Fotoafbreekbare hydrogelinterfaces voor screening, selectie en isolatie van bacteriën
November 4th, 2021
Het gebruik van fotoafbreekbare hydrogels om bacteriële cellen te isoleren door gebruik te maken van een lichtpatiteringstool met hoge resolutie wordt gerapporteerd. Essentiële experimentele procedures, resultaten en voordelen van het proces worden beoordeeld. De methode maakt een snelle en goedkope isolatie mogelijk van gerichte bacteriën met zeldzame of unieke functies uit heterogene gemeenschappen of populaties.
Dit protocol is ontworpen om cellen snel te isoleren van screeninginterfaces voor genomische karakterisering en deze mogelijkheid is belangrijk omdat het macroscopisch waarneembare celkenmerken kan combineren met genomische informatie. De beoogde bacteriële cellen uit de screeningsinterfaces kunnen met behulp van deze techniek op een operationeel eenvoudige manier met een hoge ruimtelijke positie worden geïsoleerd. De hydrogels kunnen worden geïmplementeerd in andere screeninginterfaces.
Het hydrogelmateriaal kan gemakkelijk worden opgenomen in microfluïdische kanalen voor het on-demand ophalen van cellen uit microfluïdische apparaten. Begin met het inenten van de cross-linking buffer met de gewenste celdichtheid. Bereid de hydrogelprecursoroplossing in een microcentrifugebuis van 0,5 milliliter door 12,5 microliter van de cross-linking buffer en 5,6 microliter PEG ONB-diacrylaatoplossing toe te voegen.
En voeg ten slotte 6,9 microliter PEG-thioloplossing op de onderarm toe aan het mengsel. Voor celinkapseling in de hydrogelvoorloperoplossing plaatst u de thiolated base coverslips op een schone petrischaal en plaatst u twee afstandhouders op de twee tegenover elkaar liggende zijden van de coverslip. Bevestig de afstandhouders op de bodemdeksel door de afstandhouders op de petrischaal te plakken.
Na het toevoegen van het gewenste volume van de precursoroplossing op een niet-reactieve geperfluoralkyleerde glasplaat, plaatst u de dia op de basisdeksels en laat u de hydrogelvorming gedurende 25 minuten bij kamertemperatuur voltooien. Zodra de gelation is voltooid, verwijdert u voorzichtig de geperfluoralkyleerde glasplaat. Plaats het substraat in de petrischaal van 60 bij 15 millimeter met ATGN-media aangevuld met antibioticum.
Zaad 700 microliter bacteriële celsuspensies met OD 600 van 0,1 over het microwell array substraat en maak de hydrogel precursor oplossing zoals eerder aangetoond met behulp van 12,5 microliter fosfaat gebufferde zoutoplossing ATGN van pH acht. Pipetteer 12,5 microliter van de precursoroplossing op een niet-reactieve geperfluoralkyleerde glasplaat en plaats twee stalen afstandhouders van 38 micrometer aan twee tegenover elkaar liggende zijden van het met cellen ingeënte microwell array-substraat. Keer vervolgens de geperfluoralkyleerde glasplaat om met de druppel precursoroplossing en plaats een druppel in het midden van het microwell-substraat.
Wanneer de hydrogel wordt gevormd na een incubatie van 25 minuten bij kamertemperatuur, verwijdert u voorzichtig de glasplaat van het microwell-substraat en plaatst u het substraat in een petrischaal met ATGN-media aangevuld met antibioticum. Plaats het monster in een PDMS-houder en voeg de gedefinieerde media bovenop het monster toe om uitdroging van het monster te voorkomen en een drageroplossing voor vrijgekomen cellen te bieden. Nadat u de kalibratiespiegel op zijn plaats hebt gebracht, past u de microscoopfocus aan om een scherp beeld te krijgen van de kolonies in de hydrogel- of microwell-array en inspecteert u om kolonies of putten van belang te identificeren.
Ontwerp hier de lichtpatronen terwijl de cameraweergave de kolonies in het monster toont om verschillende patronen voor celextractie te testen en het gedefinieerde patroon op te slaan. Selecteer vervolgens het gedeelte sessiebeheer en voeg de opgeslagen reeks toe onder het tabblad met de titel met de productnaam van het verlichtingsgereedschap met patroon. Kies de optie om het patroon te stimuleren om de gewenste belichtingslocatie te bekijken en aan te passen.
Pas vervolgens de lichtintensiteit aan op 60% en de belichtingstijd op 40 seconden onder het tabblad LED-bediening en start het belichtingsproces. Bewaak de hydrogeldegradatie in realtime en Brightfield-modus om de celafgifte te garanderen. Om de vrijgekomen cel te verzamelen, verandert u het microscoopfilter van Brightfield naar TRITC om het blootgestelde gebied van het monster met het blote oog te visualiseren.
Zodra het blootgestelde gebied zich bevindt, plaatst u het uiteinde van de buis op de bestraalde plek en verandert u het microscoopfilter terug naar Brightfield om het ophalen van cellen in realtime te volgen. Gebruik de spuit die aan het andere uiteinde van de slang is bevestigd om voorzichtig 200 microliter oplossing met de vrijgekomen cellen op te zuigen en breng de oplossing over in een centrifugebuis van 1,5 millimeter voor DNA-analyse of plating. Verschillende UV-licht micropatronen werden gebruikt voor celextractie uit bulk hydrogels, die de morfologie van de vrijgekomen cellen beïnvloedden.
De UV-blootstelling in een ringpatroon resulteerde in het vrijkomen van de hele kolonie ingekapseld in een beschermende PEG-hydrogel. Door daarentegen een deel of de hele kolonie bloot te stellen aan UV-licht, kunnen cellen worden geëxtraheerd als geaggregeerde celclusters of als vrije individuele cellen. De celzaaidichtheid en dikte van de hydrogel zijn belangrijk voor celinkapseling.
De dunnere hydrogels resulteerden in microkolonies met minimale kolonieoverlapping, terwijl de hydrogels met verhoogde dikte resulteerden in overlappende kolonies, wat kon resulteren in de extractie van meerdere kolonies. Overlappende kolonies kunnen kruisbesmetting veroorzaken tijdens de extractie vanwege de tweedimensionale aard van het lichtpatroon. Wanneer een topkolonie het doelwit was, werd de onderliggende kolonie er ook mee geëxtraheerd.
Het effect van gevarieerde UV-lichtmicropatronen op de levensvatbaarheid van cellen werd ook beoordeeld. Wanneer microkolonies werden blootgesteld aan gecontroleerde doses UV-licht in een cirkelvormig of kruispatroon, werden celherstel en DNA-zuiverheid niet beïnvloed. De cellen werden met succes opgehaald uit microwell-arrays met behulp van deze benadering, wat bleek uit de representatieve confocale microscopiebeelden, waar bij bestraling in het cirkel- en ringpatroon de cellen in het respectieve patroon werden verwijderd.
Na extractie uit microwell arrays werden de levensvatbaarheid van de cel en de DNA-hoeveelheid beoordeeld. De blootstellingspatronen beïnvloedden noch het aantal levensvatbare cellen, noch de DNA-kwaliteit, wat aangeeft dat levensvatbare bacteriecellen selectief uit microwells konden worden gehaald met minimale schade, en hun DNA kon met hoge zuiverheid worden geïsoleerd voor downstream genomische analyse. Controleer altijd of de hydrogel zich heeft gevormd voordat u de geperfluoralkyleerde coverslip verwijdert.
Precisie en zorg zijn vereist voor het plaatsen van de afstandhouders voor hydrogelafzetting en het gebruik van de buizen voor extractie van cellen.
Overzicht
Dit artikel bespreekt een protocol voor het isoleren van bacteriële cellen met behulp van fotoafbreekbare hydrogels en hoogwaardige lichtpatronen. De methode maakt de snelle en kosteneffectieve extractie van specifieke bacteriën uit complexe gemeenschappen mogelijk, wat genomische analyse vergemakkelijkt.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Celbiologie
- Genomiek
Achtergrond
- Het isoleren van specifieke bacteriële cellen is cruciaal voor genomische karakterisering.
- Fotoafbreekbare hydrogels bieden een nieuwe aanpak voor celinkapsling en -terugwinning.
- De techniek combineert waarneembare celkenmerken met genomische gegevens.
- Hydrogels kunnen worden geïntegreerd in verschillende screeninginterfaces.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor de snelle isolatie van gerichte bacteriële cellen.
- Om de effectiviteit van lichtpatronen bij celextractie te beoordelen.
- Om de impact van hydrogeldikte op celviabiliteit en extractie-efficiëntie te evalueren.
Gebruikte methoden
- Bereiding van hydrogelvoorloperoplossingen voor celinkapsling.
- Gebruik van lichtpatroneringshulpmiddelen om hydrogels af te breken en cellen vrij te maken.
- Bewaking van celextractie door middel van microscopie.
- Beoordeling van celviabiliteit en DNA-kwaliteit na extractie.
Belangrijkste resultaten
- Cellen werden met succes geïsoleerd uit microwell-arrays met minimale schade.
- Verschillende UV-lichtpatronen beïnvloedden de morfologie van vrijgekomen cellen.
- De dikte van de hydrogel had invloed op kolonie-overlap en extractieresultaten.
- Celviabiliteit en DNA-zuiverheid werden tijdens het extractieproces gehandhaafd.
Conclusies
- De methode maakt selectieve terugwinning van levensvatbare bacteriële cellen mogelijk.
- Hydrogels kunnen effectief worden gebruikt in genomische studies van bacteriën.
- Deze aanpak verbetert de efficiëntie van celisolatie voor downstream-toepassingen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
High-resolution photodegradable hydrogel interfaces enable precise screening and isolation of bacterial phenotypes, directly linking observable traits to downstream genomic analysis. This capability addresses a critical bottleneck in early discovery by allowing rapid, high-purity retrieval of rare or emergent bacterial strains from heterogeneous populations. The approach supports portfolio-wide efforts to de-risk target selection and accelerate functional validation in microbiology-driven R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct correlation of phenotypic screening with genotypic analysis for functional target validation.
- Supports biological de-risking by isolating rare or emergent bacterial phenotypes from complex libraries.
- Facilitates predictive confidence in target selection by ensuring high-purity retrieval of candidate strains.
Screening & Assay Development
- Prepares validated bacterial systems for downstream workflows through precise, contamination-minimized isolation.
- Standardizes assay outputs by enabling reproducible, spatially controlled cell retrieval.
- Enhances screening readiness and scalability for mutant libraries and consortia studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker discovery by enabling genomic characterization of phenotypically distinct isolates.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by preserving cell viability and DNA integrity.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing high-quality isolates for further functional studies.
Pipeline & Workflow Integration
This photodegradable hydrogel method integrates at the interface of phenotypic screening and genomic analysis, bridging early discovery and preclinical research stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling isolation of functionally relevant bacterial strains.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs through controlled cell encapsulation and release.
- Analytics: Provides high-purity samples for comparative genomic and phenotypic analyses.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment by linking phenotype to genotype in isolated strains.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for diverse microbiology screening and isolation needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable cell isolation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling high-fidelity downstream analysis.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of microbial targets and consortia.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hydrogel chemistry, microscopy, and light patterning instrumentation.
- Needs access to high-resolution light patterning tools and compatible microfluidic or microwell platforms.
- Demands cross-team standardization for hydrogel preparation and cell retrieval protocols.
- Adaptable to various bacterial models but sensitive to hydrogel thickness and colony overlap.
- Careful handling is essential to prevent cross-contamination and ensure high-purity isolation.
