Immunopeptidomics: isolatie van muis en humane MHC klasse I- en II-geassocieerde peptiden voor massaspectrometrie-analyse

Dit protocol is belangrijk omdat het eenvoudig uit te voeren is en binnen het bereik van elk laboratorium ligt. Dit protocol maakt de isolatie van HLA of MHC type I of type II peptiden uit menselijke of muismonsters mogelijk. Deze methode kan wetenschappelijke vragen beantwoorden met betrekking tot alle onderzoeksgebieden met betrekking tot het immuunsysteem, of het nu gaat om kanker, virologie of auto-immuunziekten.

Dit protocol is gebouwd om toegankelijk te zijn voor iedereen die in een onderzoekslaboratorium werkt. Volg gewoon de stappen. Begin met het activeren van de Sepharose cyanogeenbromide kralen door 80 milligram per monster te wegen en over te brengen naar een conische buis van 15 milliliter.

Voeg vijf milliliter zoutzuur van één millimol toe. Pipetteer vijf keer op en neer om de resuspensie van de gedroogde kralen te vergemakkelijken en vul vervolgens de conische buis met nog eens 8,5 milliliter zoutzuur van één millimol. Draai de kralen bij 20 RPM gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met behulp van een rotatorapparaat.

Centrifugeer de kralen bij 200x G gedurende twee minuten bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant door aspiratie. Voeg 500 microliter koppelingsbuffer toe aan het kralenpalet, breng de kraalsuspensie over naar een nieuwe centrifugebuis van twee milliliter en zet deze apart. Voor het koppelen van de antilichamen aan deze kralen, voegt u twee milligram van het geselecteerde antilichaam toe in een nieuwe microcentrifugebuis van twee milliliter en maakt u het volume tot één milliliter met een koppelingsbufferoplossing om een uiteindelijke concentratie van twee milligram per milliliter te krijgen.

Breng de eerder bereide kraaloplossing over en voeg deze toe aan de antilichaamoplossing. Draai vervolgens de microcentrifugebuis gedurende 120 minuten met 20 RPM met behulp van een rotatorapparaat, centrifugeer de kralen en verwijder vervolgens het supernatant zoals eerder beschreven. Begin nu met het blokkeren en wassen van de kralen door eerst een milliliter 0,2-molaire glycine toe te voegen aan de microcentrifugebuis met de antilichaam-gekoppelde kralen en draai bij 20 RPM gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur met behulp van een rotatorapparaat.

Na het centrifugeren en verwijderen van het supernatant, wast u de kralen met één milliliter PBS, verwijdert u het supernatant door centrifugeren en bewaart u de kralen in één milliliter PBS bij vier graden Celsius tot gebruik. Om MHC klasse I of II peptiden te isoleren, ontdooi je een bevroren palet van 100 miljoen cellen door de bodem van de buis te verwarmen met een handpalm. Voeg 500 microliter PBS toe aan het palet en pipetteer op en neer tot de suspensie homogeen is.

Breng de suspensie over in een nieuwe microcentrifugebuis van twee milliliter en voeg een gelijk volume cellysisbuffer toe. Draai met 10 RPM gedurende 60 minuten bij vier graden Celsius met behulp van een rotatorapparaat. Centrifugeer het cellysaat op 18.000x G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius met volledige rem en breng het supernatant over in een nieuwe microcentrifugebuis van twee milliliter.

Herstel de antilichaam-gekoppelde kralen door centrifugeren en het verwijderen van het supernatant. Breng vervolgens het cellysaat supernatant over naar de aan antilichamen gekoppelde kralen en incubeer bij 10 RPM gedurende 14 tot 18 uur 's nachts bij vier graden Celsius met behulp van een rotatorapparaat. Verwijder op dag twee het onderste deksel van de polypropyleenkolom, plaats de kolom op het polypropyleen kolomrek en installeer een lege container eronder om de doorstroming op te vangen.

Spoel nu de polypropyleen kolom af met 10 milliliter buffer A en laat deze door de zwaartekracht uitlekken. Als de stroomsnelheid van de vloeistofelutie te langzaam is, snijdt u de onderste punt van de polypropyleenkolom verder af. Meet en verzamel het kralen/lysaatmengsel en breng het over in de polypropyleenkolom.

Laat het vloeibare mengsel door de zwaartekracht elueren. Verzamel en vries eventueel 20 microliter aliquot in voor Western blotting. Was nu de kralen die in de polypropyleenkolom zijn achtergebleven door 10 milliliter buffer A toe te voegen en deze door de zwaartekracht te laten elueren.

Verwijder de polypropyleenkolom uit het rek en plaats deze op de bovenkant van een nieuwe microcentrifugebuis van twee milliliter, waarbij u de kolom en de buis met de hand bij elkaar houdt. Voeg 300 microliter 1% TFA toe aan de polypropyleenkolom en meng de kralen door vijf keer op en neer te spuiten. Breng vervolgens het eluaat over in een nieuwe microcentrifugebuis van twee milliliter.

Voor het ontzouten en eluteren van de MHC-peptiden, voeg 200 microliter methanol toe bovenop de C-18-kolom en centrifugeer bij 1, 546x G gedurende drie minuten om de doorstroming weg te gooien. Voeg 200 microliter 80% acetonitril in 0,1% TFA toe aan de bovenkant van de C-18-kolom en opnieuw centrifugeer om de doorstroom weg te gooien. Voeg vervolgens 200 microliter van 0,1% TFA toe en gooi de doorstroming weg door centrifugatie.

Laad ten slotte 200 microliter van de MHC-peptidecomplexen bovenop de C-18-kolom, gooi de stroom door centrifugeren weg en herhaal dit totdat het volledige volume is geladen. Voeg vervolgens 200 microliter van 0,1% TFA toe, centrifugeer om de doorstroming weg te gooien, breng de C-18-kolom over in een nieuwe microcentrifugebuis van twee milliliter en eluteer MHC-peptiden door 150 microliter van 28% acetonitril in 0,1% TFA toe te voegen. Verzamel na centrifugeren de doorstroom in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.

Herhaal het elutieproces tweemaal voor een totaal volume van 450 microliter en vries in bij min 20 graden Celsius totdat het wordt geanalyseerd door LC-MS-MS. Gebruik deze gezuiverde peptiden voor de identificatie van MHC klasse I en II peptiden in een massaspectrometer. De bindingsefficiëntie van kralen werd geïllustreerd door een significante afname van de signaalkleuringsintensiteit van lichte en zware ketens wanneer kralen covalent gebonden zijn aan de CNBr-kralen, vergeleken met het antilichaam vóór de koppeling.

De isolatie van MHC-peptidecomplexen na zure elutie werd bevestigd door het sterke detectiesignaal van de MHC-peptidecomplexen met behulp van anti-HAL-ABC zware-ketenantilichaam. De intra- en interindividuele reproduceerbaarheid van de resultaten met behulp van het huidige protocol werd ook geschat. De gemiddelde variatiecoëfficiënt voor het aantal gedetecteerde peptiden over drie verschillende biologische replicaties was klein, die varieerde van 1,9 tot 11%De identiteit van peptiden varieerde echter aanzienlijk en het aandeel peptiden reproduceerbaar gedetecteerd over drie biologische replicaties varieerde van 39% tot 63%De gegenereerde heatmaps toonden de voorspelde MHC-bindingssterkte van de geïdentificeerde peptiden.

Voor de MHC klasse I en klasse II peptiden van de muis waren de geprediceerde sterke of zwakke bindmiddelen respectievelijk 89 en 87%. Voor menselijke HLA klasse I en klasse II peptiden waren de geprediceerde sterke of zwakke bindmiddelen respectievelijk 97 en 70%. De peptidebindingsmotieven van de muis en de mens voor LHC klasse I en klasse II peptiden werden ook gegenereerd.

Voorafgaand aan de optimalisatie van dit protocol was de isolatie van murine MHC klasse I en II peptiden vrij moeilijker. Dit geoptimaliseerde protocol zal de isolatie van murine MHC klasse I en II peptiden uit in vivo muismodellen vergemakkelijken, bijvoorbeeld routinematig gebruikt voor de validatie van vele diverse, ziektegerelateerde studies.