsel door voorzichtig op en neer te pipetteren zonder luchtbellen te creëren.Voeg 0,5 microliter glucose-6-fosfaatdehydrogenase toe aan elk cuvet. Na het mengen door pipetteren, incubeer het mengsel gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en noteer vervolgens de absorptie op 340 nanometer. Meng vervolgens 0,5 microliter hexokinase met elk cuvet zoals eerder beschreven en incubeer gedurende 15 minuten voordat u de absorberende set van 340 nanometer registreert.Ga vervolgens vijf minuten door met de incubatie bij kamertemperatuur, gevolgd door het registreren van de absorptie. Als de absorptie is toegenomen ten opzichte van de absorptie na 15 minuten, ga dan vijf minuten door met de incubatie voordat u de uiteindelijke absorptie op 340 nanometer registreert. Om de glycogeenvertakking te bepalen, combineert u 650 microliter jodiumcalciumchloride kleurreagens met 100 microliter water in een buis van 1,5 milliliter en mengt u de oplossing grondig voordat u deze overbrengt op een wegwerpmethacrylaatcuvet.Plaats het cuvet in de spectrofotometer om een run uit te voeren in een golflengtescanmodus voor het verzamelen van het achtergrondspectrum van 330 tot 800 nanometer. Combineer in een aparte buis van 1,5 milliliter 650 microliter van het werkende jodiumcalciumchloride kleurreagen met 50 microgram oesterglycogeen en vul het uiteindelijke volume aan tot 750 microliter met water. Breng de oplossing na het grondig mengen van het mengsel over naar een wegwerpmethacrylaatcuvet om een absorptiespectrum van 330 tot 800 nanometer te verzamelen.Verkrijg op dezelfde manier een absorptiespectrum met 50 microgram amylopectine en 30 microgram amylose zoals eerder beschreven. Om een indicatie te krijgen van de vertakte structuur van een niet-gekarakteriseerd glycogeenmonster, combineert u 25 tot 50 microgram glycogeen met 650 microliter van het werkende jodiumcalciumchloridekleurreagens en gaat u verder zoals eerder uitgelegd om het absorptiespectrum te verkrijgen. In de glycogeensynthase-assays werd een lineaire afname van de absorptie op 340 nanometer in de loop van de tijd waargenomen.Het toevoegen van te veel glycogeensynthase aan de test zorgde ervoor dat de reactie binnen de eerste twee minuten voltooid was. De controlereactie, die geen glycogeensynthase bevatte, vertoont geen meetbare afname van de absorptie. De gegevens van een glycogeenfosforylasetest met behulp van een gezuiverd enzym hadden een lineaire fase die drie minuten duurde.Een absorptiesnelheid van ongeveer 0,01 tot 0,04 eenheden per minuut is optimaal. In de glycogeenonttakkingsenzymtest toonde de reactie een lineaire fase die minstens 10 minuten aanhield. De representatieve gegevens van de glycogeen vertakkende enzymtests toonden het verschil in absorptie tussen de controlemonsters zonder vertakkend enzym en de reacties die vertakkend enzym bevatten.Het smalle dynamische bereik van de test wordt geïllustreerd. De maximale verandering in de absorptie die kan worden geproduceerd is 0,4 absorptie-eenheden en de lineariteit gaat verloren wanneer de verandering in de absorptie ongeveer 0,2 absorptie-eenheden is. De massa's glycogeen, amylopectine en amylose die werden gebruikt in de glycogeenvertakkingsbeoordeling vertoonden een maximale absorptiewaarde van ongeveer 0,7 tot 0,8, elk bij verschillende absorptiemaxima.Het glycogeenmonster produceerde twee pieken op ongeveer 400 nanometer en 460 nanometer. Het jodiumcalciumchloride kleurreagens is zeer dicht. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de glycogeenmonsters volledig worden gemengd met het reagens voordat een absorptiespectrum wordt verzameld.

spectrophotometric-methods-for-study-eukaryotic-glycogen

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

This video describes a spectrophotometric assay for the estimation of glycogen synthase activity. The method relies on the reduction in the absorbance of NADH with time and indicates glycogen synthase activity.

Spectrophotometric Assay to Determine Glycogen Synthase Activity

In this video, we describe a qualitative spectrophotometric assay to determine the extent of branching in a glycogen sample with an uncharacterized structure. Comparing the absorbance maxima of the uncharacterized sample with that of polysaccharides with known branched structures indicates the presence of branching in the uncharacterized sample.

Glycogen Branching Assay to Measure the Degree of Glycogen Branching

We beschrijven hier een nauwkeurige, reproduceerbare en handige biochemische methode voor titratie van glycogeen in vitro. Deze techniek gebruikt de Abcam Glycogen testkit en is gebaseerd op opeenvolgende hydrolyse van glycogeen tot glucose en glucose titratie van fluorescentie.

Biochemische Titratie van glycogeen<em&gt; In vitro</em

Periodienzuur-Schiff-kleuring is een techniek die het polysacharidegehalte van weefsels visualiseert. Dit artikel demonstreert het protocol voor periodienzuur-Schiff-kleuring dat is aangepast voor gebruik op mononucleaire cellen uit perifeer bloed, gezuiverd uit menselijk veneus bloed. Dergelijke monsters zijn verrijkt met lymfocyten en andere witte bloedcellen van het immuunsysteem.

Detecteren Glycogeen in perifeer bloed mononucleaire cellen met Periodic Acid Schiff kleuring

Hier presenteren we een betrouwbare en gemakkelijke analyse om het glycogeengehalte in cyanobacteriële cellen te meten. De procedure omvat precipitatie, selecteerbare depolymerisatie en de detectie van glucose residuen. Deze methode is geschikt voor zowel wildtype als genetisch gemanipuleerde stammen en kan de metabolische techniek van cyanobacteriën vergemakkelijken.

Bepaling van het glycogeengehalte in cyanobacteriën

Voor de extractie van leverglycogeen werd een optimale sucroseconcentratie bepaald met behulp van sucrosedichtheidsgradiëntcentrifugatie. De toevoeging van een kookstap van 10 minuten om glycogeenafbrekende enzymen te remmen, bleek gunstig.

De extractie van leverglycogeenmoleculen voor de bepaling van de glycogeenstructuur

Een aangepaste postfixatieprocedure verhoogt het contrast van glycogeendeeltjes in weefsel. Dit artikel biedt een stapsgewijs protocol dat beschrijft hoe het weefsel moet worden behandeld, de beeldvorming moet worden uitgevoerd en stereologische methoden moeten worden gebruikt om onbevooroordeelde en kwantitatieve gegevens te verkrijgen over vezeltypespecifieke subcellulaire glycogeenverdeling in skeletspieren.

Kwantificering van subcellulaire glycogeenverdeling in skeletspiervezels met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie

De test op dierlijk weefsel maakt gebruik van nucleaire scintillatiedetectie om de enzymatische activiteit van glycogeensynthase te bepalen door de opname van radioactief gelabelde glucose in glycogeen te meten.

Radiochemische beoordeling van de enzymactiviteit van glycogeensynthase in dierlijk weefsel

We beschrijven hier een nieuwe, robuuste en efficiënte tandem affinity-zuivering (TAP) methode voor de expressie, isolatie en karakterisering van eiwitcomplexen uit eukaryote cellen. Dit protocol kan worden gebruikt voor de biochemische karakterisering van discrete complexen, evenals voor de identificatie van nieuwe interactoren en post-translationele modificaties die hun functie reguleren.

Tandem affiniteitszuivering van eiwitcomplexen van eukaryote cellen

We beschrijven een gemodificeerde kleinschalige extractie en colorimetrische vitrotests van lactaat en pyruvaat in de nematode C. elegans. Bij gebruik van commerciële assay kits, is de technische ontwikkeling van hun gevoeligheid en nauwkeurigheid belangrijk. Eiwit neerslag in extractie is de meest kritische stap voor de kwantitatieve bepaling van intracellulaire metabolieten.

Kleinschalige colorimetrische testen van intracellulaire lactaat en pyruvaat in de Nematode Caenorhabditis elegans

Leer spectrofotometrische methoden voor het meten van glycogeensynthase-activiteit en eukaryot glycogeenmetabolisme zonder radioactieve isotopen. Deze kosteneffectieve technieken maken biochemisch onderzoek toegankelijker en veiliger voor wetenschappers.

Spectrofotometrische methoden voor de studie van eukaryote glycogeenmetabolisme

Meer video's verkennen