Name: Immunopeptidomics: isolatie van muis en humane MHC klasse I- en II-geassocieerde peptiden voor massaspectrometrie-analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Leer een eenvoudige methode voor immunopeptidomics om MHC klasse I- en II-peptiden te isoleren uit muis- en humane cellijnen voor massaspectrometrie-analyse. Dit protocol is toegankelijk voor elk laboratorium.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Pierre Thibault, Eric Bonneil, Joël Lanoix, Caroline Côté (Institute for Research in Immunology and Cancer, Université de Montréal) en Anthony Purcell (Monash University) voor hun inzichtelijke opmerkingen. Dit werk werd ondersteund door financiering van het Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS), de Cole Foundation, CHU Sainte-Justine en de Charles-Bruneau Foundations, Canada Foundation for Innovation, de National Sciences and Engineering Research Council (NSERC) (#RGPIN-2020-05232) en de Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (#174924).

Het hier verstrekte protocol is aangepast van de vastgestelde protocollen13,14,15,16,17,18,19,20. De algemene procedure voor de immunoaffiniteitszuivering (IP) van MHC klasse I en II peptiden wordt geïllustreerd in figuur 1. Zie tabel met materialen voor details over de gebruikte cellijnen en antilichamen.
1. Kralenkoppeling met de antilichamen (dag 1): Koppeling van antilichamen aan sepharose CNBr-geactiveerde kralen
OPMERKING: Bereid nieuwe oplossingen voor elk nieuw experiment voor. Raadpleeg de tabel met materialen en aanvullende tabel 1 voor de lijst van recepten voor reagentia en oplossingen. Alle stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (RT). Controleer bij gebruik van een nieuw antilichaam de bindingsefficiëntie door belangrijke aliquots te verzamelen (zie de indicatie OPTIONAL) en Coomassie blue staining SDS-PAGE uit te voeren (figuur 2).
<ol><li>Activering van de sepharose CNBr kralen<ol>
<li>Weeg 80 mg sepharose CNBr-geactiveerde kralen per monster af en breng ze over in een conische buis van 15 ml.</li>
		<li>Om de resuspensie van gedroogde kralen te vergemakkelijken, voegt u eerst 5 ml van 1 mM HCl toe en pipetteer 5 keer op en neer. Vul vervolgens de conische buis met een extra 8,5 ml van 1 mM HCl.</li>
		<li>Draai met 20 tpm (omwentelingen per minuut) gedurende 30 minuten bij RT met behulp van een rotatorapparaat. Centrifugeer de kralen bij 200 x g gedurende 2 minuten bij RT en verwijder het supernatant door aspiratie.</li>
		<li>Voeg 500 μL koppelingsbuffer toe aan de kralenkorrel en breng over op een nieuwe centrifugebuis van 2,0 ml en houd deze apart voor stap 1.2.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Koppeling van antilichamen aan CNBr-geactiveerde kralen<ol>
<li>Bereid het antilichaam dat is geselecteerd voor de isolatie van de MHC klasse I- of II-peptiden in een nieuwe microcentrifugebuis van 2,0 ml door 2 mg van het antilichaam toe te voegen (volgens de door de fabrikant opgegeven concentratie). Vul het volume aan tot 1 ml met de koppelingsbufferoplossing om een eindconcentratie van 2 mg/ml te krijgen.</li>
		<li>Centrifugeer de kralen uit stap 1.1.4 bij 200 x g gedurende 2 minuten bij RT en verwijder vervolgens het supernatant door aspiratie.</li>
		<li>Voeg de antilichaamoplossing toe aan de microcentrifugebuis van 2,0 ml die de geactiveerde kralen bevat.</li>
		<li>(OPTIONEEL) Neem een aliquot van 18 μL (INPUT), voeg 6 μL 4x SDS-PAGE buffer toe en vries onmiddellijk in.</li>
		<li>Draai de microcentrifugebuis vanaf stap 1.2.3 gedurende 120 minuten bij 20 tpm met behulp van een rotatorapparaat. Centrifugeer de kralen gedurende 2 min bij 200 x g en verwijder vervolgens het supernatant.</li>
		<li>(OPTIONEEL) Neem een aliquot van 18 μL van het supernatant (ongebonden antilichaam), voeg 6 μL 4x SDS-PAGE buffer toe en vries onmiddellijk in.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Blokkeren en wassen van antilichaam gekoppelde kralen<ol>
<li>Voeg 1 ml 0,2 M glycine toe aan de microcentrifugebuis die de antilichaamgekoppelde kralen uit stap 1.2.5 bevat. Draai bij 20 rpm gedurende 60 minuten bij RT met behulp van een rotatorapparaat.</li>
		<li>Centrifugeer de kralen gedurende 2 minuten bij 200 x g en verwijder vervolgens het supernatant. Voeg 1 ml PBS (Fosfaat-gebufferde zoutoplossing) toe.</li>
		<li>Centrifugeer de kralen gedurende 2 minuten bij 200 x g en verwijder vervolgens het supernatant.</li>
		<li>(OPTIONEEL) Neem een aliquot van 18 μL van het supernatant (ongebonden antilichaam, laatste wasbeurt), voeg 6 μL 4x SDS-PAGE buffer toe en vries onmiddellijk in.</li>
		<li>Voeg in stap 1.3.3 1 ml PBS toe aan de kralen.</li>
		<li>(OPTIONEEL) Neem een aliquot van 18 μL kralenmengsel (kralen gekoppeld aan antilichaam), voeg 6 μL 4x SDS-PAGE-buffer toe en vries onmiddellijk in.</li>
		<li>Bewaren bij 4 °C tot gebruik op dezelfde dag in stap 2.5. OPMERKING: Kralen kunnen de dag voor de immunocapture worden bereid, maar langere opslag is niet getest.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Cellyse en immunocapture met antilichaam gekoppelde kralen (dag 1)
OPMERKING: Het niveau van MHC-moleculen varieert van het ene celtype tot het andere, en de kwantificering van MHC/HLA-moleculen per cel wordt gesuggereerd21 (figuur 4A). We raden minimaal 1 x 108 cellen aan voor elk IP-adres. Dit aantal cellen komt overeen met 6-10 mg eiwit uit JY-, EL4- en A20-cellen opgelost met 0,5% Chaps-buffer. Om celpellets voor IP's te bereiden, moeten cellen tweemaal worden geoogst, gecentrifugeerd en gewassen met 5 ml PBS. Vervolgens kunnen celpellets worden opgeslagen in een microcentrifugebuis van 1,5 ml of een conische buis van 15 ml bij -80 °C tot het moment van het IP. Merk op dat IP's kunnen worden uitgevoerd op vers geoogste of bevroren celkorrels.
<ol><li>Om MHC klasse I of II peptiden te isoleren, ontdooi een bevroren pellet van 1 x 108 cellen door de bodem van de buis met de palm te verwarmen. Voeg 500 μL PBS toe aan de pellet en pipetteer op en neer totdat de suspensie homogeen is. OPMERKING: Afhankelijk van het celtype kan het volume van de celpellet aanzienlijk variëren. Als 500 μL PBS niet genoeg is om de celkorrel op te lossen, gebruik dan meer PBS totdat de cellen gemakkelijk uiteenvallen terwijl ze op en neer pipetteren.</li>
	<li>Meet het totale volume van de pellet die in PBS is geresuspendeerd en breng over in een nieuwe buis van 2 ml microcentrifugebuis. Splits indien nodig in meer buizen.</li>
	<li>Voeg een volume cellysisbuffer toe (1% chaps-buffer in PBS met proteaseremmers, 1 pellet/10 ml buffer) gelijk aan het volume celpellet dat in PBS is geresuspendeerd, gemeten in de vorige stap. De uiteindelijke concentratie van de lysisbuffer is 0,5% Chaps.</li>
	<li>Draai gedurende 60 minuten bij 4 °C met 10 tpm met behulp van een rotator. Centrifugeer het cellysaat bij 18.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C met volledige rem en breng het supernatant (met de MHC-peptidecomplexen) over in een nieuwe microcentrifugebuis van 2,0 ml.</li>
	<li>Herstel de antilichaam-gekoppelde kralen uit stap 1.3.7 door centrifugering bij 200 x g gedurende 2 minuten en verwijder het supernatant.</li>
	<li>Breng het cellysaatsupernatant in stap 2.4 over op de aan antilichamen gekoppelde kralen en incubeer met rotatie (10 rpm) gedurende 14-18 uur ('s nachts) bij 4 °C met behulp van een rotatorapparaat.</li>
</ol>3. Elutie van MHC-peptiden (dag 2)
OPMERKING: Polypropyleen kolom maakt elutie van MHC-peptide complexen mogelijk met behoud van de kralen in de kolom. Om het aandeel MHC-peptidecomplexen begrensd aan de kralen voor en na zure elutie met 1% TFA (trifluorazijnzuur) te evalueren, is het mogelijk om een western blot uit te voeren met aliquots die bij belangrijke stappen tijdens het protocol zijn genomen (zie de indicatie OPTIONAL). Western blotting in figuur 3 onthult de verrijking van MHC-peptidecomplexen na zure elutie met 1% TFA. De afwezigheid van signaal in deze fractie zou erop wijzen dat de elutiestap niet succesvol was. Merk op dat het aandeel van ongebonden MHC-peptidencomplexen aan de kralen ook parallel kan worden geëvalueerd door western blotting met behulp van een aliquot beschreven in stap 3.1.6.
<ol><li>Elutie van MHC-peptidecomplexen uit het antilichaam gekoppelde kralen<ol>
<li>Verwijder het onderste deksel van de polypropyleenkolom, plaats de kolom op het polypropyleen kolomrek en installeer er een lege container onder om de doorstroom op te vangen. OPMERKING: Eén kolom per monster is vereist.</li>
		<li>Spoel de polypropyleen kolom af met 10 ml buffer A en laat deze door de zwaartekracht uitlekken. Als de stroomsnelheid van de vloeistofelutie te langzaam is, snijdt u de onderste punt van de polypropyleenkolom verder af.</li>
		<li>Meet en verzamel het kralen-lysaatmengsel (~ 2 ml) uit stap 2.5 en breng het over in de polypropyleenkolom.</li>
		<li>(OPTIONEEL) Neem een aliquot van 20 μL (of 1/100 van het totale volume) voor western blotting en vries onmiddellijk in. Deze fractie komt overeen met de totale MHC-peptidecomplexen geïncubeerd met de kralen.</li>
		<li>Laat het vloeibare mengsel door de zwaartekracht elueren.</li>
		<li>(OPTIONEEL) Verzamel en meet de doorstroming en neem een aliquot van 20 μL (of 1/100 van het totale volume) voor western blotting en vries onmiddellijk in. Deze fractie vertegenwoordigt de resterende ongebonden MHC-peptiden complexen.</li>
		<li>Om het kralen-lysaatmengsel zoveel mogelijk terug te winnen, spoelt u de buis uit stap 3.1.3 met 1 ml buffer A en brengt u deze over naar de polypropyleenkolom.</li>
		<li>Was de kralen die in de polypropyleenkolom zijn achtergebleven door 10 ml buffer A toe te voegen. Laat de wasbuffer door de zwaartekracht elueren.</li>
		<li>Herhaal de wasstap met 10 ml buffer B, 10 ml buffer A en vervolgens 10 ml buffer C.</li>
		<li>Verwijder de polypropyleenkolom uit het rek en plaats deze op de bovenkant van een nieuwe microcentrifugebuis van 2,0 ml. Houd de kolom en de buis samen met de hand.</li>
		<li>Voeg 300 μL 1% TFA toe aan de polypropyleenkolom en meng de kralen door 5 keer op en neer te pipetteren. OPMERKING: De kralen worden bewaard in de polypropyleenkolom en de MHC-gebonden peptiden elueren in de microcentrifugebuis van 2,0 ml.</li>
		<li>Breng het eluaat over in een nieuwe microcentrifugebuis van 2,0 ml. Herhaal stap 3.1.11 en pool de 2 eluaten (de eluaten die de MHC-peptidecomplexen bevatten, moeten overeenkomen met een totaal van 600 μL en zullen worden gebruikt bij stap 3.2.4).</li>
		<li>(OPTIONEEL) Verzamel een aliquot van 6 μL (of 1/100 van het totale volume) voor western blotting en vries onmiddellijk in. Deze fractie komt overeen met de MHC-peptidecomplexen die uit de kralen zijn geëlueerd.</li>
	</ol></li>
	<li>Ontzouting en elutie van MHC-peptiden OPMERKING: Ontzouting en elutie van MHC-peptidenstappen kunnen worden uitgevoerd door de C18-kolom op een microcentrifugebuis van 2,0 ml te installeren. Voor een betere pasvorm installeert u de door de fabrikant geleverde gloeiopeningen tussen de C18-kolom en de microcentrifugebuis van 2,0 ml. In dit protocol wordt een C18-kolom gebruikt met een volumecapaciteit van 5-200 μL (6-60 μg). Alle stappen worden uitgevoerd bij RT.<ol>
<li>Voeg 200 μL Methanol toe bovenop de kolom C18 en centrifugeer vervolgens gedurende 3 minuten bij 1546 x g . Gooi de doorstroming weg.</li>
		<li>Voeg 200 μL 80%ACN (acetonitril)/0,1%TFA toe aan de C18-kolom en centrifugeer vervolgens gedurende 3 minuten bij 1546 x g . Gooi de doorstroming weg.</li>
		<li>Voeg 200 μL van 0,1% TFA toe aan de C18-kolom en centrifugeer vervolgens gedurende 3 minuten bij 1546 x g . Gooi de doorstroming weg.</li>
		<li>Laad 200 μL van de MHC-peptidecomplexen uit stap 3.1.12 bovenop de kolom C18. Centrifugeer bij 1546 x g gedurende 3 minuten en gooi de doorstroming weg.</li>
		<li>Herhaal stap 3.2.4 tweemaal totdat het volledige volume is geladen. Merk op dat MHC-peptiden worden bewaard in de kolom C18.</li>
		<li>Voeg 200 μL van 0,1% TFA toe aan de kolom C18 en centrifugeer vervolgens gedurende 3 minuten bij 1546 x g . Gooi de doorstroming weg.</li>
		<li>Breng de C18-kolom over in een nieuwe microcentrifugebuis van 2,0 ml. Elute MHC-peptiden uit de C18-kolom door 150 μL van 28%ACN/0,1%TFA toe te voegen.</li>
		<li>Centrifugeer bij 1546 x g gedurende 3 min.</li>
		<li>Breng de doorstroming over in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml. Pas op dat u de doorstroming niet weggooit; het bevat de geïsoleerde MHC klasse I of II peptiden.</li>
		<li>Herhaal stap 3.2.7-3.2.9 tweemaal voor een totaal volume van 450 μL.</li>
		<li>Vries de 450 μL eluaat (gezuiverde MHC klasse I of II peptiden) in bij -20 °C totdat monsters worden geanalyseerd door LC-MSMS.</li>
		<li>Voorafgaand aan de LC-MS/MS-analyse worden de gezuiverde MHC klasse I of II peptiden uit stap 3.2.11 verdampt tot droogheid met behulp van een vacuümconcentrator met presets van 45 °C gedurende 2 uur, vacuümniveau: 100 mTorr en vacuüm ramp: 5. OPMERKING: De verdamping van bevroren monsters is zeer efficiënt. Gedroogde peptiden kunnen opnieuw worden ingevroren tot analyse.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Identificatie van MHC klasse I en II peptiden door LC-MS/MS
OPMERKING: Analyseer de MHC klasse I en II immunopeptidome met behulp van een High-performance Orbitrap en hoge resolutie quadrupole time-of-flight massaspectrometers6. De volgende informatie wordt slechts als indicatie gegeven, rekening houdend met het feit dat de verschillende bestaande tandemmassaspectrometrie-instrumenten volgens verschillende operationele normen werken. Een kort overzicht van de stappen wordt hieronder besproken:
<ol><li>Oplos de gedroogde monsters (vanaf stap 3.2.12) op in 50 μL van 4% mierenzuur (FA).</li>
	<li>Laad drie injecties van 16 μL voor elk monster en afzonderlijk op een zelfgemaakte omgekeerde fasekolom (150-μm i.d. bij 250 mm lengte, Jupiter 3 μm C18 300 Å) met een gradiënt van 5%-30% ACN-0,1% FA en een 600 nL/min debiet op een nano-flow UHPLC aangesloten op een MS.</li>
	<li>Verkrijg elk volledig MS-spectrum met een resolutie van 120000, een AGC van 4 x 105 met automatische modus voor de injectietijd en spectra met behulp van tandem-MS (MS-MS) op de meest voorkomende vermenigvuldigde geladen precursorionen gedurende maximaal 3 s. OPMERKING: Tandem-MS-experimenten worden uitgevoerd met behulp van hogere-energie collisional dissociation (HCD) bij een botsingsenergie van 30%, een resolutie van 30.000, een AGC van 1,5 x 105 en een injectietijd van 300 ms.</li>
	<li>Verwerk de gegevensbestanden van de drie injecties/monster met behulp van een proteomics LC-MS/MS-analysesoftware (bijv. PEAKS X) met behulp van de muis- en menselijke databases (UniProtKB/Swiss-Prot (2019_09)).</li>
	<li>Selecteer 'Niet-gespecificeerde enzymvertering' voor de enzymparameter en 10 ppm en 0,01 Da voor massatoleranties op respectievelijk precursor- en fragmentionen. OPMERKING: Variabele modificaties zijn deamidatie (NQ) en oxidatie (M). Alle andere zoekparameters zijn de standaardwaarden. Uiteindelijke peptidelijsten worden gefilterd met alc van 80% en met een false discovery rate (FDR) van 1% met behulp van de proteomics LC-MS/MS analysesoftware.</li>
</ol>5. Visualisatie van immunopeptidomics data
OPMERKING: De kwaliteit van immunopeptidomics-gegevens die door MS worden gegenereerd, kan op meerdere manieren worden beoordeeld, zoals onlangs beschreven22,23. Om de gegevens te visualiseren en hun algehele kwaliteit, samenstelling en MHC-specificiteit te beoordelen, kan de MhcVizPipe (MVP) softwaretool worden gebruikt.
<ol><li>Volg alle instructies en gerelateerde documentatie om de MVP-software te installeren en uit te voeren die beschikbaar is op de Caron Lab GitHub-website24. OPMERKING: MVP biedt een snel en geconsolideerd beeld van de kwaliteit, samenstelling en MHC-specificiteit van de steekproef. MVP parallelliseert het gebruik van gevestigde immunopeptidomics-algoritmen (NetMHCpan25, NetMHCIIpan26 en GibbsCluster27) en genereert georganiseerde en gemakkelijk te begrijpen rapporten in HTML-indeling (HyperText Markup Language). De rapporten zijn volledig draagbaar en kunnen worden bekeken op elke computer met een moderne webbrowser. Zie Aanvullende gegevens 1-4 voor voorbeelden van HTML-rapporten.</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Twee muiscellijnen (EL4 en A20), één menselijke cellijn (JY) en vijf in de handel verkrijgbare antilichamen [M1 (anti-H2Db/Kb), Y3 (anti-H2Kb), M5 (anti-H2-IAd/IEd), W6/32 (anti-HLA-ABC) en L243 (anti-HLA-DR)] werden getest en gevalideerd in de context van dit protocol en leveren hoogwaardige immunopeptidomics-gegevens. Andere anti-HLA-antilichamen zijn beschikbaar (bijv. Anti-HLA-A2 BB7.2), maar zijn hier niet getest. Merk op dat het W6/32-antilichaam veel wordt gebruikt en het meest gevestigde antilichaam in het veld is; het maakt de isolatie mogelijk van peptiden die door alle HLA-ABC-moleculen bij mensen worden gepresenteerd en werd eerder gemeld door deskundige laboratoria om te werken vanuit verschillende biologische bronnen zoals verse of bevroren weefsels8,39, perifere mononucleaire bloedcellen en beenmerg mononucleaire cel40, biopsieën41, xenografts41,42, autopsies43 en plasmamonsters44,45.
De bereiding van nieuwe oplossingen die in het hele protocol worden gebruikt, is van cruciaal belang. Met name het gebruik van verse zure oplossingen in glazen flessen is van cruciaal belang om latere verontreiniging van de door MS geanalyseerde monsters te voorkomen. Daarnaast is het bij de eerste keer en/of met een nieuw antilichaam belangrijk om te beoordelen of het antilichaam inderdaad gekoppeld is aan de CNBr Sepharose kralen met behulp van een blauwe Coomassie gel. De wasstappen van de antilichaam gekoppelde kralen na immunocapture van de MHC-peptidecomplexen zijn ook van cruciaal belang om besmetting van niet-MHC-peptiden te voorkomen. Ten slotte is speciale zorg vereist om de eluaten niet weg te gooien na de eluaten na de elutie van de MHC-peptidecomplexen met 1% TFA en de elutie van de peptiden uit de C18-kolom met ACN28% / 0,1% FA.
Bestaande protocollen die beschikbaar zijn in de literatuur beschrijven aanvullende stappen om de peptiden verder te zuiveren aan het einde van de isolatieprocedure, bijvoorbeeld peptidefractionering door verschillende methoden14,46 of ultrafiltratie met behulp van 10-30 kDa-filters13,47. Het huidige protocol geeft geen details over die aanvullende stappen en is voldoende om immunopeptidomics van hoge kwaliteit te leveren. Dergelijke stappen kunnen echter door niet-experts worden overwogen om de peptide-isolatieprocedure te wijzigen en problemen op te lossen om deze verder te optimaliseren.
Het type kralen en het type zure elutiebuffer die worden gebruikt om MHC-complexen uit de kralen te elueren, kunnen ook worden gewijzigd voor het oplossen van problemen13,14,15,16,17,18,19. In dit opzicht zijn sepharose CNBr-geactiveerde kralen over het algemeen een goed startpunt, omdat ze relatief goedkoop zijn en bovendien flexibiliteit vertonen in termen van binding met verschillende soorten antilichamen. In het huidige protocol bleken sepharose CNBr-geactiveerde kralen relatief goed te presteren met behulp van vijf verschillende commercieel verkrijgbare antilichamen (d.w.z. M1, Y3, W6/32, L243 en M5). Naast sepharose CNBr-geactiveerde kralen, zijn Protein A of G of A / G sepharose 4 Fast Flow-kralen ook gemakkelijk te hanteren en hoewel relatief duurder, kunnen vergelijkbare resultaten genereren. Een andere factor om te overwegen is de affiniteit van het antilichaam voor eiwit A of G. Verder zijn sepharose magnetische kralen ook zeer gemakkelijk te gebruiken, maar zijn ze relatief duur. Onafhankelijk van het type kralen dat door niet-experts is geselecteerd, wordt het aangemoedigd om aliquots te verzamelen bij kritieke stappen van het protocol en blauwe Coomassie-gekleurde SDS-PAGE-gels uit te voeren om de bindingsefficiëntie van het antilichaam tegen de kralen te volgen, zoals weergegeven in figuur 2.
Een andere belangrijke factor die de effectiviteit van MHC-peptidenisolatie beïnvloedt, verwijst naar het type zure elutiebuffer dat wordt gebruikt om de MHC-peptidecomplexen uit de kralen te isoleren. Er zijn verschillende buffers gemeld, waaronder 0,1%, 1% of 10% TFA, 0,2% FA en 10% azijnzuur. 1% TFA was de elutiebuffer die werkte voor alle geteste antilichamen. Deze stap kan ook worden getraceerd door western blotting tegen de MHC-moleculen die worden gebruikt om MHC-peptiden te vangen, zoals weergegeven in figuur 3.
Alle buffers die acetonitril (ACN) en/of trifluorazijnzuur (TFA) bevatten, zijn agressief en kunnen bij contact met kunststof leiden tot verontreiniging van het monster met kleine moleculaire en polymere stoffen zoals weekmakers. Om dergelijke problemen te voorkomen, worden alle oplossingen die een organisch oplosmiddel en/of TFA bevatten dagelijks vers bereid en tot gebruik in een glazen fles bewaard. Het merendeel van de stappen wordt uitgevoerd in Protein LoBind plastic buis. Deze buizen zijn speciaal ontworpen voor proteomics en zijn gemaakt van de hoogste kwaliteit, nieuw polypropyleen vrij van biociden, weekmakers en latex. Ze worden ook geproduceerd met geoptimaliseerde, hoog gepolijste mallen zonder het gebruik van slipmiddelen. Deze voorzorgsmaatregelen zijn belangrijk om te overwegen om het genereren van hoogwaardige immunopeptidomics-gegevens mogelijk te maken.
Het antilichaam is een belangrijke beperking voor de isolatie van MHC-gebonden peptiden. Het W6/32-antilichaam maakt de isolatie van peptiden mogelijk die door alle HLA-ABC klasse I-moleculen bij mensen worden gepresenteerd en is het meest gebruikte en gevestigde antilichaam in het veld. Hoge-resolutie HLA-typering van niet-gekarakteriseerde menselijke cellijnen of biospecimens is geen noodzaak bij toepassing van het W6/32-antilichaam, maar wordt niettemin aanbevolen voor bepaalde toepassingen om gegevensinterpretatie te vergemakkelijken48. HLA/MHC-type-informatie is ook te vinden in openbare bronnen voor meerdere cellijnen en muismodellen49. Naast het W6/32-antilichaam zijn de vier andere antilichamen (M1, M5, Y3 en L243) die in het kader van dit protocol zijn getest en gevalideerd, allemaal commercieel beschikbaar. Aan de andere kant zijn veel andere antilichamen die werden gemeld in eerdere immunopeptidomicsstudies niet grotendeels overgenomen door de gemeenschap en zijn ze niet commercieel beschikbaar of zijn ze beschikbaar via de kweek van hybridomacellijnen, wat relatief duur is.
Een andere belangrijke beperking voor de isolatie van MHC-gebonden peptiden is de hoeveelheid benodigd uitgangsmateriaal. De benodigde hoeveelheid is omgekeerd evenredig met het expressieniveau van MHC-moleculen op het celoppervlak, dat kan worden gekwantificeerd door flowcytometrie (figuur 4A). Cellen met hoge expressieniveaus van MHC-moleculen (bijv. Dendritische cellen en hematopoëtische cellen in het algemeen) leveren over het algemeen hoogwaardige immunopeptidomics-gegevens op. Expertlaboratoria gebruiken slechts 50 miljoen cellen50, maar 100 miljoen tot 1 miljard cellen worden aanbevolen voor niet-experts. Gebruik van weefselbiopsie (<13 mg)41, xenograft42,43, autopsie44 en plasma45,46 monsters werden ook gemeld, maar blijven een uitdaging voor niet-deskundige laboratoria. Ook is het totale aantal verwachte MHC-geassocieerde peptiden goed gedocumenteerd voor gevestigde cellijnen (hier tussen ~ 2000 en ~ 10000 peptiden, afhankelijk van de gebruikte cellijn en antilichaam), maar de absolute hoeveelheden natuurlijk gepresenteerde peptiden die efficiënt door de techniek worden neergehaald, blijven ter discussie staan. Inderdaad, eerdere studies schatten dat de efficiëntie van de isolatieprocedure peptide-afhankelijk is en kan variëren van zo laag als 0,5% -2% 51. Andere beperkingen in immunopeptidomics zijn de reproduceerbaarheid van de methoden en het onvermogen van de NetMHCpan suite tools om peptiden correct te annoteren aan MHC-allelen die minder gekarakteriseerd zijn. In dit verband, verdere ontwikkeling en toepassing van relatief nieuwe data-onafhankelijke acquisitie MS-methoden7,32,52, evenals nieuwe peptide clustering en MHC peptide binding voorspellingsalgoritmen31,34,53,54 zullen naar verwachting de reproduceerbaarheid en de nauwkeurigheid van peptide-annotatie in immunopeptidomics verbeteren. Immunopeptidomics wordt geconfronteerd met andere beperkingen met betrekking tot MS-acquisitie en computationele analyse van MHC-geassocieerde peptiden en worden elders behandeld1,6,55.
Aangezien de isolatie van HLA-ABC-geassocieerde peptiden uit menselijke monsters met behulp van het W6/32-antilichaam goed ingeburgerd is en op grote schaal wordt toegepast door veel onderzoeksgroepen, is de isolatie van MHC klasse I- en II-geassocieerde peptiden van muizen relatief minder vastgesteld. Daarom zijn robuuste protocollen nodig voor de isolatie van MHC-liganden bij muizen. Hier bieden we een protocol dat is geoptimaliseerd voor de isolatie van MHC klasse I peptiden en MHC klasse II peptiden uit twee muiscellijnen van respectievelijk C57BL/6 en BALB/c oorsprong. In het bijzonder maakt het protocol de isolatie mogelijk van klasse I H2Kb- en H2Db-geassocieerde peptiden met behulp van het M1-antilichaam, evenals klasse II H2-IAd en H2-IED-geassocieerde peptiden met behulp van het M5-antilichaam. Verspreiding en toepassing van het huidige protocol zou dus fundamenteel en translationeel immunopeptidomics-onderzoek in verschillende muismodellen moeten vergemakkelijken.
Het protocol kan worden gebruikt om een immunopeptidomics-workflow op te zetten en te standaardiseren, evenals om nieuwe protocollen te benchmarken. Het kan bijvoorbeeld worden aangepast en verder worden geoptimaliseerd om immunopeptidomics-screening uit te voeren in verschillende biologische matrices, variërend van bloed / plasma tot vers of bevroren weefsel tot FFPE (Formalin-Fixed Paraffin-Embedded). Bovendien zal het protocol de intra- en interlaboratoriumreproduceerbaarheid van de monstervoorbereidingsprocedure in immunopeptidomics bevorderen en zal daarom naar verwachting brede toepassing vinden in fundamenteel en klinisch onderzoek.

In het afgelopen decennium heeft de interesse in het onderzoeken van het repertoire van MHC-geassocieerde peptiden de academische sector overschreden en de biotech- en farmaceutische industrie bereikt. Inderdaad, bij kanker vertegenwoordigt de ontdekking van bruikbare tumorspecifieke neoantigenen een belangrijke onderzoeksfocus in de industriële sector om klinische immunotherapieën te ontwikkelen die leiden tot gepersonaliseerde oncologie1,2,3. Fundamenteel worden MHC-geassocieerde peptiden door het hele lichaam gepresenteerd, weerspiegelen ze het intracellulaire stadium van de cel en zijn ze significant bij verschillende ziekteaandoeningen zoals auto-immuniteit, transplantatie, infectieziekten, ontsteking, kanker en allergieën1,4. MHC-geassocieerde peptiden, of humaan leukocytenantigeen (HLA) liganden bij mensen, zijn dus van groot medisch belang en worden gezamenlijk aangeduid als de immunopeptidome5.
MS is een krachtige analytische benadering om de immunopeptidome6,7 te karakteriseren, inclusief de ontdekking van tumorspecifieke neoantigenen8,9,10,11. Een typische workflow om een immunopeptidomics-experiment uit te voeren omvat drie hoofdstappen: 1) monstervoorbereiding voor de isolatie van MHC-geassocieerde peptiden, 2) gegevensverzameling door MS en 3) gegevensanalyse met behulp van verschillende computationele softwaretools12. Het genereren van hoogwaardige monsters die in dit gevisualiseerde protocol worden beschreven, is van cruciaal belang voor het succes van elk project in ms-gebaseerde immunopeptidomics. Het hieronder beschreven protocol richt zich op het isoleren van MHC klasse I- en II-geassocieerde peptiden uit gevestigde cellijnen die geschikt zijn voor het genereren van hoogwaardige immunopeptidomics-gegevens. Representatieve resultaten van die cellijnen worden weergegeven in het huidige protocol.

<table><tbody><tr><td>A20 cell line</td><td>ATCC</td><td>TIB-208</td><td>muis B-lymfoblast</td></tr><tr><td>Acetonitrile, LC/MS Grade</td><td>FisherScientific</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>anti-Human HLA A, B, C (W6/32) - MHC klasse I</td><td>BioXcell</td><td>BE0079</td><td></td></tr><tr><td>anti-Human/Monkey HLA-DR (L243) - MHC klasse II</td><td>BioXcell</td><td>BE0308</td><td></td></tr><tr><td>anti-Mouse H2 (M1/42.3.9.8) - MHC klasse I</td><td>BioXcell</td><td>BE0077</td><td></td></tr><tr><td>anti-Mouse H2-IAd/IEd (M5/114) - MHC klasse II</td><td>BioXcell</td><td>BE00108</td><td></td></tr><tr><td>anti-Mouse H2Kb (Y3) - MHC klasse I</td><td>BioXcell</td><td>BE0172</td><td></td></tr><tr><td>BupH Phosphate Buffered Saline Packs (PBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>28372</td><td>Inhoud van de zak opgelost in een eindvolume van 500 ml gedeïoniseerd water (FisherScientific, W64)</td></tr><tr><td>CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonaat)</td><td>EMDMilipore</td><td>220201-10MG</td><td></td></tr><tr><td>CNBr-activated Sepharose</td><td>Cytivia</td><td># 17-0430-01</td><td></td></tr><tr><td>EL4 cell line</td><td>ATCC</td><td>TIB-39</td><td>muis T-lymfoblast</td></tr><tr><td>epTIPS LoRetention Tips, 1000 &micro;L/Eppendorf</td><td>FisherScientific</td><td>02-717-352</td><td>Betere resultaten met laag-retentie materiaal</td></tr><tr><td>epTIPS LoRetention Tips, 200 &micro;L/Eppendorf</td><td>FisherScientific</td><td>02-717-351</td><td>Betere resultaten met laag-retentie materiaal</td></tr><tr><td>Formic Acid, LC/MS Grade</td><td>FisherScientific</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>FisherScientific</td><td>RDCG0250500</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid solution</td><td>FisherScientific</td><td>60-007-11</td><td></td></tr><tr><td>JY cell line</td><td>Sigma Aldrich</td><td>94022533-1VL</td><td>EBV-geïmmortaliseerde B-cel lymfoblastoïde lijn</td></tr><tr><td>Methanol, LC/MS Grade</td><td>FisherScientific</td><td>A456-4</td><td></td></tr><tr><td>Poly prep chromatography columns (polypropyleen kolom)</td><td>Bio-Rad</td><td>731-1550</td><td>verwezen als polypropyleen kolom in het protocol</td></tr><tr><td>Proteases inhibitor</td><td>ThermoFisher</td><td>A32963</td><td>1 pellet per 10 mL van cel lysis buffer</td></tr><tr><td>Qifikit</td><td>Dako</td><td>K007811-8</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Amresco</td><td># 0865-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>FisherScientific</td><td>MSX04201</td><td></td></tr><tr><td>Solid phase extraction disk, ultramicrospin column C18</td><td>The nest group</td><td>SEMSS18V</td><td>capaciteit van 6&ndash;60 &micro;g, max volume van 200 &micro;L</td></tr><tr><td>Trifluoroacetic Acid (TFA), LC-MS Grade</td><td>FisherScientific</td><td>PI85183</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>FisherScientific</td><td>T395-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>FisherScientific</td><td>#10812846001</td><td></td></tr><tr><td>Tube LoBind 1.5 mL/Eppendorf</td><td>FisherScientific</td><td>E925000090</td><td>Betere resultaten met laag-retentie materiaal</td></tr><tr><td>Tube LoBind 2 mL/Eppendorf</td><td>FisherScientific</td><td>13-698-795</td><td>Betere resultaten met laag-retentie materiaal</td></tr><tr><td>Water, LC/MS Grade</td><td>FisherScientific</td><td>W64</td><td></td></tr></tbody></table>

immunopeptidomics: isolatie van muis en humane mhc klasse i- en ii-geassocieerde peptiden voor massaspectrometrie-analyse

Immunopeptidomics: Isolation of Mouse and Human MHC Class I- and II-Associated Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Immunopeptidomics is een opkomend veld dat de ontwikkeling van vaccins en immunotherapieën voedt en begeleidt. Meer specifiek verwijst het naar de wetenschap van het onderzoeken van de samenstelling van peptiden gepresenteerd door major histocompatibility complex (MHC) klasse I en klasse II moleculen met behulp van massaspectrometrie (MS) technologieplatforms. Van alle stappen in een ms-gebaseerde immunopeptidomics workflow, is monstervoorbereiding van cruciaal belang voor het vastleggen van hoogwaardige gegevens van therapeutische relevantie. Hier worden stapsgewijze instructies beschreven om MHC klasse I en II-geassocieerde peptiden te isoleren door immunoaffiniteitszuivering uit kwaliteitscontrolemonsters, uit muizen (EL4 en A20) en menselijke (JY) cellijnen meer specifiek. De verschillende reagentia en specifieke antilichamen worden grondig beschreven om MHC-geassocieerde peptiden uit deze cellijnen te isoleren, inclusief de stappen om de kralenbindende efficiëntie van het antilichaam en de elutie-efficiëntie van de MHC-peptidecomplexen uit de kralen te verifiëren. Het protocol kan worden gebruikt om een immunopeptidomics-workflow op te zetten en te standaardiseren, evenals om nieuwe protocollen te benchmarken. Bovendien vormt het protocol een goed uitgangspunt voor alle niet-experts en bevordert het de intra- en interlaboratoriumreproduceerbaarheid van de monstervoorbereidingsprocedure in immunopeptidomics.

De algemene workflow om MHC-peptidecomplexen te isoleren voor de analyse van immunopeptidomen door MS wordt geïllustreerd in figuur 1. Representatieve resultaten voor de verificatie van de parelbindende efficiëntie van het antilichaam (figuur 2) (met behulp van het Y3 anti-H2Kb-antilichaam) en de elutie-efficiëntie van de MHC-peptidecomplexen van de kralen (figuur 3) (met behulp van het W6/32 anti-HLA-ABC-antilichaam) worden getoond. Op flowcytometrie gebaseerde kwantificeringstests21 werden ook toegepast om het absolute aantal MHC klasse I-moleculen per EL4-cel (H2Kb en H2Db) en JY-cel (HLA-ABC) te meten, zoals weergegeven in figuur 4A.
De intra- en interindividuele reproduceerbaarheid van de resultaten met behulp van het huidige protocol zijn weergegeven in figuur 4B-E. Representatieve resultaten worden getoond voor MHC klasse I peptiden geïdentificeerd uit 1 x 108 EL4 cellen en 1 x 108 JY cellen. Er werden resultaten gegenereerd van twee verschillende lableden (gebruiker 1 en gebruiker 2). Voor gebruiker 1 was het gemiddelde aantal MHCI-specifieke peptiden gedetecteerd uit EL4- en JY-cellen respectievelijk 1341 en 6361; voor gebruiker 2, 1933 en 7238 respectievelijk (figuur 4B,D). De gemiddelde variatiecoëfficiënt (CV) voor het aantal gedetecteerde peptiden over drie verschillende biologische replicaties/experimenten varieert van 1,9%-11% (figuur 4B,D). Hoewel de cv's voor het aantal gedetecteerde peptiden in de drie verschillende experimenten relatief klein waren, varieerde de identiteit van de peptiden aanzienlijk (figuur 4C,E). Representatieve Venn-diagrammen laten inderdaad zien dat het aandeel peptiden dat reproduceerbaar werd gedetecteerd over drie biologische replicaties varieerde van 39% (Gebruiker 2, EL4-cellen) tot 63% (Gebruiker 1, JY-cellen) (Figuur 4C, E en Aanvullende Tabel 2).
Heatmaps gegenereerd door de MVP-software tonen voorspelde MHC-bindingssterkte van de geïdentificeerde peptiden met behulp van de NetMHCpan suite tools25,26,28. Twee GibbsCluster routine-opties, die 'Unsupervised GibbsCluster' en 'Allele-Specific GibbsCluster' worden genoemd, worden ook uitgevoerd door MVP om MHC-peptidebindende motieven te extraheren. Merk op dat MVP beperkingen heeft; het primaire doel is niet om allel-specifieke motieven te extraheren en peptiden op een zeer nauwkeurige manier te annoteren, maar om eerder een vogelperspectief te bieden op de algehele kwaliteit, samenstelling en MHC-specificiteit van de monsters.
Voor MHC klasse I (H2Db en H2Kb) peptiden in EL4 cellen (Figuur 5A; bovenste panelen en Aanvullende Gegevens 1) laat een representatieve heatmap zien dat 89% van alle gedetecteerde 8-12-mer peptiden naar verwachting Sterke Bindmiddelen (SB: NetMHCpan %Rank <0.5) of Zwakke Bindmiddelen (WB: NetMHCpan %Rank <2) zijn voor H2Db- of H2Kb-moleculen. Sequentieclusters gegenereerd uit de 8-12-mer peptiden zijn in overeenstemming met gerapporteerde logo's voor H2Db (asparagine bij P5 en Leucine bij P9) en H2Kb (fenylalanine bij P5 en leucine bij P8) (Figuur 5)29. Het is vermeldenswaard dat een derde dominant motief (histidine bij P7 en leucine bij P9) en aanvullende 'artefactuele' motieven kunnen worden waargenomen met behulp van het M1-antilichaam (aanvullende gegevens 1). In feite is bekend dat het M1-antilichaam kruisreacties vertoont met het niet-klassieke Qa2-molecuul, en daarom worden Qa2-geassocieerde peptiden ook gedetecteerd door MS (aanvullende gegevens 1). Hier, voor de eenvoud, richt figuur 5 zich op het tonen van de gevestigde peptidebindingsmotieven voor de twee klassieke H2b-allelen (d.w.z. H2Db of H2Kb) uitgedrukt in EL4-cellen.
Voor menselijke HLA klasse I (HLA-ABC) peptiden in JY-cellen (Figuur 5A; onderste panelen en Aanvullende Gegevens 2), laat een representatieve heatmap zien dat 97% van alle gedetecteerde 8-12-mer peptiden worden voorspeld als SB of WB voor HLA-A*0201, -B*0702 of -C*0702. Peptiden werden geclusterd om peptidebindingsmotieven voor HLA-A* 0201 en -B * 0702 te visualiseren. Het bindingsmotief voor HLA-C*0702 is niet weergegeven in figuur 5A omdat het C*0702-allel een relatief laag expressieniveau heeft. Daarom werden te weinig C*0702-peptiden geïsoleerd en geïdentificeerd om een representatief C*0702-motief te genereren. Merk op dat het C*0702-motief kan worden gevisualiseerd in andere studies30,31,32 of vanaf de NetMHCpan 4.1 Motif Viewer-website33.
Voor menselijke HLA klasse II (HLA-DR) peptiden in JY-cellen (Figuur 5B; bovenste panelen en Aanvullende Gegevens S3), toont een representatieve heatmap aan dat 70% van alle gedetecteerde 9-22-mer peptiden worden voorspeld als SB of WB voor HLA-DRB1 * 0404 en -DRB1 * 1301. Peptidebindingsmotieven voor deze twee allelen zijn getoond (figuur 5B). Merk op dat de hier getoonde peptidebindende motieven mogelijk niet volledig in overeenstemming zijn met de recent gerapporteerde logo's voor HLA-DRB1 * 0404 en -DRB1 * 130134. Deze discrepantie benadrukt het huidige onvermogen van MVP / NetMHCpan om peptiden nauwkeurig te annoteren aan HLA klasse II-allelen die minder gekarakteriseerd zijn, zoals HLA-DRB1 * 0404 en -DRB1 * 1301 uitgedrukt in JY-cellen. Aanvullende informatie over klasse II peptide bindingsmotieven is te vinden in andere studies34,35 en op de NetMHCIIpan 4.0 Motif Viewer website36.
Ten slotte, voor muis MHC klasse II (H2-IAd en H2-IEd) peptiden in A20 cellen (Figuur 5B; onderste panelen en Aanvullende Gegevens 4), toont een representatieve heatmap aan dat 87% van alle gedetecteerde 9-22-mer peptiden worden voorspeld als SB of WB voor H2-IAd of H2-IEd. Peptidebindingsmotieven voor deze twee allelen zijn in overeenstemming met gerapporteerde logo's37.
Volledige HTML-rapporten gegenereerd door de MVP-software om de algehele kwaliteit en MHC-specificiteit van de monsters te beoordelen, zijn beschikbaar in Aanvullende gegevens 1-4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63052/63052fig01.jpg"> Figuur 1: Schema van de volledige procedure voor de isolatie van MHC klasse I en II peptiden. (A-B)100 miljoen cellen worden gepelleteerd en gelyseerd met 0,5% Chaps buffer. (C) Het cellysaat wordt gecentrifugeerd en het supernatant wordt toegevoegd aan CNBr-sepharose-kralen gekoppeld aan het gewenste antilichaam vooraf en (D) geïncubeerd 14-18 uur bij 4 °C. (E) Na immunocapture worden de kralen overgebracht in een polypropyleenkolom en gewassen, en de MHC-peptidecomplexen worden geëlueerd met een 1% TFA-oplossing. (F) De peptiden worden ontzout en geëlueerd met behulp van een C18-kolom. (G) Vervolgens worden peptiden speed vac gedroogd en geanalyseerd door tandem massaspectrometrie. (H) De kwaliteit van de geïsoleerde MHC klasse I en II peptiden kan worden beoordeeld op basis van de HLA subtypes met behulp van de vrij beschikbare MhcVizPipe software. Figuur gemaakt met BioRender.com (NT22ZL8QSL). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63052/63052fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63052/63052fig02.jpg"> Figuur 2: Coomassie-gelkleuring om de antilichaambindingsefficiëntie tegen sepharose CNBr-geactiveerde kralen te volgen. Aliquots van equivalente volumes werden geladen op 12% SDS-PAGE-gel gevolgd door Coomassie blue staining: kralen + antilichaamvoorkoppeling (1), ongebonden antilichaam na koppelingsstap (2), supernatant na laatste wasbeurt na koppeling (3) en kralen gekoppeld aan antilichaam (4). De efficiëntie van de binding wordt geïllustreerd door een significante afname van de signaalkleuringsintensiteit van de lichte en zware ketens van H2Kb wanneer kralen covalent gebonden zijn (Lane 4) aan de CNBr-kralen in vergelijking met het antilichaam vóór de koppeling (Lane 1). De figuur is herdrukt en aangepast van bioRxiv38. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63052/63052fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63052/63052fig03.jpg"> Figuur 3: Western blotting voor het volgen van MHC-peptidecomplexen na zure elutie van antilichaam-gekoppelde CNBr-geactiveerde kralen. Aliquots uit de stappen die in het protocol zijn aangegeven (1/100 van het totale gemeten volume) werden op een 12% SDS-PAGE-gel geladen en overgebracht op nitrocellulosemembraan: Kralen + lysaat na immunocapture en laatste wasbeurt (A); supernatant van de laatste was (B) en MHC-peptide complexen geëlueerd uit de kralen (C). Het sterke detectiesignaal van de MHC-peptidecomplexen in (C) met behulp van anti-HLA-ABC zware keten antilichaam (Abcam, #ab 70328, 1:5000) bevestigde de isolatie van MHC-peptidecomplexen na zure elutie. Merk op dat het mogelijk is om het aandeel MHC-peptidecomplexen te beoordelen dat niet werd gevangen door de antilichaam gekoppelde kralen door de doorstroming van stap 3.1.6 te verzamelen. Een aliquot kan worden toegevoegd aan de western blot (niet weergegeven op deze gel). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63052/63052fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63052/63052fig04.jpg"> Figuur 4: Identificatie van MHC klasse I peptiden uit JY en EL4 cellen. (A) Histogram met het absolute aantal H2Db- en H2Kb-moleculen van het celoppervlak per EL4-cel en van HLA-ABC-moleculen per JY-cel. Kwantificering werd uitgevoerd door middel van flowcytometrie. Gemiddelde en standaardfout van het gemiddelde werden verkregen uit drie biologische replicaties. (B, D) Histogram met het gemiddelde aantal en de standaarddeviatie van het gemiddelde van MHC klasse I peptiden geïdentificeerd door twee onafhankelijke gebruikers (USER_1 [U1] en USER_2 [U2]). Het gemiddelde aantal en de standaardafwijking van het gemiddelde van MHC klasse I peptiden gedetecteerd uit muis EL4 cellen (B) en menselijke JY cellen (D) worden getoond. Variatiecoëfficiënten (CV) over drie onafhankelijke biologische replicaties zijn aangegeven. (C, E) Venn-diagrammen die het aantal peptiden laten zien dat reproduceerbaar werd gedetecteerd in EL4 (C) en JY-cellen (E) door twee onafhankelijke gebruikers (U1 en U2) in drie onafhankelijke biologische replicaties. Figuur 4A is herdrukt en aangepast van bioRxiv38. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63052/63052fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63052/63052fig05.jpg"> Figuur 5: Visualisatie van immunopeptidomics-gegevens met behulp van de MVP-softwaretool. Data-analyse van muis en mens (A) MHC klasse I en (B) MHC klasse II peptiden. Representatieve bindingsaffiniteit heatmaps (linker panelen) en peptide bindingsmotieven (rechter panelen) worden getoond. Heatmapkleuren vertegenwoordigen de MHC-bindingsaffiniteit voorspeld door NetMHCpan 4.1 (%rank). Sterke bindmiddelen zijn rood (%rang <0,5), zwakke bindmiddelen zijn blauw (%rang <2) en niet-bindmiddelen zijn geel (%rang >2). Verhouding (%) van 8-12mer peptiden (A) en 9-22mer peptiden (B) die SB of WB zijn, is tussen haakjes aangegeven. Peptide bindingsmotieven werden gegenereerd door MVP met behulp van de 'Allele-specific Gibbscluster' optie. Deze representatieve resultaten werden verkregen uit 1 x 108 cellen en met behulp van de volgende antilichamen en cellijnen: M1-antilichaam en EL4-cellen voor muis MHC klasse I peptiden; W6/32 antilichaam en JY cellen voor menselijke MHC klasse I peptiden; M5-antilichaam en A20-cellen voor MHC klasse II-peptiden van muizen; L243 antilichaam en JY cellen voor menselijke MHC klasse II peptiden. Raadpleeg de aanvullende gegevens 1-4 om toegang te krijgen tot de volledige HTML-rapporten die door de MVP-software zijn gegenereerd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63052/63052fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullende gegevens 1-4: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63052/SUPPLEMENTARY%20DATA%20S1-S4.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende gegevens 1: HTML-rapport gegenereerd door de MVP-software van peptiden die werden geïsoleerd uit 1 x 108EL4-cellen met behulp van het M1-antilichaam. Er worden drie biologische replicaties getoond. Dit rapport is gerelateerd aan figuur 4 en figuur 5 en representatieve peptiden zijn opgenomen in aanvullende tabel 2.
Aanvullende gegevens 2: HTML-rapport gegenereerd door de MVP-software van peptiden die werden geïsoleerd uit 1 x 108JY-cellen met behulp van het W6/32-antilichaam. Er worden drie biologische replates getoond. Dit rapport is gerelateerd aan figuur 4 en figuur 5, en representatieve peptiden zijn opgenomen in aanvullende tabel 2.
Aanvullende gegevens 3: HTML-rapport gegenereerd door de MVP-software van peptiden die werden geïsoleerd uit 1 x 108JY-cellen met behulp van het L243-antilichaam. Dit rapport is gerelateerd aan figuur 5 en representatieve peptiden zijn vermeld in aanvullende tabel 2.
Aanvullende gegevens 4: HTML-rapport gegenereerd door de MVP-software van peptiden die werden geïsoleerd uit 1 x 108A20-cellen met behulp van het M5-antilichaam. Dit rapport is gerelateerd aan figuur 5 en representatieve peptiden zijn vermeld in aanvullende tabel 2.
Aanvullende tabel 1: Lijst van buffers. Recepten voor alle buffers die in het protocol worden gebruikt, worden beschreven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63052/List%20of%20Buffers-63052R1.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Aanvullende tabel 2: Representatieve lijsten van peptiden geassocieerd met H2Db/Kb, HLA-ABC, HLA-DR en H2-IAd/IEd. Deze tabel bevat de lijsten van representatieve MHC klasse I en II peptiden geïsoleerd uit muis EL4 en A20 cellijnen, respectievelijk, en HLA klasse I en II van menselijke JY cellijn. Deze gegevens zijn gedeponeerd op de ProteomeXchange (PXD028633). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63052/SUPPLEMENTARY%20TABLE%20S2-R2.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
BESCHIKBAARHEID VAN GEGEVENS:
Datasets die in dit manuscript werden gebruikt, werden gedeponeerd op de ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org/cgi/GetDataset): PXD028633.

Hier presenteren we een protocol voor de zuivering van MHC klasse I en klasse II peptidecomplexen uit muis- en menselijke cellijnen die hoogwaardige immunopeptidomics-gegevens leveren. Het protocol richt zich op monstervoorbereiding met behulp van in de handel verkrijgbare antilichamen.

Immunopeptidomics: isolatie van muis en humane MHC klasse I- en II-geassocieerde peptiden voor massaspectrometrie-analyse

Immunopeptidomics is an emerging field that fuels and guides the development of vaccines and immunotherapies. More specifically, it refers to the science ...

Dit protocol is belangrijk omdat het eenvoudig uit te voeren is en binnen het bereik van elk laboratorium ligt. Dit protocol maakt de isolatie van HLA of MHC type I of type II peptiden uit menselijke of muismonsters mogelijk. Deze methode kan wetenschappelijke vragen beantwoorden met betrekking tot alle onderzoeksgebieden met betrekking tot het immuunsysteem, of het nu gaat om kanker, virologie of auto-immuunziekten.Dit protocol is gebouwd om toegankelijk te zijn voor iedereen die in een onderzoekslaboratorium werkt. Volg gewoon de stappen. Begin met het activeren van de Sepharose cyanogeenbromide kralen door 80 milligram per monster te wegen en over te brengen naar een conische buis van 15 milliliter.Voeg vijf milliliter zoutzuur van één millimol toe. Pipetteer vijf keer op en neer om de resuspensie van de gedroogde kralen te vergemakkelijken en vul vervolgens de conische buis met nog eens 8,5 milliliter zoutzuur van één millimol. Draai de kralen bij 20 RPM gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met behulp van een rotatorapparaat.Centrifugeer de kralen bij 200x G gedurende twee minuten bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant door aspiratie. Voeg 500 microliter koppelingsbuffer toe aan het kralenpalet, breng de kraalsuspensie over naar een nieuwe centrifugebuis van twee milliliter en zet deze apart. Voor het koppelen van de antilichamen aan deze kralen, voegt u twee milligram van het geselecteerde antilichaam toe in een nieuwe microcentrifugebuis van twee milliliter en maakt u het volume tot één milliliter met een koppelingsbufferoplossing om een uiteindelijke concentratie van twee milligram per milliliter te krijgen.Breng de eerder bereide kraaloplossing over en voeg deze toe aan de antilichaamoplossing. Draai vervolgens de microcentrifugebuis gedurende 120 minuten met 20 RPM met behulp van een rotatorapparaat, centrifugeer de kralen en verwijder vervolgens het supernatant zoals eerder beschreven. Begin nu met het blokkeren en wassen van de kralen door eerst een milliliter 0,2-molaire glycine toe te voegen aan de microcentrifugebuis met de antilichaam-gekoppelde kralen en draai bij 20 RPM gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur met behulp van een rotatorapparaat.Na het centrifugeren en verwijderen van het supernatant, wast u de kralen met één milliliter PBS, verwijdert u het supernatant door centrifugeren en bewaart u de kralen in één milliliter PBS bij vier graden Celsius tot gebruik. Om MHC klasse I of II peptiden te isoleren, ontdooi je een bevroren palet van 100 miljoen cellen door de bodem van de buis te verwarmen met een handpalm. Voeg 500 microliter PBS toe aan het palet en pipetteer op en neer tot de suspensie homogeen is.Breng de suspensie over in een nieuwe microcentrifugebuis van twee milliliter en voeg een gelijk volume cellysisbuffer toe. Draai met 10 RPM gedurende 60 minuten bij vier graden Celsius met behulp van een rotatorapparaat. Centrifugeer het cellysaat op 18.000x G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius met volledige rem en breng het supernatant over in een nieuwe microcentrifugebuis van twee milliliter.Herstel de antilichaam-gekoppelde kralen door centrifugeren en het verwijderen van het supernatant. Breng vervolgens het cellysaat supernatant over naar de aan antilichamen gekoppelde kralen en incubeer bij 10 RPM gedurende 14 tot 18 uur 's nachts bij vier graden Celsius met behulp van een rotatorapparaat. Verwijder op dag twee het onderste deksel van de polypropyleenkolom, plaats de kolom op het polypropyleen kolomrek en installeer een lege container eronder om de doorstroming op te vangen.Spoel nu de polypropyleen kolom af met 10 milliliter buffer A en laat deze door de zwaartekracht uitlekken. Als de stroomsnelheid van de vloeistofelutie te langzaam is, snijdt u de onderste punt van de polypropyleenkolom verder af. Meet en verzamel het kralen/lysaatmengsel en breng het over in de polypropyleenkolom.Laat het vloeibare mengsel door de zwaartekracht elueren. Verzamel en vries eventueel 20 microliter aliquot in voor Western blotting. Was nu de kralen die in de polypropyleenkolom zijn achtergebleven door 10 milliliter buffer A toe te voegen en deze door de zwaartekracht te laten elueren.Verwijder de polypropyleenkolom uit het rek en plaats deze op de bovenkant van een nieuwe microcentrifugebuis van twee milliliter, waarbij u de kolom en de buis met de hand bij elkaar houdt. Voeg 300 microliter 1% TFA toe aan de polypropyleenkolom en meng de kralen door vijf keer op en neer te spuiten. Breng vervolgens het eluaat over in een nieuwe microcentrifugebuis van twee milliliter.Voor het ontzouten en eluteren van de MHC-peptiden, voeg 200 microliter methanol toe bovenop de C-18-kolom en centrifugeer bij 1, 546x G gedurende drie minuten om de doorstroming weg te gooien. Voeg 200 microliter 80% acetonitril in 0,1% TFA toe aan de bovenkant van de C-18-kolom en opnieuw centrifugeer om de doorstroom weg te gooien. Voeg vervolgens 200 microliter van 0,1% TFA toe en gooi de doorstroming weg door centrifugatie.Laad ten slotte 200 microliter van de MHC-peptidecomplexen bovenop de C-18-kolom, gooi de stroom door centrifugeren weg en herhaal dit totdat het volledige volume is geladen. Voeg vervolgens 200 microliter van 0,1% TFA toe, centrifugeer om de doorstroming weg te gooien, breng de C-18-kolom over in een nieuwe microcentrifugebuis van twee milliliter en eluteer MHC-peptiden door 150 microliter van 28% acetonitril in 0,1% TFA toe te voegen. Verzamel na centrifugeren de doorstroom in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.Herhaal het elutieproces tweemaal voor een totaal volume van 450 microliter en vries in bij min 20 graden Celsius totdat het wordt geanalyseerd door LC-MS-MS. Gebruik deze gezuiverde peptiden voor de identificatie van MHC klasse I en II peptiden in een massaspectrometer. De bindingsefficiëntie van kralen werd geïllustreerd door een significante afname van de signaalkleuringsintensiteit van lichte en zware ketens wanneer kralen covalent gebonden zijn aan de CNBr-kralen, vergeleken met het antilichaam vóór de koppeling.De isolatie van MHC-peptidecomplexen na zure elutie werd bevestigd door het sterke detectiesignaal van de MHC-peptidecomplexen met behulp van anti-HAL-ABC zware-ketenantilichaam. De intra- en interindividuele reproduceerbaarheid van de resultaten met behulp van het huidige protocol werd ook geschat. De gemiddelde variatiecoëfficiënt voor het aantal gedetecteerde peptiden over drie verschillende biologische replicaties was klein, die varieerde van 1,9 tot 11%De identiteit van peptiden varieerde echter aanzienlijk en het aandeel peptiden reproduceerbaar gedetecteerd over drie biologische replicaties varieerde van 39% tot 63%De gegenereerde heatmaps toonden de voorspelde MHC-bindingssterkte van de geïdentificeerde peptiden.Voor de MHC klasse I en klasse II peptiden van de muis waren de geprediceerde sterke of zwakke bindmiddelen respectievelijk 89 en 87%. Voor menselijke HLA klasse I en klasse II peptiden waren de geprediceerde sterke of zwakke bindmiddelen respectievelijk 97 en 70%. De peptidebindingsmotieven van de muis en de mens voor LHC klasse I en klasse II peptiden werden ook gegenereerd.Voorafgaand aan de optimalisatie van dit protocol was de isolatie van murine MHC klasse I en II peptiden vrij moeilijker. Dit geoptimaliseerde protocol zal de isolatie van murine MHC klasse I en II peptiden uit in vivo muismodellen vergemakkelijken, bijvoorbeeld routinematig gebruikt voor de validatie van vele diverse, ziektegerelateerde studies.

immunopeptidomics-isolation-mouse-human-mhc-class-i-ii-associated

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Stabiele Isotopen Normen en Capture door Anti-peptide antilichamen (SISCAPA) paren affiniteit verrijking van peptiden met stabiele isotoop verdunning massaspectrometrie (MRM-MS) voor kwantitatieve meting van peptiden te bieden als surrogaat voor hun respectievelijke eiwitten. Hier beschrijven we het protocol met behulp van magnetische deeltjes in een deels geautomatiseerde formaat.

Kwantificering van eiwitten met behulp van immuno-peptide Verrijking gekoppeld aan massaspectrometrie

Dit protocol beschrijft het gebruik van peptide: MHC tetrameren en magnetische microbolletjes voor laagfrequente populaties van epitoop-specifieke T-cellen isoleren en analyseren door flowcytometrie. Deze methode maakt de directe bestudering van endogene T-celpopulaties plaats...

Peptide: MHC tetrameer-gebaseerde verrijking van epitoop-specifieke T-cellen

Biochemische analyses met recombinant humaan MHC II moleculen kunnen bieden snelle, kwantitatieve inzichten in immunogeen epitoop identificatie, verwijdering, of ontwerp. Hier wordt een peptide-MHC bindingstest geschaald naar 384-well platen beschreven. Deze kosteneffectieve formaat moet nuttig zijn in het gebied van eiwit deimmunization en vaccin ontwerp en ontwikkeling te bewijzen.

Een High Throughput MHC II Bindingsassay voor de kwantitatieve analyse van peptide-epitopen

Een protocol voor de kwantificering van de eiwitten in complexe biologische vloeistoffen met behulp van geautomatiseerde immuno-MALDI (iMALDI) technologie wordt gepresenteerd.

Peptide en proteïne kwantificering met behulp van geautomatiseerde Immuno-MALDI (iMALDI)

Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van Polysoom profilering op het hart van de geïsoleerde geperfundeerd muis. We worden methoden beschreven voor perfusie van het hart, Polysoom, profilering en analyse van de fracties van de Polysoom met betrekking tot mRNAs, miRNAs en de Polysoom Proteoom.

Dynamische Proteomic en miRNA analyse van Polysomes van geïsoleerde muis hart na Langendorff perfusie

We presenteren een methode voor de zuivering, detectie en identificatie van diGly peptiden die afkomstig zijn van ubiquitinated eiwitten uit complexe biologische monsters. De gepresenteerde methode is reproduceerbaar, robuust en presteert beter dan gepubliceerde methoden met betrekking tot het diepteniveau van de ubiquitinomenanalyse.

Detectie van eiwitubiquitinatiesites door peptideverrijking en massaspectrometrie

Lanthipeptide synthetases katalyseren multistep reacties tijdens de biosynthese van peptide natuurlijke producten. Hier beschrijven we een continue, bottom-up, waterstof-deuterium uitwisseling massaspectrometrie (HDX-MS) workflow die kan worden gebruikt om de conformationele dynamiek van lanthipeptide synthetases te bestuderen, evenals andere vergelijkbare enzymen die betrokken zijn bij peptide natuurlijke productbiosynthese.

Een Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform voor het onderzoeken van Peptide Biosynthetische Enzymen

Dit protocol omvat een gedetailleerde analyse van de peptidoglycaansamenstelling met behulp van vloeistofchromatografie massaspectrometrie in combinatie met geavanceerde functie-extractie en bio-informatica-analysesoftware.

Semi-kwantitatieve analyse van peptidoglycaan door vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en bio-informatica

Protein Arginine (R)-methylatie is een wijdverspreide posttranslationele modificatie die meerdere biologische routes reguleert. Massaspectrometrie is de beste technologie om het R-methylproteoom wereldwijd te profileren, wanneer gekoppeld aan biochemische benaderingen voor gemodificeerde peptideverrijking. De workflow die is ontworpen voor de identificatie met hoge betrouwbaarheid van globale R-methylatie in menselijke cellen wordt hier beschreven.

Een op massaspectrometrie gebaseerde proteomics-benadering voor wereldwijde en betrouwbare eiwit-R-methylatieanalyse

Er wordt een protocol gepresenteerd voor het verrijken van gastheerceleiwitten (HCP's) uit geneesmiddelen (DP) en het detecteren van peptiden met behulp van proteoomverrijkingskorrels. De methode wordt gedemonstreerd met behulp van een in-house vervaardigde monoklonale antilichaam (mAb) geneesmiddelsubstantie (DS), die een goed gekarakteriseerd referentiemateriaal is voor het evalueren en vergelijken van verschillende methoden in termen van prestaties.

Gastheerceleiwitanalyse met behulp van verrijkingsparels in combinatie met beperkte spijsvertering

We bieden een gedetailleerd protocol voor het isoleren en identificeren van zeldzame antigeenspecifieke T-celpopulaties in muizenlongen door middel van T-celverrijking op basis van magnetische kralen en peptide:major histocompatibility complex (MHC)-tetrameren.

Identificatie van zeldzame antigeenspecifieke T-cellen uit muizenlongen met peptide: belangrijke histocompatibiliteitscomplextetrameren

Leer een eenvoudige methode voor immunopeptidomics om MHC klasse I- en II-peptiden te isoleren uit muis- en humane cellijnen voor massaspectrometrie-analyse. Dit protocol is toegankelijk voor elk laboratorium.

Immunopeptidomics: isolatie van muis en humane MHC klasse I- en II-geassocieerde peptiden voor massaspectrometrie-analyse

Meer video's verkennen