Name: Stereotaxische virale injectie en gradiënt-index lensimplantatie voor diepe hersenen in vivo calciumbeeldvorming (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Leer een chirurgisch protocol voor virale injectie en GRIN-lensimplantatie om calciumbeeldvorming in diepe hersengebieden van vrij bewegende muizen mogelijk te maken. Deze methode ondersteunt grootschalige, celtype-specifieke opnames.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door subsidies van het National Institute of Health (NIH) 5P20GM121310, R61NS115161 en UG3NS115608.

<ol><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li>
<li>Brini, M., Cali, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+calcium+signaling%3A+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Neuronal calcium signaling: function and dysfunction.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).</li>
<li>Chen, T. W., Li, N., Daie, K., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Map+of+Anticipatory+Activity+in+Mouse+Motor+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Map of Anticipatory Activity in Mouse Motor Cortex.</a> Neuron. 94 (4), 866-879 (2017).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Komiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning-related+fine-scale+specificity+imaged+in+motor+cortex+circuits+of+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Learning-related fine-scale specificity imaged in motor cortex circuits of behaving mice.</a> Nature. 464 (7292), 1182-1186 (2010).</li>
<li>Peters, A. J., Lee, J., Hedrick, N. G., O'Neil, K., Komiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+of+corticospinal+output+during+motor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reorganization of corticospinal output during motor learning.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1133-1141 (2017).</li>
<li>Barbera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+compact+neural+clusters+in+the+dorsal+striatum+encode+locomotion+relevant+information%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Spatially compact neural clusters in the dorsal striatum encode locomotion relevant information.</a> Neuron. 92 (1), 202-213 (2016).</li>
<li>Cai, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shared+neural+ensemble+links+distinct+contextual+memories+encoded+close+in+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time.</a> Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).</li>
<li>de Groot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NINscope%2C+a+versatile+miniscope+for+multi-region+circuit+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations.</a> Elife. 9, 49987(2020).</li>
<li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li>
<li>Jacob, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compact+head-mounted+endoscope+for+in+vivo+calcium+imaging+in+freely+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A compact head-mounted endoscope for in vivo calcium imaging in freely behaving mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51(2018).</li>
<li>Liang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+and+Dynamic+ON+and+OFF+neural+ensembles+in+the+prefrontal+cortex+code+social+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct and Dynamic ON and OFF neural ensembles in the prefrontal cortex code social exploration.</a> Neuron. 100 (3), 700-714 (2018).</li>
<li>Liberti, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unstable+neurons+underlie+a+stable+learned+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Unstable neurons underlie a stable learned behavior.</a> Nature Neuroscience. 19 (12), 1665-1671 (2016).</li>
<li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+Ca2%2B+based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).</li>
<li>Bassett, J. J., Monteith, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+as+probes+to+assess+the+role+of+calcium+channels+in+disease+and+for+high-throughput+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators as probes to assess the role of calcium channels in disease and for high-throughput drug discovery.</a> Advances in Pharmacology. 79, 141-171 (2017).</li>
<li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li>
<li>Tian, L., Akerboom, J., Schreiter, E. R., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+activity+imaging+with+genetically+encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Neural activity imaging with genetically encoded calcium indicators.</a> Progress in Brain Research. 196, 79-94 (2012).</li>
<li>Moore, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient-index+optics%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Optics%22%5BJournal%5D)">Gradient-index optics: A review.</a> Applied Optics. 19 (7), 1035-1038 (1980).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniscope+GRIN+Lens+System+for+Calcium+Imaging+of+Neuronal+Activity+from+Deep+Brain+Structures+in+Behaving+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals.</a> Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56(2019).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-step+GRIN+lens+coating+for+in+vivo+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">A two-step GRIN lens coating for in vivo brain imaging.</a> Neuroscience Bulletin. 35 (3), 419-424 (2019).</li>
<li>Liang, B., Zhang, L., Moffitt, C., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open-source+automated+surgical+instrument+for+microendoscope+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">An open-source automated surgical instrument for microendoscope implantation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 311, 83-88 (2019).</li>
<li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> Elife. 8, 38173(2019).</li>
<li>Barbera, G., Liang, B., Zhang, L., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+wireless+miniScope+for+deep+brain+imaging+in+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A wireless miniScope for deep brain imaging in freely moving mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 323, 56-60 (2019).</li>
<li>Shuman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breakdown+of+spatial+coding+and+interneuron+synchronization+in+epileptic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice.</a> Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).</li>
<li>Werner, C. T., Williams, C. J., Fermelia, M. R., Lin, D. T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit+mechanisms+of+neurodegenerative+diseases%3A+A+new+frontier+with+miniature+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Circuit mechanisms of neurodegenerative diseases: A new frontier with miniature fluorescence microscopy.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 1174(2019).</li>
<li>Brault, V., Besson, V., Magnol, L., Duchon, A., Herault, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre%2FloxP-mediated+chromosome+engineering+of+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Experimental+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cre/loxP-mediated chromosome engineering of the mouse genome.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. (178), 29-48 (2007).</li>
<li>McLellan, M. A., Rosenthal, N. A., Pinto, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-loxP-mediated+recombination%3A+General+principles+and+experimental+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Mouse+Biology%22%5BJournal%5D)">Cre-loxP-mediated recombination: General principles and experimental considerations.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 7 (1), 1-12 (2017).</li>
</ol>

De auteurs melden geen concurrerende financiële belangen.

Een centrale vraag in de neurowetenschappen is begrijpen hoe neurale dynamica en circuits informatie coderen en opslaan, en hoe ze worden veranderd in hersenziekten. Met behulp van een miniscoop in vivo Ca2+ beeldvormingssysteem kan individuele neurale activiteit van enkele honderden neuronen binnen een lokaal microcircuit tegelijkertijd worden gevolgd door een vrij gedragend dier. Hier wordt een gedetailleerd operatieprotocol voor virale injectie en GRIN-lensimplantatie beschreven om knaagdieren voor te bereiden op een diepe hersenen in vivo Ca2 + -beeldvorming via een op maat ontwikkeld miniscoopregistratiesysteem. Tabel 1 toont de vergelijkingen van ons miniscoopsysteem met andere in de handel verkrijgbare en op maat gemaakte miniscoopsystemen 7,8,9,10,11,13,25,26. Het is vermeldenswaard dat GRIN-lensimplantatie met behulp van het huidige chirurgische protocol compatibel is met commerciële of op maat gemaakte beeldvormingssystemen met één foton en twee fotonen voor een diepe hersenen in vivo calciumbeeldvorming.
Van virale injectie tot gegevensverzameling van miniscope in vivo calciumbeeldvorming, de hele experimentele procedure duurt ten minste 2 maanden om te voltooien. Het is een ingewikkeld en arbeidsintensief proces. Het uiteindelijke succes van het experiment hangt af van meerdere factoren, waaronder de juiste keuze van GECI's, injectie van het virus nauwkeurig in het beoogde hersengebied, voldoende virale expressie in de gewenste neurale populatie, implantatie van de GRIN-lens precies op de gewenste locatie, voldoende herstel van operaties, evenals, of ernstige ontsteking optreedt na de operatie, en of het gedrag van het dier ernstig wordt beïnvloed door operaties, enzovoort.
Twee cruciale stappen omvatten stereotaxische injectie van virus en GRIN lensimplantatie. Voor het demonstratiedoel werd de stereotaxische micro-injectie uitgevoerd in de muismPFC, met adeno-geassocieerd virus (AAV1) dat codeert voor GCaMP6f onder controle van CaMKII-promotor die selectief piramidale neuronen in de mPFC labelt. GCaMP6f werd gekozen omdat het een van de snelste en meest gevoelige calciumindicatoren is met een halfvervaltijd van 71 ms15. Bovendien is de AAV-virale expressie van GCaMP6f langdurig (d.w.z. enkele maanden), waardoor het ideaal is voor het uitvoeren van repetitieve in vivo Ca2+ beeldvorming gedurende een lange periode voor longitudinale studies in muismodellen van neurodegeneratieve ziekten27. Het huidige operatieprotocol kan worden aangepast voor het richten op verschillende celpopulaties in elk ander hersengebied. Verschillende beschikbare virale hulpmiddelen maken selectieve labeling van specifieke neurale populaties in het gewenste hersengebied op de gewenste leeftijd mogelijk. Bovendien kunnen onderzoekers profiteren van het Cre-LoxP-recombinatiesysteem en verschillende beschikbare transgene muismodellen om genetische modificaties uit te voeren en de gedrags- en neurale circuituitkomst te bestuderen28,29.
Een uniek kenmerk van het gepresenteerde protocol is dat de geautomatiseerde laag-voor-laag hersenweefselaspiratie werd uitgevoerd vóór de implantatie van de GRIN-lens (1 mm in diameter). Dit wordt bereikt door een naald van 27 G die is aangesloten op een vacuümsysteem, bestuurd door een op maat gemaakte robotarm en software23. Op basis van onze ervaring genereert deze methode een uniform oppervlak voor de GRIN-lens om contact te maken en veroorzaakt minder schade aan het naburige weefsel dan handmatige weefselaspiratie23. Om deze reden biedt deze procedure een duidelijk voordeel voor GRIN-lenzen met een relatief grotere diameter (bijvoorbeeld 1 mm). Weefselaspiratie is echter mogelijk niet nodig voor het implanteren van een GRIJNS-lens met een kleinere diameter (0,5 mm of 0,25 mm). In plaats daarvan kan het direct langs de leidende baan worden geplant, gemaakt met een naald21 van 30 G.
Naast de twee kritieke stappen die hierboven zijn besproken, moeten veel andere factoren zorgvuldig worden overwogen voor een succesvolle operatie. (1) Alle instrumenten die contact maken met de hersenen moeten worden gesteriliseerd om infectie te voorkomen. (2) Alle chirurgische stappen moeten worden uitgevoerd om schade aan de hersenen te minimaliseren om verdere ontsteking en overmatige littekenweefselvorming te voorkomen. (3) De anesthesiedoses die aanvankelijk worden gegeven en tijdens de operatie worden gehandhaafd, met name die welke intraperitoneaal worden toegediend, moeten zorgvuldig worden overwogen. De anesthesiedoses kunnen worden aangepast aan verschillende muizenstammen, omdat sommige gevoeliger kunnen zijn. (4) De toestand van de muis moet tijdens de operatie voortdurend worden gecontroleerd. Ten slotte (5) moeten de muizen na de operatie regelmatig worden gecontroleerd, omdat er na de operatie veel complicaties kunnen optreden.
Hoewel een stuk hersenweefsel eenzijdig wordt verwijderd tijdens de GRIJNS-lensimplantatiestap, hebben we geen duidelijke gedragstekortenwaargenomen 7,12. Het gewicht van de miniscoop is ongeveer 2 gram en de kabel is speciaal ontworpen om hem licht te maken en ervoor te zorgen dat de muis hem gemakkelijk kan dragen. De miniscoop en kabel worden alleen aan het dier bevestigd voorafgaand aan in vivo beeldvorming en losgemaakt na beeldvorming. Het hele beeldvormingsproces duurt meestal niet langer dan 30 minuten. Daarom voorkomen deze instrumentaties niet dat de muis zich vrij kan gedragen. De miniscope-installatie- en demontagestappen vereisen een korte anesthesie (minder dan 2 minuten) met isofluraan met het oog op het beperken van dieren. We laten de muis meestal gedurende 30 minuten herstellen van de korte blootstelling aan isofluraan voordat we in vivo beeldvorming uitvoeren. We hebben gedurende een paar weken één keer per week miniscoop in vivo calciumbeeldvorming uitgevoerd zonder enige impact op de gezondheid van muizen en het sociale gedrag van muizen op temerken 12.
Een belangrijke beperking van het huidige miniscope-opnamesysteem is de noodzaak om de microscoop aan te sluiten op een kabel voor gegevensverzameling. De aanwezigheid van de kabel beperkt soms de prestaties van de muistaak en beperkt de opname van één dier tegelijk. Onlangs is er een draadloze miniscoop ontwikkeld 25,26. Dit zal de taakprestaties verbreden en gelijktijdige in vivo beeldvorming van meerdere dieren in een groep mogelijk maken. Bovendien zal het ontwikkelen van meer gevoelige GECI's met spectraal scheidbare golflengten in combinatie met een tweekleurige miniscoop meer opwindende mogelijkheden bieden voor neurowetenschappelijk onderzoek.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63049">Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging</a>. The Discussion&#160;was&#160;updated.
The following paragraph was added to the end of the Discussion:
Although a chunk of brain tissue is removed unilaterally during the GRIN lens implantation step, we did not observe any obvious behavior deficits7,12. The weight of the miniscope is around 2 grams and the cable is custom-designed to make it light and to ensure that the mouse can easily carry it. The miniscope and cable are only attached to the animal prior to in vivo imaging and detached after imaging. The entire imaging process usually takes no longer than 30 minutes. Therefore, these instrumentations do not prevent the mouse from freely behaving. The miniscope installation and deinstallation steps need a brief anesthesia (less than 2 minutes) with isoflurane for the purpose of animal restraining. We typically let the mouse recover from the brief exposure of isoflurane for 30 minutes before performing in vivo imaging. We have performed miniscope in vivo calcium imaging once per week for a few weeks without noticing any impact on mouse health and mouse social behavior12.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63049">Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging</a>. The Discussion&#160;was&#160;updated.

Erratum: Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Intracellulaire Ca2+ signalering is een essentiële regulator van celgroei, proliferatie, differentiatie, migratie, gentranscriptie, secretie en apoptose1. In neuronen wordt Ca2+ signalering nauwkeurig gecontroleerd, omdat het spatio-temporele patroon gerelateerd is aan cruciale functies zoals membraan prikkelbaarheid, neurotransmitterafgifte en synaptische plasticiteit2.
In vivo calciumbeeldvorming is een krachtige techniek die kan worden gebruikt om neurale circuitrepresentatie te decoderen die elementair is voor normaal dierlijk gedrag, afwijkende neuronale activiteiten in diermodellen van hersenaandoeningen te identificeren en potentiële therapeutische doelen te ontrafelen die deze veranderde circuits kunnen normaliseren. De twee meest voorkomende in vivo calciumbeeldvormingssystemen zijn twee-foton laser scanning fluorescentie microscopie 3,4,5,6 en op het hoofd gemonteerde geminiaturiseerde micro-dosisscopie (miniscoop)7,8,9,10,11,12,13 . De conventionele microscopie met twee fotonen biedt indrukwekkende voordelen, zoals een betere resolutie, minder ruis en minder fotobleaching; de proefdieren moeten echter met het hoofd worden gefixeerd, waardoor de gedragsstudies die kunnen worden uitgevoerd 3,4,5,6 worden beperkt. Daarentegen is het op het hoofd gemonteerde miniscoopsysteem klein en draagbaar, waardoor het mogelijk is om een breed scala aan gedragstests te bestuderen met behulp van vrij gedragende dieren 7,8,9,10,11,12,13.
Er zijn twee leidende Ca2+ indicatoren, chemische indicatoren 5,14 en genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECI's)15,16. Ca2+ beeldvorming is vergemakkelijkt door gebruik te maken van zeer gevoelige GECI's die worden geleverd met virale vectoren die specifieke labeling van neuronen in het beoogde circuit mogelijk maken. De voortdurende inspanning om de gevoeligheid, levensduur en het vermogen om zelfs de subcellulaire compartimenten te labelen te verbeteren, maakt GECI's ideaal voor verschillende in vivo calciumbeeldvormingsstudies 17,18,19.
De verstrooiing van licht in hersenweefsel tijdens beeldvorming beperkt de optische penetratie in de diepte, zelfs met de twee-fotonenmicroscopie. De Gradient Index (GRIN) -lens overwint dit probleem echter omdat de GRIN-lens rechtstreeks in de biologische weefsels kan worden ingebed en beelden van het diepe hersengebied naar het microscoopobjectief kan overbrengen. In tegenstelling tot conventionele lenzen gemaakt van optisch homogeen materiaal en een gecompliceerd gevormd oppervlak vereisen om scherp te stellen en beelden te creëren, zijn de prestaties van de GRIN-lens gebaseerd op een geleidelijke brekingsindexverandering in het lensmateriaal die focus bereikt met een vlak oppervlak20. GRIN-lens kan worden vervaardigd tot een diameter van 0,2 mm. Daarom kan een geminiaturiseerde GRIN-lens in de diepe hersenen worden geïmplanteerd zonder al te veel schade aan te richten.
In dit artikel wordt een compleet operatieprotocol gepresenteerd voor de diepe hersenen in vivo calciumbeeldvorming. Voor het demonstratiedoel beschrijven we hersenoperaties die specifiek gericht zijn op de mediale prefrontale cortex (mPFC) van de muizenhersenen en in vivo calciumbeeldvormingsregistratie via een op maat gemaakt miniscoopsysteem dat is ontwikkeld door de groep van Dr. Lin aan het National Institute on Drug Abuse (NIDA / IRP) 7,12. De experimentele procedure omvat twee grote hersenoperaties. De eerste operatie is het stereotaxisch injecteren van een virale vector die GCaMP6f (een GECI) tot expressie brengt in de mPFC. De tweede operatie is om de GRIN-lens in hetzelfde hersengebied te implanteren. Na herstel van deze hersenoperaties is de volgende procedure om de miniscoophouder (basis) op de schedel van de muis aan te brengen met behulp van tandcement. In vivo Ca2+ beeldvorming kan op elk moment worden uitgevoerd na montage van de miniscoop op de basis. Het operatieprotocol voor virale injectie en GRIN-lensimplantatie is compatibel met alle commerciële of op maat gemaakte beeldvormingssystemen met één foton en twee fotonen voor de diepe hersenen in vivo calciumbeeldvorming.

<table><tbody><tr><td>0.6mm en 1.2mm boorbijlen</td><td>KF technology</td><td>8000037800</td><td>Voor craniotomie</td></tr><tr><td>27-G en 30-G naald</td><td>BD PrecisionGlide-naald</td><td>REF 305109 en REF305106</td><td>Voor beide operaties</td></tr><tr><td>45 graden gebogen pincetten</td><td>Fine Science tools</td><td>11251-35</td><td>Voor operaties</td></tr><tr><td>7,5% povidon-jodiumoplossing (Betadine)</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>NDC 67618-151-17</td><td>Oppervlaktedesinfectie</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124-1L</td><td>GRIN-lensreiniger</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539-25G</td><td>Voor GRIN-lensimplantatie</td></tr><tr><td>Antibioticumzalf</td><td>HeliDerm Technology</td><td>81073087</td><td>Voor virusinjectie</td></tr><tr><td>Ontstekingsremmer (Ibuprofen)</td><td>Johnson &amp; Johnson Consumer Inc</td><td>30043308</td><td>Dient als pijnstiller na operaties</td></tr><tr><td>AutoStereota</td><td>NIDA/IRP</td><td>github.com/liang-bo/autostereota</td><td>Voor GRIN-lensimplantatie</td></tr><tr><td>Gedragsopnamesoftware (Point Grey FlyCap2)</td><td>Point Grey</td><td>Point Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2C</td><td>Voor het opnemen van gedrag</td></tr><tr><td>Messing zeskantmoer</td><td>McMASTER-CARR</td><td>92736A112</td><td>Voor GRIN-lensimplantatie</td></tr><tr><td>Buprenorfine</td><td>Par Pharmaceuticals</td><td>NDC 4202317905</td><td>Voor GRIN-lensimplantatie</td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>Sigma</td><td>10043-52-4</td><td>Voor het bereiden van aCSF</td></tr><tr><td>Commutator</td><td>NIDA/IRP</td><td>Op maat ontworpen</td><td>Onderdeel van het beeldacquisitiesysteem</td></tr><tr><td>Gecomprimeerde zuurstof- en Caxbondioxidetank</td><td>Rocky Mountain Air Solutions</td><td>BI-OX-CD5C-K</td><td>Voor GRIN-lensimplantatie</td></tr><tr><td>Gecomprimeerde zuurstoftank</td><td>Rocky Mountain Air Solutions</td><td>OX-M-K</td><td>Voor virusinjectie</td></tr><tr><td>Snoerloze microboor</td><td>KF technology</td><td>8000037800</td><td>Voor craniotomie</td></tr><tr><td>Cyanoacrylaat</td><td>Henkel Corporation</td><td># 1811182</td><td>Voor GRIN-lensimplantatie</td></tr><tr><td>Data-acquisitiecontroller</td><td>NIDA/IRP</td><td>Op maat ontworpen</td><td>Onderdeel van het beeldacquisitiesysteem</td></tr><tr><td>Datatransmissiekabel</td><td>NIDA/IRP</td><td>Op maat ontworpen</td><td>Onderdeel van het beeldacquisitiesysteem</td></tr><tr><td>Tandheelkundig cementset</td><td>C&amp;B Metabond en Catalyst</td><td>A00253revA306 en A00168revB306</td><td>Voor GRIN-lensimplantatie</td></tr><tr><td>Tandheelkundig cementset</td><td>Duralay</td><td>2249D</td><td>Voor GRIN-lensimplantatie</td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>VETone</td><td>NDC 1398503702</td><td>Voor GRIN-lensimplantatie</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma</td><td>50-99-7</td><td>Voor het bereiden van aCSF</td></tr><tr><td>Dieetgel</td><td>Clear H20</td><td>72-06-5022</td><td>Dieetsupplement voor muis</td></tr><tr><td>GRIN-lens</td><td>GRINTECH</td><td>NEM-100-25-10-860-S</td><td>Voor GRIN-lensimplantatie</td></tr><tr><td>Verwarmingskussen</td><td>Physitemp Instruments LLC.</td><td>#10023</td><td>Om het lichaam van de muis warm te houden tijdens operaties</td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>VETone</td><td>V1 502017</td><td>Anesthesie</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>VETone</td><td>V1 501072</td><td>Voor GRIN-lensimplantatie</td></tr><tr><td>Lidocaine</td><td>WEST-WARD</td><td>NDC 0143-9575-01</td><td>Lokale anesthesie</td></tr><tr><td>Magnesiumchloride hexahydraat</td><td>Sigma</td><td>7791-18-6</td><td>Voor het bereiden van aCSF</td></tr><tr><td>Microliter spuit (Hamilton)</td><td>Hamilton</td><td>7653-01</td><td>Voor virusinjectie</td></tr><tr><td>MicroSyringe pompcontroller</td><td>World Precision Instrument</td><td>#178647</td><td>Voor virusinjectie</td></tr><tr><td>Miniscope</td><td>NIDA/IRP</td><td>Op maat ontworpen</td><td>Voor beeldvorming</td></tr><tr><td>Miniscopebasis</td><td>Protolabs</td><td>Op maat ontworpen</td><td>Voor het monteren van de basis</td></tr><tr><td>Miniscopehouderarm</td><td>NIDA/IRP</td><td>Op maat ontworpen</td><td>Voor het monteren van de basis</td></tr><tr><td>Miniscopebeschermkap</td><td>Protolabs</td><td>Op maat ontworpen</td><td>Voor het beschermen van de miniscope</td></tr><tr><td>Gemotoriseerde controller</td><td>Thorlabs</td><td>KMTS50E</td><td>Voor het monteren van de basis</td></tr><tr><td>NeuView</td><td>NIDA/IRP</td><td>https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0</td><td>Voor in vivo beeldvorming</td></tr><tr><td>Oftalmische zalf</td><td>Puralube Vet Ointment</td><td>NDC 17033-211-38</td><td>Oftalmisch</td></tr><tr><td>PCR-buis</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0622</td><td>Voor GRIN-lensimplantatie</td></tr><tr><td>Knevelklem</td><td>World Precision Instrument</td><td>14040</td><td>Voor het klemmen van de buis</td></tr><tr><td>Polytetrafluorethyleen (PTFE) tape</td><td>TegaSeal PTFE Tape</td><td>A-A-58092</td><td>Voor het bevestigen van de miniScope aan de basis</td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Sigma</td><td>7447-40-7</td><td>Voor het bereiden van aCSF</td></tr><tr><td>Robotarm</td><td>NIDA/IRP</td><td>Op maat ontworpen</td><td>Voor GRIN-lensimplantatie</td></tr><tr><td>Saline</td><td>Hospira</td><td>RL 7302</td><td>Voor beide operaties</td></tr><tr><td>Stelschroef</td><td>DECORAH LLC.</td><td>3BT-P9005-00-0025</td><td>Voor het vastschroeven van de messing zeskantmoer in miniscope-basis</td></tr><tr><td> Siliconenrubberbuis, 0,062&rdquo;ID, 1/8&rdquo;OD</td><td>McMaster</td><td>2124T3</td><td>Voor irrigatie van aCSF</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td>Sigma</td><td>144-55-8</td><td>Voor het bereiden van aCSF</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma</td><td>7647-14-5</td><td>Voor het bereiden van aCSF</td></tr><tr><td>Natriumfosfaatmonobasisch</td><td>Sigma</td><td>7558-80-7</td><td>Voor het bereiden van aCSF</td></tr><tr><td>Stereotactische standaard</td><td>KOPF</td><td>Model 962 Dual Ultra Precise Small Animal Stereotaxic</td><td>Voor beide operaties</td></tr><tr><td>Steriele katoenen tampon</td><td>Puritan</td>

stereotaxische virale injectie en gradiënt-index lensimplantatie voor diepe hersenen in vivo calciumbeeldvorming

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Een miniatuur fluorescentiemicroscoop (miniscoop) is een krachtig hulpmiddel voor in vivo calciumbeeldvorming van vrij gedragende dieren. Het biedt verschillende voordelen ten opzichte van conventionele multi-foton calcium beeldvormingssystemen: (1) compact; (2) licht van gewicht; (3) betaalbaar; en (4) maakt het mogelijk om vrij gedragende dieren op te nemen. Dit protocol beschrijft hersenoperaties voor diepe hersenen in vivo calcium beeldvorming met behulp van een op maat ontwikkeld miniscoop opnamesysteem. De voorbereidingsprocedure bestaat uit drie stappen, waaronder (1) stereotaxisch injecteren van het virus in het gewenste hersengebied van een muizenbrein om een specifieke subgroep van neuronen te labelen met genetisch gecodeerde calciumsensor; (2) implantatie van gradiënt-index (GRIN) lens die calciumbeeld van diep hersengebied naar het miniscoopsysteem kan doorgeven; en (3) het bevestigen van de miniscopehouder over de muizenschedel waar de miniscope later kan worden bevestigd. Om in vivo calciumbeeldvorming uit te voeren, wordt de miniscoop op de houder bevestigd en worden neuronale calciumbeelden verzameld samen met gelijktijdige gedragsregistraties. Het huidige operatieprotocol is compatibel met alle commerciële of op maat gemaakte beeldvormingssystemen voor één foton en twee fotonen voor diepe hersenen in vivo calciumbeeldvorming.

Figuur 1 toont de schematische experimentele procedure, inclusief virale injectie, GRIJN-lensimplantatie, aanbrenging van de miniscoopbasis op de schedel van de muis en in vivo calciumbeeldvorming via een miniscoop. De hele procedure duurt ~ 2 maanden. Figuur 2 toont de belangrijkste componenten beschreven in het protocol voor miniscoop in vivo calcium beeldvorming. Figuur 3 toont de interfaces van AutoStereota-software tijdens de implantatie van GRIN-lenzen. Figuur 4 toont de interfaces van NeuView en gedragsregistratiesoftware tijdens in vivo calciumbeeldvorming.
De uitkomst van in vivo calciumbeeldvorming is afhankelijk van het succes van zowel virale injectie- als GRIN-lensimplantatieoperaties. Figuur 5 toont een reeks uitkomsten (d.w.z. onsuccesvol, suboptimaal en goed) van in vivo calciumbeeldvormingsopnamen. In onsuccesvolle gevallen kan het calciumbeeld donker of helder lijken, maar onthult het meestal geen of zeer weinig actieve neuronen. We streven meestal geen in vivo calciumregistratie-experimenten na als er minder dan vijf actieve neuronen zijn. Een goede in vivo calciumbeeldvorming onthult meestal enkele honderden actieve neuronen. Als een opname minder dan honderd actieve neuronen bevat, beschouwen we het als een suboptimale opname.
In zowel suboptimale als goede opnames werden in vivo calciumbeeldvormingsexperimenten uitgevoerd en werd de daaropvolgende data-analyse uitgevoerd. Film 1 toont een representatieve in vivo calciumbeeldvormingsopname van de mPFC van de muis. Gedragsvideo's en calciumbeeldvormingsgegevens worden meestal afzonderlijk verwerkt. Video's over muisgedrag kunnen handmatig worden gescoord. Calciumbeeldvormingsbestanden worden verwerkt met behulp van de CaImAn calcium image processing toolbox24. Figuur 6 toont een representatieve celkaart en enkele calciumsporen uit een goede in vivo calciumbeeldvormingsregistratie.
Na het voltooien van in vivo calciumbeeldvorming is de laatste stap om te bevestigen of de virale injectie en GRIN-lensimplantatie heeft plaatsgevonden in het gewenste hersengebied. Voor dit doel werd de muis doordrenkt met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) gevolgd door 4% paraformaldehyde (PFA). Het muizenbrein werd geoogst, gedurende 12 uur in 4% PFA gefixeerd en bij 4 °C in PBS bewaard. Het muizenbrein werd vervolgens in 50 μm dikke plakken gesneden met een vibratome. De hersenplakken werden gekleurd met DAPI en waargenomen onder de microscoop (niet beschreven in het protocol)12. Figuur 7 is een hersenschijf van de muis ~ 1,94 mm voor bregma van een experimentele muis, die het spoor toont waar de GRIN-lens werd geïmplanteerd. Het groene fluorescentiegebied onder en rond de GRIN-lenstrack geeft de expressie van GCaMP6f in het mPFC-gebied aan.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig01.jpg"> Figuur 1: Schematisch overzicht van de experimentele procedure. (A) Stereotaxische injectie van virus in de mPFC. (B) GRIJNSlensimplantatie in de mPFC. (C) Het aanbrengen van miniscoopbasis op de schedel van de muis. (D) Miniscope-montage en in vivo calciumbeeldvorming. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig02.jpg"> Figuur 2: Belangrijkste componenten die nodig zijn voor in vivo calciumbeeldvorming. (A) Een GRIJNSlens met een diameter van 1 mm en een lengte van 4,38 mm. (B) Een handmatig gepolijste naald van 27 G met stomp uiteinde die wordt gebruikt voor hersenweefselaspiratie. (C) De robotarm gekoppeld aan de naaldhouder. (D) Een op maat gemaakte dop van een PCR-buis om de blootgestelde GRIN-lens te beschermen tot de bevestiging van de miniscoopbasis op de schedel van de muis. (E) De miniscopehouder (basis) met een zeskantmoer. (F) Een miniscoop waarvan het draadgedeelte is omwikkeld met de PTFE-tape. (G) Een miniscoop die met een borgschroef aan de basis is bevestigd. (H) De miniscope die de arm vasthoudt. (I) Een op maat gemaakte 3D gemotoriseerde controller die wordt gebruikt om de beweging van de miniscoop in XYZ-posities te vergemakkelijken. (J) Een beschermkap die op de basis is bevestigd om de blootgestelde GRIN-lens te beschermen terwijl de muis geen in vivo calciumbeeldvorming uitvoert. (K) De miniscope die op de kabel is aangesloten. (L) Het data-acquisitiesysteem voor in vivo Ca2+- beeldvorming. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig03.jpg"> Figuur 3: Interfaces van AutoStereota-software tijdens laag-voor-laag hersenweefselaspiratie. (A) De interface die overeenkomt met de stappen 2.17.1 tot en met 2.17.3. (B) De interface die overeenkomt met de stappen 2.17.4 tot en met 2.17.6. (C) De interface die overeenkomt met de stappen 2.17.7 tot en met 2.17.9. (D) De interface die overeenkomt met de stappen 2.17.10 tot en met 2.17.12. Rode vakken markeren de invoerwaarden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig04.jpg"> Figuur 4: Interfaces van NeuView-software en de gedragsregistratiesoftware tijdens in vivo calciumbeeldvorming. (A) De interface van NeuView. (B,C) De interfaces van de gedragsregistratiesoftware. Rode vakken markeren knoppen waarop moet worden geklikt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig05.jpg"> Figuur 5: Maximale projectie fluorescentiecelkaarten om het bereik van mogelijke uitkomsten weer te geven. (A,B) Mislukte in vivo calciumbeeldvorming die niet aanvaardbaar is voor latere gegevensanalyse. (A) is donker en bevat minder dan 5 actieve neuronen. (B) is helder maar heeft geen actieve neuronen. (C) De celkaart van een suboptimale in vivo calciumbeeldvorming die enkele actieve neuronen bevat. (D) De celkaart van een goede in vivo calciumbeeldvorming die enkele honderden actieve neuronen bevat. Schaalbalk: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig06.jpg"> Figuur 6: Representatieve celkaart en calciumtransiënten van een succesvolle in vivo calciumbeeldvorming. Het linkerpaneel is de maximale fluorescentiecelkaart van een in vivo calciumbeeldvormingsopname in de mPFC tijdens een open veldtest. De opname duurt 5 min. Het rechterpaneel toont calciumtransiënten uit 15 interessegebieden (kleurgematcht). Schaalbalk: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig07.jpg"> Figuur 7: Postmortale beoordeling van een experimentele muis. De postmortale beoordeling voor GCaMP6f-expressie en GRIN-lensimplantatie in de mPFC van een experimentele muis. Het rechthoekige gebied geeft het pad aan voor GRIJN-lensimplantatie. Het groene gebied onder het geïmplanteerde gebied van de GRIN-lens bevestigt dat GCaMP6f tot expressie is gebracht en dat de GRIN-lens precies in het gewenste hersengebied is geïmplanteerd. Cg, cingulate cortex; PrL, prelimbische cortex; IL, infralimbische cortex. Schaalbalk: 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Tabel 1: Vergelijkingen van het op maat gemaakte miniscoopsysteem bij de NIDA met andere miniscoopsystemen 7,8,9,10,11,13,25,26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049_Table%201_1.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Film 1: Een in vivo calciumbeeldvormingsopname van de mPFC van de muis tijdens een open veldtest. Voor demonstratiedoeleinden toont deze video slechts 1 minuut opname. De oorspronkelijke opnameframesnelheid is 10 frames / s. De video is 6 keer sneller dan de originele opname. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/movie.mp4" target="_blank">Klik hier om deze film te downloaden.</a>

Miniscope in vivo calcium imaging is een krachtige techniek om neuronale dynamica en microcircuits te bestuderen in vrij gedragende muizen. Dit protocol beschrijft het uitvoeren van hersenoperaties om goede in vivo calciumbeeldvorming te bereiken met behulp van een miniscoop.

Stereotaxische virale injectie en gradiënt-index lensimplantatie voor diepe hersenen in vivo calciumbeeldvorming

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

Miniscope in vivo calciumbeeldvorming stelt onderzoekers in staat om de ruimtelijk en temporeel gecoördineerde activiteit van honderden neuronen in diepe hersenstructuren van vrij gedragende dieren te onderzoeken. Miniscope in vivo calciumbeeldvorming biedt vele voordelen, waaronder de mogelijkheid om opnames uit te voeren die celtypespecifiek, grootschalig en longitudinaal zijn. Ons operatieprotocol voor virale injectie en GRIJN-lensimplantatie is compatibel met alle commerciële of op maat gemaakte beeldvormingssystemen voor één foton en twee fotonen voor de diepe hersenen in vivo calciumbeeldvorming.De procedure wordt gedemonstreerd door Rashmi Thapa, een afgestudeerde student uit mijn laboratorium. Na het desinfecteren van het geschoren operatiegebied van een verdoofde muis, gebruikt u een scalpel om een incisie van twee centimeter door de huid langs de middellijn te maken om de lambda en bregma van de schedel bloot te leggen. Na het lokaliseren van de 0,5 millimeter tandboorbraam naar een positie van voorste achterste 1,94 millimeter en mediale laterale 0,5 millimeter van de bregma, begin je met boren door de schedel.Laad vervolgens het virus in de microliterspuit met behulp van het bedieningspaneel van de micropomp en zuig 500 nanoliter luchtbel op, gevolgd door 800 nanoliter van het virus met een stroomsnelheid van 50 nanoliter per seconde. Beweeg de naald langzaam naar beneden in het hersenweefsel naar de beoogde Z-coördinaat van dorsale ventrale 1,75 millimeter en beweeg deze vervolgens licht omhoog naar de Z-coördinaat van dorsale ventrale 1,65 millimeter. Stel op het bedieningspaneel de micropomp in om 500 nanoliter van het virus te injecteren met een stroomsnelheid van 50 nanoliter per minuut voordat u op de Run-knop drukt om het virus te injecteren.Wanneer de injectie voorbij is, lijnt u de huidranden uit en sluit u de incisie voorzichtig met een 4-0 hechting. Breng antibiotische zalf aan op het gestikte gebied om infectie te voorkomen. Om de gradiëntindex of GRIN-lens te implanteren, snijdt u een driehoekig gebied van de huid van 1,5 centimeter hoogte en 1,5 centimeter basis van de voorste kant tussen de ogen naar de achterste kant achter de lambda met behulp van een fijne schaar.Nadat de schedel grondig is gereinigd en gedroogd, brengt u cyanoacrylaat aan op de randen van de huid en bevestigt u de huid aan de schedel. Na vijf minuten wanneer het cyanoacrylaat droogt, lokaliseer je een boorbraam van 1,2 millimeter diameter naar een positie van voorste achterste 1,94 millimeter, mediale laterale 0,8 millimeter van de bregma. Boor door de schedel, gevolgd door het verwijderen van de dura met behulp van een 30 gauge naaldpunt.Reinig alle stukken botresten met een scherpe tang van 45 graden. Bevestig vervolgens een handmatig gepolijste stompe eindnaald van 27 gauge aan de naaldhouder gekoppeld aan een robotarm gekanteld met een hoek van 10 graden en sluit het andere uiteinde van de naaldhouder aan op het huisvacuümsysteem. Zoek de punt van de naald om de bregma aan te raken voordat u op de Bregma-knop klikt om de Z-coördinaat van bregma op nul in te stellen.Stel de invoer X-waarde in op 0,8, voer de Y-waarde in op 1,94, voer de Z-waarde in op 1,0 en klik op de knop Zoeken om de naald naar de bovenkant van het geboorde gat op de schedel te verplaatsen. Centreer de punt van de naald op het geboorde gat en breng het naar de Z-positie nul. Schakel het vacuüm in en begin met het spoelen van het blootgestelde hersengebied met kunstmatig hersenvocht, of ACSF, via een zwaartekrachtgestuurd buizensysteem dat is verbonden met een naald van 30 gauge met een gebogen punt.ACSF wordt continu bebeld met een gasmengsel van 95% zuurstof en 5% koolstofdioxide terwijl het wordt gefilterd door een filter van 0,2 micron. Met behulp van AutoStereota-software zal de aspiratie van het hersenweefsel in vier rondes worden voltooid. Voor de eerste aspiratieronde moet u ervoor zorgen dat de Z-waarde nul weergeeft.Klik vervolgens in de zStep-sessie op en controleer de eerste en tweede rij. Stel de waarden voor de eerste rij in op 0,2 en 1. Stel de waarden voor de tweede rij in op 0,15 en 4.Stel in de modussessie naaldgrootte 27 gauge en 1.2 in. Stel Dims 0.9 in. Alle andere waarden zijn standaard.Om de aspiratie te starten, klikt u achtereenvolgens op de knoppen NotSet, KeepZero en Start. De eerste aspiratieronde genereert een kolomzak met een diepte van 0,8 millimeter en een diameter van 1 millimeter. Klik in de derde aspiratieronde op de eerste rij voor de zStep-sessie en controleer deze en stel de waarden voor de eerste rij in op 1,8 en 1.Stel in de modussessie naaldgrootte 27 gauge en 2.2 in. Begin de ambitie door andere waarden hetzelfde te houden als die van de vorige ronde. Na de derde aspiratieronde is de diepte van de kolomzak 1,8 millimeter.De laatste ronde van aspiratie is om bloed op te ruimen dat zich op de bodem van de zak heeft opgehoopt. Stel de waarden voor de eerste rij in op 1,6 en 1 in de zStep-sessie en stel naaldgrootte 27 gauge en 2.2 en Dims 0.6 in mode sessie in voordat u begint met aspiratie. Zodra de zak bloedvrij is, stopt u het vacuüm, stopt u de irrigatie van ACSF en brengt u de naald 2 millimeter in Z-coördinaat en 0,5 millimeter vooraan in het midden.Plaats de steriele 1 millimeter GRIN-lens in de hersenweefselzak. Breng vervolgens de gesmolten agarose aan in de opening tussen de GRIN-lens en het hersenweefsel met behulp van een spatel. Nadat agarose een gel vormt, verwijdert u overtollige agarose met behulp van een micromesje.Meng het tandcementpoeder en de katalysatorvloeistof in een voorgekoelde mengput en breng een laag zelfuithardend kleefharscement aan op de schedel, te beginnen met het omringen van de GRIN-lens en vervolgens de hele blootgestelde schedel bedekken. Meng in een schone plastic put tandcementpoeder en zwarte houtskool met vloeistof om een dunne laag van het mengsel op de eerste laag tandcement aan te brengen. Laat het vijf minuten uitharden.Sluit de Miniscope aan op de kabel en schakel de op maat ontwikkelde software NuView in. Klik in NuView op Hardware, vink LED1 aan en klik op de knop Streamen om de livebeelden te bekijken. Om live streaming te stoppen, klikt u op stop knop.Plaats vervolgens de Miniscope in een op maat gemaakte Miniscope-houder. Met behulp van gemotoriseerde controllers lokaliseer je de Miniscope net boven de belichte GRIN-lens, waardoor deze evenwijdig is aan het oppervlak van de lens. Breng de Miniscope langzaam naar beneden in de richting van de GRIN-lens en pas de Z-positie aan totdat het beste scherpstelvlak is gevonden.Breng de eerste laag tandcement aan rond de Miniscope-basis zonder de positie van de Miniscope te wijzigen. Nadat het cement is uitgehard, verwijdert u voorzichtig de houdarm zodat de Miniscope op zichzelf op de muiskop kan staan. Breng een tweede laag tandcement aan rond de basis om alle gaten te vullen, zodat er geen LED-licht uit de openingen lekt.Laat het tandcement uitharden. Na het kort verdoven van de muis met isofluraan, maakt u de borgschroef in de basis los met een kleine schroevendraaier voordat u de beschermkap verwijdert en reinigt u het oppervlak van de GRIN-lens met een met aceton doordrenkt wattenstaafje. Sluit de Miniscope aan op de kabel en start de NuView-software om te beginnen met het identificeren van het beste brandpuntsvlak met het aanpassen van de positie van de Miniscope ten opzichte van de basis door iets aan te spannen of los te maken met behulp van een stompe tang.Zodra het beste brandpuntsvlak is bepaald, draait u de vergrendelingsschroef vast voordat u de kabel loskoppelt en de muis terug in zijn thuiskooi plaatst. Schakel de gedragscamerasoftware in om het gedrag van de muis te bekijken via een livestreamfunctie. Pas handmatig de scherpstelling van de bovenste camera aan.Selecteer Trigger Strobe en schakel trigger in/ uitschakelen in, gevolgd door op de knop Opnemen te klikken. Gebruik vervolgens Bladeren om een locatie te selecteren waar gedragsregistraties worden opgeslagen. Selecteer het gewenste afbeeldingsformaat.Breng de muis dicht bij de arena en sluit de Miniscope aan op de kabel die is gekoppeld aan het data-acquisitiesysteem. Plaats de muis vervolgens in het midden van de arena. Klik in de software voor gedragscamera's op Opname starten.Controleer in NuView LED1, klik op Vastleggen en activeer vervolgens knoppen om de opname te starten. Dit maakt gelijktijdige opnames van calciumbeeldvorming en muisgedrag mogelijk. Druk op Stop na 3.000 frames en sla de bestanden op.Wanneer de opname is voltooid, verdooft u de muis kort met isofluraan, maakt u de miniscoop los van de basis en plaatst u de beschermkap over de basis voordat u de muis terug in zijn thuiskooi plaatst. De celkaart van suboptimale in vivo calciumbeeldvorming bevatte enkele actieve neuronen, terwijl die van succesvolle beeldvorming enkele honderden actieve neuronen in het gefocuste gebied omvatte. In het typische voorbeeld van een mislukte in vivo calciumbeeldvorming, werd waargenomen dat het gebied donker was en minder dan vijf actieve neuronen bevatte, of het gebied was helder maar had geen actieve neuronen.In de representatieve analyse worden de maximale fluorescentiecelkaart en calciumtransiënten van een opeenvolgende in vivo calciumbeeldvormingsregistratie getoond. De postmortale beoordeling voor GCaMP6f-expressie en GRIN-lensimplantatie in de mediale PFC van een experimentele muis gaf aan dat GCaMP6f tot expressie werd gebracht en dat de GRIN-lens precies in het gewenste hersengebied werd geïmplanteerd. Om een goede calciumbeeldvorming te verkrijgen, is het noodzakelijk om ervoor te zorgen dat het bloeden volledig is gestopt en het veld vrij is van bloedstolsels voordat de GRIN-lens wordt geïmplanteerd.Deze techniek kan worden gebruikt om neurale circuitveranderingen in muismodellen van verschillende menselijke hersenaandoeningen te bestuderen en te testen of een kandidaat-geneesmiddel de veranderde circuits kan normaliseren.

stereotaxic-viral-injection-gradient-index-lens-implantation-for-deep

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Om te begrijpen netwerk dynamiek van microcircuits in de neocortex, is het essentieel om tegelijkertijd op te nemen van de activiteit van een groot aantal neuronen. In-vivo twee-foton calcium beeldvorming is de enige methode die het mogelijk maakt een op te nemen van de activiteit van een dichte neuronale populatie met single-cell resolutie.

In vivo 2-Photon Imaging Calcium in Layer 2 / 3 van Muizen

In dit artikel tonen we een methode om glazen capillaire naalden te maken met een 50-um lumen. Deze techniek vermindert de schade aan de hersenen, minimaliseert passieve diffusie van geneesmiddelen en maakt een nauwkeurige targeting naar de knaagdieren hersenen.

Targeting van Deep Brain Structuren met micro-injecties voor de levering van drugs, virale vectoren, of Cell Transplantaties

Source: Lee, H. et. al., Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates in vivo calcium imaging in a mouse using a gradient refractive index, or GRIN lens, and a miniaturized microscope. The setup combines head fixation within a frictionless mobile cage system, stimulating neurons and triggering calcium ion influx. The GRIN lens captures calcium signaling in the brain, enabling...

Real-Time Microendoscopic Calcium Imaging in a Freely Moving Mouse

Source: Thapa, R., et. al., Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging. J. Vis. Exp. (2021)The video demonstrates real-time calcium imaging using a miniscope in a transduced mouse, correlating neuronal activity with behavior.

Real-Time Calcium Imaging of a Mouse Medial Prefrontal Cortex Using a Miniscope

Hier beschrijven we de experimentele procedures betrokken bij twee-foton beeldvorming van de muis cortex tijdens gedrag in een virtual reality omgeving.

Twee-foton Beeldvorming Calcium in Muizen navigeren van een Virtual Reality-omgeving

In vivo micro-endoscopische calciumbeeldvorming is een onschatbaar hulpmiddel dat real-time monitoring van neuronale activiteiten bij vrijdragende dieren mogelijk maakt. Het toepassen van deze techniek op de amygdala was echter moeilijk. Dit protocol is bedoeld om een nuttige richtlijn te bieden voor het succesvol richten op amygdalacellen met een geminiaturiseerde microscoop bij muizen.

Succesvolle In vivo Calcium Imaging met een Head-Mount Miniaturized Microscope in de Amygdala van Freely Behaving Mouse

We presenteren een protocol om de hersenstam van volwassen muizen van de ventrale kant bloot te leggen. Door een gradiënt-brekingsindexlens met een miniatuurmicroscoop te gebruiken, kan calciumbeeldvorming worden gebruikt om de activiteit van inferieure olijfneurale somata in vivo te onderzoeken.

In vivo Calcium beeldvorming in muis inferieure olijf

De krimp van tandcement tijdens het uitharden verdringt de bodemplaat. Dit protocol minimaliseert het probleem door een eerste fundering van het tandcement te creëren dat ruimte overlaat om de bodemplaat te cementeren. Weken later kan de bodemplaat op deze steiger worden gecementeerd met weinig nieuw cement, waardoor krimp wordt verminderd.

Baseplating en een miniscoop preanchored met een objectieve lens gebruiken voor calciumtransiënt onderzoek bij muizen

De gyrus dentatus van de hippocampus vervult essentiële en verschillende functies bij het leren en het geheugen. Dit protocol beschrijft een reeks robuuste en efficiënte procedures voor in vivo calciumbeeldvorming van korrelcellen in de gyrus dentatus bij vrij bewegende muizen.

In vivo calciumbeeldvorming van korrelcellen in de getande gyrus van de hippocampus bij muizen 

Dit protocol beschrijft in vivo calciumbeeldvorming van hypothalamische neuronen met behulp van een miniaturiseerde microscoop (miniscoop) bij vrij handelende muizen tijdens sociale toestandmanipulatie (sociale isolatie en sociale hereniging). Deze methode maakt beeldvorming mogelijk met enkelneuronresolutie van de hypothalamische activiteit die sociale behoefte en sociale verzadiging vertegenwoordigt, waardoor mechanistische studies van sociale homeostase mogelijk zijn.

In Vivo Calciumbeeldvorming met een miniaturiseerde microscoop in de hypothalamus om sociale gedragingen bij muizen te begrijpen

Leer een chirurgisch protocol voor virale injectie en GRIN-lensimplantatie om calciumbeeldvorming in diepe hersengebieden van vrij bewegende muizen mogelijk te maken. Deze methode ondersteunt grootschalige, celtype-specifieke opnames.

Stereotaxische virale injectie en gradiënt-index lensimplantatie voor diepe hersenen in vivo calciumbeeldvorming

Meer video's verkennen