Fotoafbreekbare hydrogelinterfaces voor screening, selectie en isolatie van bacteriën
4 november 2021
Het gebruik van fotoafbreekbare hydrogels om bacteriële cellen te isoleren door gebruik te maken van een lichtpatiteringstool met hoge resolutie wordt gerapporteerd. Essentiële experimentele procedures, resultaten en voordelen van het proces worden beoordeeld. De methode maakt een snelle en goedkope isolatie mogelijk van gerichte bacteriën met zeldzame of unieke functies uit heterogene gemeenschappen of populaties.
Dit protocol is ontworpen om cellen snel te isoleren van screeninginterfaces voor genomische karakterisering en deze mogelijkheid is belangrijk omdat het macroscopisch waarneembare celkenmerken kan combineren met genomische informatie. De beoogde bacteriële cellen uit de screeningsinterfaces kunnen met behulp van deze techniek op een operationeel eenvoudige manier met een hoge ruimtelijke positie worden geïsoleerd. De hydrogels kunnen worden geïmplementeerd in andere screeninginterfaces.
Het hydrogelmateriaal kan gemakkelijk worden opgenomen in microfluïdische kanalen voor het on-demand ophalen van cellen uit microfluïdische apparaten. Begin met het inenten van de cross-linking buffer met de gewenste celdichtheid. Bereid de hydrogelprecursoroplossing in een microcentrifugebuis van 0,5 milliliter door 12,5 microliter van de cross-linking buffer en 5,6 microliter PEG ONB-diacrylaatoplossing toe te voegen.
En voeg ten slotte 6,9 microliter PEG-thioloplossing op de onderarm toe aan het mengsel. Voor celinkapseling in de hydrogelvoorloperoplossing plaatst u de thiolated base coverslips op een schone petrischaal en plaatst u twee afstandhouders op de twee tegenover elkaar liggende zijden van de coverslip. Bevestig de afstandhouders op de bodemdeksel door de afstandhouders op de petrischaal te plakken.
Na het toevoegen van het gewenste volume van de precursoroplossing op een niet-reactieve geperfluoralkyleerde glasplaat, plaatst u de dia op de basisdeksels en laat u de hydrogelvorming gedurende 25 minuten bij kamertemperatuur voltooien. Zodra de gelation is voltooid, verwijdert u voorzichtig de geperfluoralkyleerde glasplaat. Plaats het substraat in de petrischaal van 60 bij 15 millimeter met ATGN-media aangevuld met antibioticum.
Zaad 700 microliter bacteriële celsuspensies met OD 600 van 0,1 over het microwell array substraat en maak de hydrogel precursor oplossing zoals eerder aangetoond met behulp van 12,5 microliter fosfaat gebufferde zoutoplossing ATGN van pH acht. Pipetteer 12,5 microliter van de precursoroplossing op een niet-reactieve geperfluoralkyleerde glasplaat en plaats twee stalen afstandhouders van 38 micrometer aan twee tegenover elkaar liggende zijden van het met cellen ingeënte microwell array-substraat. Keer vervolgens de geperfluoralkyleerde glasplaat om met de druppel precursoroplossing en plaats een druppel in het midden van het microwell-substraat.
Wanneer de hydrogel wordt gevormd na een incubatie van 25 minuten bij kamertemperatuur, verwijdert u voorzichtig de glasplaat van het microwell-substraat en plaatst u het substraat in een petrischaal met ATGN-media aangevuld met antibioticum. Plaats het monster in een PDMS-houder en voeg de gedefinieerde media bovenop het monster toe om uitdroging van het monster te voorkomen en een drageroplossing voor vrijgekomen cellen te bieden. Nadat u de kalibratiespiegel op zijn plaats hebt gebracht, past u de microscoopfocus aan om een scherp beeld te krijgen van de kolonies in de hydrogel- of microwell-array en inspecteert u om kolonies of putten van belang te identificeren.
Ontwerp hier de lichtpatronen terwijl de cameraweergave de kolonies in het monster toont om verschillende patronen voor celextractie te testen en het gedefinieerde patroon op te slaan. Selecteer vervolgens het gedeelte sessiebeheer en voeg de opgeslagen reeks toe onder het tabblad met de titel met de productnaam van het verlichtingsgereedschap met patroon. Kies de optie om het patroon te stimuleren om de gewenste belichtingslocatie te bekijken en aan te passen.
Pas vervolgens de lichtintensiteit aan op 60% en de belichtingstijd op 40 seconden onder het tabblad LED-bediening en start het belichtingsproces. Bewaak de hydrogeldegradatie in realtime en Brightfield-modus om de celafgifte te garanderen. Om de vrijgekomen cel te verzamelen, verandert u het microscoopfilter van Brightfield naar TRITC om het blootgestelde gebied van het monster met het blote oog te visualiseren.
Zodra het blootgestelde gebied zich bevindt, plaatst u het uiteinde van de buis op de bestraalde plek en verandert u het microscoopfilter terug naar Brightfield om het ophalen van cellen in realtime te volgen. Gebruik de spuit die aan het andere uiteinde van de slang is bevestigd om voorzichtig 200 microliter oplossing met de vrijgekomen cellen op te zuigen en breng de oplossing over in een centrifugebuis van 1,5 millimeter voor DNA-analyse of plating. Verschillende UV-licht micropatronen werden gebruikt voor celextractie uit bulk hydrogels, die de morfologie van de vrijgekomen cellen beïnvloedden.
De UV-blootstelling in een ringpatroon resulteerde in het vrijkomen van de hele kolonie ingekapseld in een beschermende PEG-hydrogel. Door daarentegen een deel of de hele kolonie bloot te stellen aan UV-licht, kunnen cellen worden geëxtraheerd als geaggregeerde celclusters of als vrije individuele cellen. De celzaaidichtheid en dikte van de hydrogel zijn belangrijk voor celinkapseling.
De dunnere hydrogels resulteerden in microkolonies met minimale kolonieoverlapping, terwijl de hydrogels met verhoogde dikte resulteerden in overlappende kolonies, wat kon resulteren in de extractie van meerdere kolonies. Overlappende kolonies kunnen kruisbesmetting veroorzaken tijdens de extractie vanwege de tweedimensionale aard van het lichtpatroon. Wanneer een topkolonie het doelwit was, werd de onderliggende kolonie er ook mee geëxtraheerd.
Het effect van gevarieerde UV-lichtmicropatronen op de levensvatbaarheid van cellen werd ook beoordeeld. Wanneer microkolonies werden blootgesteld aan gecontroleerde doses UV-licht in een cirkelvormig of kruispatroon, werden celherstel en DNA-zuiverheid niet beïnvloed. De cellen werden met succes opgehaald uit microwell-arrays met behulp van deze benadering, wat bleek uit de representatieve confocale microscopiebeelden, waar bij bestraling in het cirkel- en ringpatroon de cellen in het respectieve patroon werden verwijderd.
Na extractie uit microwell arrays werden de levensvatbaarheid van de cel en de DNA-hoeveelheid beoordeeld. De blootstellingspatronen beïnvloedden noch het aantal levensvatbare cellen, noch de DNA-kwaliteit, wat aangeeft dat levensvatbare bacteriecellen selectief uit microwells konden worden gehaald met minimale schade, en hun DNA kon met hoge zuiverheid worden geïsoleerd voor downstream genomische analyse. Controleer altijd of de hydrogel zich heeft gevormd voordat u de geperfluoralkyleerde coverslip verwijdert.
Precisie en zorg zijn vereist voor het plaatsen van de afstandhouders voor hydrogelafzetting en het gebruik van de buizen voor extractie van cellen.
Overzicht
Dit artikel bespreekt een protocol voor het isoleren van bacteriële cellen met behulp van fotodegradeerbare hydrogels en lichtpatronering met hoge resolutie. De methode maakt een snelle en kosteneffectieve extractie van specifieke bacteriën uit complexe gemeenschappen mogelijk, wat genomische analyse faciliteert.
Belangrijkste Componenten van de Studie
Wetenschappelijk gebied
- Microbiologie
- Celbiologie
- Genomica
Achtergrond
- De isolatie van specifieke bacteriële cellen is cruciaal voor genomische karakterisering.
- Fotodegradeerbare hydrogels bieden een nieuwe benadering voor celinkapseling en -terugwinning.
- De techniek combineert waarneembare celkenmerken met genomische gegevens.
- Hydrogels kunnen worden geïntegreerd in diverse screeningsinterfaces.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor de snelle isolatie van doelgerichte bacteriële cellen.
- Het beoordelen van de effectiviteit van lichtpatronen bij celextractie.
- Het evalueren van de impact van de dikte van de hydrogel op de celviabiliteit en de extractie-efficiëntie.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van hydrogel-precursoroplossingen voor celincapsulatie.
- Gebruik van lichtpatrooninstrumenten om hydrogels af te breken en cellen vrij te maken.
- Monitoring van cel-extractie via microscopie.
- Beoordeling van cellevensvatbaarheid en DNA-kwaliteit na extractie.
Belangrijkste resultaten
- Cellen werden succesvol geïsoleerd uit microwell-arrays met minimale schade.
- Verschillende UV-lichtpatronen beïnvloedden de morfologie van de vrijgekomen cellen.
- De dikte van de hydrogel beïnvloedde de overlap van kolonies en de extractieresultaten.
- De celviabiliteit en DNA-zuiverheid bleven behouden tijdens het extractieproces.
Conclusies
- De methode maakt selectieve terugwinning van levensvatbare bacteriële cellen mogelijk.
- Hydrogels kunnen effectief worden ingezet bij genomische studies van bacteriën.
- Deze aanpak verhoogt de efficiëntie van het isoleren van cellen voor downstream-applicaties.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Fotodegradeerbare hydrogel-interfaces met een hoge resolutie maken nauwkeurige screening en isolatie van bacteriële fenotypen mogelijk, waardoor observeerbare kenmerken direct gekoppeld kunnen worden aan downstream genomische analyse. Deze mogelijkheid pakt een kritieke flessenhals in de vroege ontdekkingsfase aan door het mogelijk maken van snelle, hoogzuivere terugwinning van zeldzame of opkomende bacteriële stammen uit heterogene populaties. De aanpak ondersteunt portfoliobrede inspanningen om risico's bij de selectie van targets te beperken en de functionele validatie in microbiologie-gestuurde R&D te versnellen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt directe correlatie van fenotypische screening met genotypische analyse mogelijk voor functionele validatie van targets.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door zeldzame of opkomende bacteriële fenotypen uit complexe bibliotheken te isoleren.
- Vergemakkelijkt voorspellend vertrouwen bij de selectie van targets door terugwinning van kandidaatstammen met een hoge zuiverheid te waarborgen.
Screening & assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde bacteriële systemen voor op downstream-workflows door middel van nauwkeurige isolatie met minimale contaminatie.
- Standaardiseert assay-outputs door reproduceerbare, ruimtelijk gecontroleerde celterugwinning mogelijk te maken.
- Verbetert de screeningbereidheid en schaalbaarheid voor mutantbibliotheken en consortia-studies.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij de ontdekking van translationele biomarkers door genomische karakterisering van fenotypisch verschillende isolaten mogelijk te maken.
- Handhaaft de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door de celviabiliteit en DNA-integriteit te behouden.
- Ondersteunt beslissingen over risico-gecorrigeerde voortgang door hoogwaardige isolaten te leveren voor verdere functionele studies.
Integratie van Pipeline en Workflow
Deze methode voor fotodegradeerbare hydrogel bevindt zich op het snijvlak van fenotypische screening en genomische analyse en slaat daarmee een brug tussen de vroege ontdekkingsfase en de preklinische onderzoeksfasen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door het mogelijk maken van de isolatie van functioneel relevante bacteriële stammen.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten via gecontroleerde cel-encapsulatie en -vrijgave.
- Analytiek: Levert monsters van hoge zuiverheid voor vergelijkende genomische en fenotypische analyses.
- Translationeel onderzoek: Faciliteert de afstemming van biomarkers door fenotype aan genotype te koppelen in geïsoleerde stammen.
- Bedrijfsvoering en hergebruik: Biedt een schaalbaar, aanpasbaar platform voor diverse microbiologische screening- en isolatiebehoeften.
Operationele impact en impact op de onderneming
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare en schaalbare workflows voor celisolatie.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go-beslissingen en de kapitaalefficiëntie door high-fidelity downstream-analyse mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en bevordering van microbiële targets en consortia.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in hydrogelchemie, microscopie en instrumentatie voor lichtpatronering.
- Vereist toegang tot instrumenten voor lichtpatronering met hoge resolutie en compatibele microfluïdische platforms of microwell-platforms.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor de preparatie van hydrogels en protocollen voor celterugwinning.
- Aanpasbaar aan verschillende bacteriële modellen, maar gevoelig voor de dikte van de hydrogel en overlap van kolonies.
- Zorgvuldige hantering is essentieel om kruiscontaminatie te voorkomen en isolatie van hoge zuiverheid te garanderen.
