Name: Paramagnetische relaxatieverbetering voor het detecteren en karakteriseren van zelfassociaties van intrinsiek ongeordende eiwitten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Leer paramagnetische relaxatieverbetering met PRE-NMR-spectroscopie voor het detecteren van zwakke interacties in intrinsiek ongeordende eiwitten. Deze methode kwantificeert biomoleculaire dynamiek met atomair resolutie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Drs. Jinfa Ying en Kristin Cano voor nuttige discussies en technische assistentie. DSL is een St. Baldrick's Scholar en erkent de steun van de St. Baldrick's Foundation (634706). Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Welch Foundation (AQ-2001-20190330) aan DSL, het Max and Minnie Tomerlin Voelcker Fund (Voelcker Foundation Young Investigator Grant aan DSL), UTHSA Start-Up Funds aan DSL en een Greehey Graduate Fellowship in Children's Health aan CNJ. Dit werk is gebaseerd op onderzoek uitgevoerd in de Structural Biology Core Facilities, onderdeel van de Institutional Research Cores aan het University of Texas Health Science Center in San Antonio, ondersteund door het Office of the Vice President for Research en het Mays Cancer Center Drug Discovery and Structural Biology Shared Resource (NIH P30 CA054174).

Alle auteurs hebben het manuscript gelezen en goedgekeurd. Er worden geen belangenconflicten aangegeven.

Een methode voor het karakteriseren van voorbijgaande interacties die bestaan bij lage populaties tussen intrinsiek ongeordende eiwitten en verschillende bindingspartners met behulp van PRE is gepresenteerd. In het getoonde voorbeeld is het eiwit zelfassociatief en kan de PRE dus ontstaan uit een combinatie van inter- en intramoleculaire interacties. Deze methode kan gemakkelijk worden uitgebreid tot heterogene monsters waar de interacties tussen twee verschillende eiwitten kunnen worden gekarakteriseerd. Aanvullende inf...

Intrinsieke stoornis (ID) beschrijft eiwitten (IDP's) of regio's binnen eiwitten (IDR's) die zich niet spontaan vouwen tot stabiele secundaire of tertiaire structuren, maar biologisch actief zijn. Over het algemeen is de functie van IDP/IDR's het vergemakkelijken van specifieke maar omkeerbare interacties met biomoleculen onder fysiologische omstandigheden1. IDP's en IDR's zijn dus betrokken bij een reeks cellulaire functies, waaronder rekrutering, organisatie en stabilisatie van multi-eiwitcomplexen, bijvoorbeeld de assemblage en activiteit van het spliceosoom2, rekrutering en organisatie van componenten op plaatsen van DNA-schade3, organisatie en stabilisatie van de rekrutering van transcriptiecomplexen4, of van de chromatine-remodeler BAF5. Bovendien worden IDP's gevonden bij signaleringsverbindingen waar hun promiscuïteit voor verschillende bindingspartners hen in staat stelt om informatieoverdracht via cellulaire eiwitnetwerken te bemiddelen6. Recent werk heeft ook een neiging aangetoond voor IDR-regio's om zelf biomoleculaire condensaten te associëren door het proces van vloeistof-vloeistoffasescheiding7. Van veel van de bovengenoemde functies met betrekking tot ID wordt nu ook gedacht dat ze een aspect van condensaatvormingomvatten 8. Ondanks het belang van ID voor biomoleculaire complexe assemblage, stabilisatie, steigers en signaaltransductie, zijn de atomaire details van hun specifieke interacties moeilijk te identificeren, omdat IDP's en IDR's meestal niet vatbaar zijn voor structureel onderzoek met behulp van röntgenkristallografie of cryogene elektronenmicroscopie.
Nucleaire magnetische resonantie (NMR) is een ideale techniek voor het onderzoeken van ID, omdat het niet afhankelijk is van de aanwezigheid van stijve of homogene structurele ensembles, maar rapporteert over de directe lokale omgeving van individuele kernen. De resonantiefrequentie, of chemische verschuiving, van een kern in een bepaald molecuul wordt beïnvloed door zwakke magnetische velden geïnduceerd door de lokale elektronische verdeling, die op zijn beurt afhankelijk is van bindingslengtes, hoeken, nabijheid van andere kernen, interacties met bindingspartners en andere factoren9. Elke kern fungeert dus als een unieke, locatiespecifieke structurele sonde die gevoelig is voor veranderingen in zijn lokale chemische omgeving. Ondanks deze voordelen is NMR een bulktechniek en de waargenomen chemische verschuiving is het gemiddelde van alle omgevingen die door een bepaalde kern worden bemonsterd. Een reeks NMR-technieken, waarvan er vele in dit nummer worden beschreven, zijn ontwikkeld om structurele, dynamische en kinetische informatie over hoogenergetische, laagbevolkte biomoleculaire conformaties in de gemiddelde chemische verschuiving10,11 te herstellen. Hoewel tijdelijk bevolkt, zijn identificatie en kwantificering van deze toestanden belangrijk voor het bepalen van de details van functionele mechanismen12. In het geval van IDP's en IDR's kan het conformatie-ensemble bijvoorbeeld bevooroordeeld zijn om bij voorkeur conformaties te bemonsteren die productief zijn voor de vorming van ontmoetingscomplexen met fysiologische bindingspartners. Detectie van deze toestanden, evenals identificatie van de residuspecifieke inter- en intramoleculaire interacties en dynamiek, zijn belangrijk om de onderliggende structurele mechanismen van eiwitfunctie en complexe vorming te bepalen.
Een protocol voor het gebruik van paramagnetische relaxatieverbetering (PRE) NMR om voorbijgaande, dunbevolkte toestanden te onderzoeken die belangrijk zijn voor de vorming van IDP / IDR-gemedieerde biomoleculaire complexen wordt beschreven13. Deze benadering is nuttig voor het bestuderen van de voorbijgaande eiwit-eiwitinteracties, zoals die welke de assemblage van amyloïde fibrillen uit α-synucleïne 14,15 of de zelfassociatie van FUS16 bevorderen, evenals om specifieke eiwit-eiwitinteracties te karakteriseren, zoals tussen signaaleiwitten17. Een voorbeeld van een zelf-associërende IDP wordt gepresenteerd, waarbij specifieke inter- en intramoleculaire interacties resulteren in bij voorkeur verdichte toestanden en site-specifieke interacties die zelfassociatie stimuleren.
De PRE ontstaat uit de magnetische dipolaire interactie van een kern met een paramagnetisch centrum met een isotrope g-tensor, gewoonlijk geleverd in de vorm van een ongepaard elektron op een nitroxidegroep of als een paramagnetisch metaalatoom18 (figuur 1). Hoewel atomen met anisotrope g-tensoren ook een PRE-effect produceren, is analyse van deze systemen moeilijker vanwege verstorende effecten die worden bijgedragen door de pseudo-contactverschuivingen (PCS) of residuele dipolaire koppeling (RDC)13,19. De sterkte van de interactie tussen een kern en het paramagnetische centrum is afhankelijk van de <r-6> afstand tussen de twee. Deze interactie resulteert in een toename van nucleaire relaxatiesnelheden, wat detecteerbare lijnverbreding veroorzaakt, zelfs voor langeafstandsinteracties (~ 10-35 Å), omdat het magnetische moment van het ongepaarde elektron zo sterk is20,21. Detectie van voorbijgaande toestanden met de PRE is mogelijk als aan de volgende twee voorwaarden wordt voldaan; (1) de voorbijgaande interactie is in snelle uitwisseling op de NMR-tijdschaal (waargenomen chemische verschuiving is een populatiegewogen gemiddelde van de uitwisselingstoestanden); en (2) de kernen tot paramagnetische centrumafstand is korter in de tijdelijk bevolkte toestand dan in de hoofdtoestand11. De transversale PRE wordt aangeduid Γ2 en wordt voor praktische doeleinden berekend uit het verschil in 1H transversale relaxatiesnelheden tussen een monster met een paramagnetisch centrum en een diamagnetische controle. Voor een diepgaande behandeling van de theorie van de PRE en gerelateerde pseudocontactverschuivingen in snelle en langzame uitwisselingsregimes, wordt de lezer verwezen naar de uitgebreide beoordelingen door Clore en collega's13,22. Hier wordt alleen de situatie overwogen waarin 1H N-Γ2 zich in het snelle uitwisselingsregime bevindt, waarbij vanwege de r-6-afhankelijkheid van de PRE, de waargenomen relaxatiesnelheid gerelateerd is aan zowel de afstand waartoe het paramagnetische centrum de kern nadert als de hoeveelheid tijd die het in die conformatie doorbrengt. Daarom produceren voorbijgaande conformaties die geen nauwe benadering inhouden een kleine PRE, terwijl nauwere interacties, zelfs als ze van korte duur zijn, een grotere PRE zullen produceren.
Voor IDP's wordt de PRE gebruikt om de interacties te meten en te differentiëren die plaatsvinden binnen een enkel molecuul (intramoleculair) en tussen afzonderlijke moleculen (intermoleculair). Door een paramagnetisch centrum te hechten aan een NMR zichtbaar (bijv. 15N-gelabeld) of NMR onzichtbaar (bijv. natuurlijke abundantie 14N) eiwit, kan de bron (inter- of intramoleculair) van de PRE worden bepaald (figuur 2). Plaatsgerichte mutagenese die een cysteïneresidu introduceert, is een handige benadering om een paramagnetisch centrum (spin-label) aan een eiwit23 te hechten. Verschillende soorten moleculen zijn voorgesteld voor gebruik als spinlabels, waaronder metaalchelaatvorming (op basis van EDTA) en vrije radicalen (op basis van nitroxide)24. Verschillende nitroxide spin labels zijn beschreven en zijn verkrijgbaar met verschillende cysteïne-reactieve chemische stoffen zoals methanethiosulfonaat, maleimide en iodoacetamide25,26 (figuur 1). Inherente flexibiliteit van de tag of van de linker kan problematisch zijn voor bepaalde analyses, en in deze situaties zijn verschillende strategieën voorgesteld om de beweging van de tag te beperken, bijvoorbeeld door omvangrijke chemische groepen toe te voegen of het gebruik van een tweede linker om de tag aan het eiwit te verankeren (twee site-attachment)27, 28. Bovendien kunnen in de handel verkrijgbare tags diastereomere eiwitten bevatten, maar over het algemeen zal dit niet bijdragen aan de waargenomen PRE29. Het gebruik van de 3-Maleimido-PROXYL bevestigd aan een vrije cysteïne via maleimide chemie wordt beschreven omdat het direct beschikbaar, kosteneffectief, niet-omkeerbaar is en het reductiemiddel tris (2-carboxyethyl) fosfine (TCEP) gedurende de hele etiketteringsreactie in de oplossing kan worden gehandhaafd. Aangezien 3-Maleimido-PROXYL een isotrope g-tensor heeft, worden er geen PCS of RDC's geïnduceerd en kunnen dezelfde chemische verschuivingstoewijzingen worden gebruikt voor zowel de paramagnetische als de diamagnetische monsters13.
De 1HN-T 2 wordt gemeten met behulp van een twee-tijdpuntstrategie (T a, Tb) waarvan eerder is aangetoond dat deze net zo nauwkeurig is als het verzamelen van een volledige evolutiereeks bestaande uit 8 tot 12 tijdpunten30. Het eerste tijdspunt (T a) wordt zo dicht bij nul ingesteld als praktisch is, en de optimale lengte van het tweede tijdspunt is afhankelijk van de grootte van de grootste verwachte PRE voor een bepaald monster en kan worden geschat vanaf: Tb ~ 1,15 / (R 2, dia + Γ 2) waarbij R 2, dia de R 2 van het diamagnetische monster13 vertegenwoordigt. Als de grootte van de grootste PREs onbekend is, is het instellen van T b op ~ één keer de 1H T 2 van het eiwit een goede eerste schatting en verder geoptimaliseerd door T2 aan te passen om het signaal naar ruis te verbeteren. Deze tweepuntsmeetstrategie vermindert de experimentele tijd die nodig is om PRE's te meten aanzienlijk en biedt tijd voor meer signaalmiddeling, vooral omdat relatief verdunde monsters worden gebruikt om de effecten van niet-specifieke contacten tussen moleculen te minimaliseren. Een op HSQC gebaseerde pulssequentie wordt gebruikt om 1H N-T2 te meten en is elders in detail beschreven30. Voor een betere gevoeligheid kunnen de harde pulsen van de voorwaartse en achterste INEPT-overdrachten worden vervangen door gevormde pulsen; als alternatief kan de reeks gemakkelijk worden geconverteerd naar een op TROSY gebaseerde uitlezing31. Aangezien IDP's doorgaans veel langere transversale relaxatiesnelheden hebben, wat resulteert in smallere lijnbreedtes (vanwege de inherente aandoening) dan bolvormige eiwitten van vergelijkbare grootte, kunnen lange acquisitietijden in de indirecte dimensie worden gebruikt om de spectrale resolutie te verbeteren en de beperking van de chemische verschuivingsdispersie die inherent is aan IDP's te verlichten.
PRE is een nuttig hulpmiddel voor het bestuderen van eiwit-eiwit en eiwit-nucleïnezuur interacties, met name interacties die van voorbijgaande of laagbevolkte aard zijn. Een gedetailleerd protocol voor de bereiding van een NMR-monster dat geschikt is voor het meten van PREs, inclusief stappen voor eiwitzuivering, site-directed spin-etikettering, het opzetten en kalibreren van het pulsprogramma, het verwerken en interpreteren van de NMR-gegevens, wordt verstrekt. Er worden overal belangrijke experimentele overwegingen opgemerkt die van invloed kunnen zijn op de kwaliteit van de gegevens en de experimentele resultaten, waaronder de monsterconcentratie, de selectie van het spinlabel en de verwijdering van paramagnetische componenten.

<table><tbody><tr><td>0.45 &micro;m and 0.22 &micro;m syringe filters</td><td>Millipore Sigma</td><td>SLHVM33RS SLGVR33RS</td><td>Filter lysate voor de eerste zuiveringsstap en voorafgaand aan grootte-exclusiechromatografie.</td></tr><tr><td>100 mm Petri Dish</td><td>Fisher</td><td>FB0875713</td><td>Agar platen voor bacteriële transformatie.</td></tr><tr><td>14N Ammonium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>576794</td><td>Gebruik van 15N in M9 medium produceert een NMR zichtbaar eiwit, 14N produceert een NMR onzichtbaar eiwit</td></tr><tr><td>15N Ammonium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>299251</td><td>Gebruik van 15N in M9 medium produceert een NMR zichtbaar eiwit, 14N produceert een NMR onzichtbaar eiwit</td></tr><tr><td>3 L Fernbach baffled flask</td><td>Corning</td><td>431523</td><td>Bacterieel expressiecultuur</td></tr><tr><td>3-Maleimido-Proxyl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>253375</td><td>Nitroxide spin label</td></tr><tr><td>50 mL conische centrifugeerbuisjes</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-432-22</td><td>Oplossing/eiwit opslag</td></tr><tr><td>Amicon centrifugale filter</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC900308</td><td>Eiwitconcentratie</td></tr><tr><td>Ampicillan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5354</td><td>Antibioticum voor een selectieve marker, exacte keuze is afhankelijk van de expressieconstruct plasmide</td></tr><tr><td>Analytische weegschaal</td><td>Oahus</td><td>30061978</td><td>Explorer Pro, voor het wegen van reagentia</td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>AX1775</td><td>Vermindert nitroxide spin label</td></tr><tr><td>Autoclaaf</td><td></td><td></td><td>Steriliseer glaswerk en kweekmedia</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td>M9 media component</td></tr><tr><td>Centrifugebuisjes</td><td>Thermo Fisher</td><td>010-1459</td><td>Oogsten van E. coli cellen na recombinante eiwitexpressie</td></tr><tr><td>Centrifuge, hand-crank</td><td>Thomas Scientific</td><td>0241C68</td><td>Boekel handaangedreven, laagsnelheidscentrifuge met 15 mL emmers die NMR buisjes kunnen herbergen</td></tr><tr><td>Chelex 100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7901</td><td>Verwijder besmettende paramagnetische verbindingen uit bufferoplossingen</td></tr><tr><td>Computerwerkstation</td><td></td><td></td><td>Linux of Mac OS compatibel met NMR data verwerking en analyse softwarepakketten zoals NMRPipe en Sparky</td></tr><tr><td>Deuterium oxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151882</td><td>Noodzakelijk voor NMR lock signaal</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9434</td><td>M9 media component</td></tr><tr><td>Dibasic Sodium Phosphate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5136</td><td>M9 media component</td></tr><tr><td>Ellman's reagens (5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid)</td><td>Thermo Fisher</td><td>22582</td><td>Kwantificering van vrije cysteïnerestanten</td></tr><tr><td>Hoge snelheid centrifugeerbuisjes</td><td>Thermo Fisher</td><td>3114-0050</td><td>Wordt gebruikt om bacterieel lysate te klaren.</td></tr><tr><td>High-field NMR instrument (600 - 800 MHz)</td><td>Bruker</td><td></td><td>Uitgerust met een multikanaals cryogene sonde en temperatuurregeling</td></tr><tr><td>IMAC kolom, HisTrap FF</td><td>Cytvia</td><td>17528601</td><td>Initiële fractie van ruw bacterieel lysate</td></tr><tr><td>Isopropyl B-D-thiogalactoside (IPTG)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6758</td><td>Induceert eiwitexpressie voor genen onder controle van lac operator</td></tr><tr><td>LB agar</td><td>Thermo Fisher</td><td>22700025</td><td>Items worden gebruikt voor het transformeren van E. coli om eiwit van belang te expresseren, vervangingen voor elk van deze items met soortgelijke producten is acceptabel.</td></tr><tr><td>LB bouillon</td><td>Thermo Fisher</td><td>12780052</td><td></td></tr><tr><td>Laagdruk chromatografie systeem</td><td>Bio-Rad</td><td>7318300</td><td>BioRad BioLogic wordt gebruikt voor laagdruk chromatografie zoals het draaien van IMAC kolommen</td></tr><tr><td>Magnesium sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td>M9 media component</td></tr><tr><td>Middeldruk chromatografie systeem</td><td>Bio-Rad</td><td>7880007</td><td>BioRad NGC uitgerust met een multi-golflengte detector, pH en geleidbaarheidsmonitoren, en automatische fractie collector</td></tr><tr><td>MEM vitamine oplossing</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6895</td><td>M9 media component</td></tr><tr><td>Microfluidizer</td><td>Avestin</td><td>EmulsiFlex-C3</td><td>Biedt snelle en efficiënte bacteriële cel lysis</td></tr><tr><td>Micropipetten</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>Gekalibreerd set micropipetten met goed passende wegwerp tips (beschikbaar bij meerdere fabrikanten, bijv. Eppendorf)</td></tr><tr><td>Monobasic potassium phosphate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1551139</td><td>M9 media component</td></tr><tr><td>NMR pipetten</td><td>Sigma Aldrich</td><td>255688</td><td>Om monster uit NMR buisje te verwijderen</td></tr><tr><td>NMR sample buisje</td><td>NewEra</td><td>NE-SL5</td><td>Geschikt voor high-field NMR spectrometers</td></tr><tr><td>Preparative Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti J-HC</td><td>Oogsten van E. coli cellen na recombinante eiwitexpressie</td></tr><tr><td>Rond bodem polystyreen centrifugeerbuisjes</td><td>Corning</td><td>352057</td><td>Klaren bacterieel lysate</td></tr><tr><td>Schakelende incubator</td><td>Eppendorf</td><td>S44I200005</td><td>Temperatuur gecontroleerde groei van E. coli starter en expressieculturen</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5886</td><td>M9 media component</td></tr><tr><td>Sonicerende waterbad en vacuümbron</td><td>Thomas Scientific</td><td></td><td>Wordt gebruikt om bufferoplossingen te degasseren</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Thermo Fisher</td><td>FB505110</td><td>Wordt gebruikt voor bacteriële cel lysis of het scheuren van bacterieel DNA</td></tr><tr><td>Spectrofotometer</td><td>Implen</td><td>OD600 Diluphotometer</td><td>Bewaak de groei van E.coli proteïne expressieculturen</td></tr><tr><td>Superdex 200 16/600 grootte exclussie kolom</td><td>Cytvia</td><td>28989333</td><td>Laatste eiwit zuiveringsstap</td></tr><tr><td>Topspin software, versie 3.2 of later</td><td>Bruker</td><td></td><td>Bedieningssoftware voor het NMR instrument</td></tr><tr><td>Transformatie competente E. coli cellen</td><td>Thermo Fisher</td><td>C600003</td><td>One Shot BL21 Star (DE3) chemisch competente E. coli, andere stammen kunnen compatibel zijn</td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td><td>ThermoFisher</td><td>20490</td><td>Reductiemiddel compatibel met enkele sulfhydryl-

paramagnetische relaxatieverbetering voor het detecteren en karakteriseren van zelfassociaties van intrinsiek ongeordende eiwitten

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins

Intrinsiek ongeordende eiwitten en intrinsiek ongeordende gebieden binnen eiwitten vormen een groot en functioneel significant deel van het menselijk proteoom. De zeer flexibele aard van deze sequenties stelt hen in staat om zwakke, langdurige en voorbijgaande interacties te vormen met diverse biomoleculaire partners. Specifieke maar laag-affiniteitsinteracties bevorderen promiscue binding en stellen een enkel intrinsiek ongeordend segment in staat om te communiceren met een groot aantal doelsites. Vanwege de voorbijgaande aard van deze interacties, kunnen ze moeilijk te karakteriseren zijn door structurele biologische methoden die afhankelijk zijn van eiwitten om een enkele, overheersende conformatie te vormen. Paramagnetische relaxatieverbetering NMR is een nuttig hulpmiddel voor het identificeren en definiëren van de structurele onderbouwing van zwakke en voorbijgaande interacties. Een gedetailleerd protocol voor het gebruik van paramagnetische relaxatieverbetering om de dunbevolkte ontmoetingscomplexen te karakteriseren die zich vormen tussen intrinsiek ongeordende eiwitten en hun eiwit, nucleïnezuur of andere biomoleculaire partners wordt beschreven.

Intramoleculair 1HN-Γ 2 PRE's werden geregistreerd op een zelfassociatief, intrinsiek ongeordend fragment (residuen 171-264) afgeleid van het laagcomplexe domein van het RNA-bindende eiwit EWSR142 (figuur 3). Residuen in de nabijheid van het bevestigingspunt van het spinlabel (bv. residu 178 of 260 in figuur 3) zullen naar verwachting aanzienlijk worden verbreed en zijn niet detecteerbaar in het s...

Een protocol voor de toepassing van paramagnetische relaxatieverbetering NMR-spectroscopie om zwakke en voorbijgaande inter- en intramoleculaire interacties in intrinsiek ongeordende eiwitten te detecteren, wordt gepresenteerd.

Paramagnetische relaxatieverbetering voor het detecteren en karakteriseren van zelfassociaties van intrinsiek ongeordende eiwitten

Intrinsically disordered proteins and intrinsically disordered regions within proteins make up a large and functionally significant part of the human ...

De paramagnetische relaxatieverbeteringstechniek kan worden gebruikt om intermoleculaire afstanden te karakteriseren en te meten en voorbijgaande en / of laagbevolkte biomoleculaire interacties te kwantificeren. Hier hebben we deze techniek toegepast om interacties vast te leggen die voorafgaan aan eiwitcondensatie. De gevoeligheid van PREs maakt identificatie van atomaire resolutie, detectie en kwantificering van dynamische toestanden mogelijk die onzichtbaar en ontoegankelijk blijven voor andere NMR-technieken.Belangrijke stappen in dit protocol zijn het verwijderen van het ongeconjugeerde nitroxide spinlabel en het zorgvuldig analyseren van de spectra om de piekhoogte nauwkeurig te meten. Bovendien moet voorzichtigheid worden betracht tijdens het instellen van het NMR-experiment en de pulskalibratie. Voeg om te beginnen 3-maleimido-PROXYL toe uit een stamoplossing met 20 keer molaire overmaat van het 15N isotopisch gelabelde eiwit van belang.Incubeer 's nachts bij kamertemperatuur of vier graden Celsius beschermd tegen licht en zuurstof en met zacht schommelen of nutatie. Verwijder de volgende dag het niet-gereageerde vrije spinlabel om niet-specifiek oplosmiddel PRE te voorkomen met behulp van uitgebreide dialyse van het eiwitmonster of met behulp van gelfiltratie. Gebruik vervolgens het reagens van Ellman om vrije sulfhydrylgroepen in de oplossing te kwantificeren.Meet de absorptie met behulp van een microplaatlezer en construeer de standaardcurve. Om intramoleculaire PRE te meten, bereidt u 15N isotopisch verrijkt spin-gelabeld eiwit tot een concentratie van ten minste 100 micromolair, maar niet meer dan 300 micromolair, in een buffer die geschikt is voor NMR. Breng vervolgens met behulp van een glazen pipet met lange steel of micropipet het NMR-monster over naar een NMR-buis van vijf millimeter die geschikt is voor gebruik in magneten met een hoog veld.Plaats het monster in de magneet. Vergrendel het deuteriumsignaal met behulp van het vergrendelingscommando en stem het protonkanaal af en match het volgens de facilitaire protocollen. Pas vervolgens de shims aan met behulp van de bovenste shim-subroutine om de onderdrukking van het oplosmiddelsignaal te optimaliseren.Kalibreer vervolgens de protonenpuls met behulp van het P-OPT-programma. Kalibreer vervolgens de 15N-puls tegen een standaardmonster. Bepaal de juiste demping voor gevormde pulsen met behulp van de subroutine van het vormgereedschap.Open vervolgens het juiste pulsvormbestand door op het mappictogram te klikken. De gevormde pulsen zijn te vinden in de sectie pulsparameters van acquisitieparameters. Nadat u het pulsdefinitiebestand hebt geladen, klikt u op Golfvorm analyseren, gevolgd door Shape integreren.Voer het gekalibreerde proton 90 graden harde puls, gewenste vorm pulslengte en rotatie in. Bereken vervolgens het vermogensniveau van de gevormde puls door de verandering van het vermogensniveau toe te voegen aan de demping voor de gekalibreerde puls van 90 graden. Neem een standaard proton 15N HSQC op om de veegbreedte, de draaggolffrequentie te optimaliseren en de wateronderdrukking te controleren.Pas ten slotte de veegbreedte en het aantal indirecte dimensieverhogingen aan met de opdrachten SW en TD of rechtstreeks in de juiste dialoogvensters. Kalibreer de gevormde pulsen zoals eerder gedemonstreerd. Voer vervolgens de gekalibreerde pulslengtes in het gedeelte pulsparameters in op het tabblad Acquisitieparameters.Om het amideproton T2 te meten met behulp van de tweetijdsvertragingspuntbenadering, stelt u de tijdvertragingen in door het VD-lijstbestand te bewerken. De eerste vertraging is ingesteld op 0,01 milliseconden. Gebruik de relatie met de verwachte maximale PRE en kies de tweede vertraging.Bepaal vervolgens een geschikte waarde door de eerste stappen van de eerste en tweede vertragingsspectra te vergelijken en de tweede vertraging zodanig aan te passen dat het signaal vervalt tot 40 tot 50% van de beginwaarde. Bepaal het aantal complexe punten dat moet worden vastgelegd en het aantal scans voor voldoende signaalgemiddelde. Gebruik vervolgens de opdracht EXPT om de experimenttijd te berekenen en start het experiment met de opdracht ZG. Na het oplossen van natriumascorbaat in de NMR-buffer, past u de pH aan die van de oorspronkelijke NMR-buffer aan.Voeg vervolgens het ascorbinezuur toe aan de NMR-buis met een 10 keer molaire overmaat boven de concentratie van het spinlabel door een druppel onder de rand van de buis te plaatsen. Sluit de buis af en keer voorzichtig om om te mengen. Draai op 200 tot 400 G gedurende 10 tot 20 seconden in een met de hand aangedreven centrifuge om het monster op de bodem van de buis te laten bezinken.Nadat u de buis in folie hebt gewikkeld, laat u de reactie minstens drie uur doorgaan. Neem vervolgens amideproton T2 op het diamagnetische monster op met dezelfde parameters die voor het paramagnetische monster worden gebruikt. Intramoleculaire amide proton gamma's PREs werden geregistreerd op een zelf-associërend intrinsiek ongeordend fragment afgeleid van het lage complexiteitsdomein van het RNA-bindende eiwit EWSR1.Residuen in de nabijheid van het bevestigingspunt van het spinlabel zullen naar verwachting aanzienlijk worden verbreed en zijn niet detecteerbaar in het spectrum. Residuen die sequentieel van het aanhechtingspunt waren geplaatst, maar toch een verbeterd gamma vertoonden, lagen ruimtelijk dicht bij het spinlabel. In het geval van intrinsiek ongeordende eiwitten zal het registreren en analyseren van purees informatie opleveren over intramoleculaire contacten en voorbijgaande interactieoppervlakken.Het combineren van PRE-metingen met andere biofysische methoden zoals dynamische lichtverstrooiing, grootte-uitsluitingschromatografie, analytische ultracentrifugatie en computationele methoden kan diepere inzichten bieden. PRE-meting helpt bij het karakteriseren van voorbijgaande dunbevolkte toestanden. Deze benadering kan worden uitgebreid om interacties te karakteriseren die belangrijk zijn voor talloze biologische processen zoals moleculaire herkenning, allosterische conformatieselectie en assemblageprocessen, waaronder het assembleren van membraanloze organellen via fasescheiding.

paramagnetic-relaxation-enhancement-for-detecting-characterizing-self

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Het doel van dit experiment is om vast te stellen en de grootte, vorm en stabiliteit van zelf-geassembleerde discotische amfifielen in het water te controleren. Voor waterige basis van supramoleculaire polymeren, mate van controle is erg moeilijk. Wij hanteren een strategie met behulp van zowel afstotend en aantrekkelijk interacties. De experimentele technieken toegepast om dit systeem te karakteriseren zijn breed toepasbaar.

Het beheersen van de grootte, vorm en stabiliteit van de supramoleculaire polymeren in water

Dit artikel beschrijft methoden voor door de gebruiker bepaalde spinlabeling en reconstituur van pentamere ligand-gebonden kanalen voor studies met Elektronen Paramagnetische Resonantie. Dit protocol kan worden aangepast voor elk membraaneiwit. De hier beschreven reconstituurmethode kan ook worden gebruikt voor patch-clamp metingen van macroscopische en enkele-kanaalstromen in een gedefinieerd lipidensysteem.

Site Gericht spin labeling en EPR spectroscopische Studies van pentamere Ligand-ionkanalen

We beschrijven hier een methode om meerdere fosforylaties van een intrinsiek ongeordend eiwit te identificeren door middel van Kernspinresonantiespectroscopie (NMR), met behulp van het Tau-eiwit als casestudie. Recombinant Tau wordt isotopisch verrijkt en gemodificeerd in vitro door een kinase voorafgaand aan gegevensverwerving en analyse.

Nucleaire magnetische resonantie spectroscopie voor de identificatie van verschillende fosforyleringen van intrinsiek ontvouwen eiwitten

Structuren van supramoleculaire eiwit samenstellingen met atomaire resolutie zijn van groot belang vanwege hun cruciale rol in een verscheidenheid van biologische fenomenen. Hierin presenteren wij een protocol voor het uitvoeren van high-resolution structurele studies op onoplosbare en niet-kristallijne macromoleculaire eiwit samenstellen door magie-angle spinning solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (MAS SSNMR).

Atoomschaal structurele Studies van macromoleculaire samenstellen door Solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie

We presenteren een protocol voor het meten van de magnetische veld afhankelijkheid van de spin-Lattice ontspannings tijd van 13C-verrijkte verbindingen, hypergepolariseerd door middel van dynamische nucleaire polarisatie, met behulp van snelle veld-fietste relaxometrie. Concreet hebben we dit aangetoond met [1-13C] Pyruvate, maar het protocol kan worden uitgebreid naar andere hypergepolariseerde substraten.

Meten van de spin-Lattice ontspanning magnetische veld afhankelijkheid van Hypergepolariseerde [1-13C] Pyruvate

Hier wordt een gedetailleerde beschrijving gegeven van het protocol dat in het laboratorium is geïmplementeerd voor de verwerving en analyse van 15N-ontspanningsdispersieprofielen door oplossing NMR-spectroscopie.

15 N CPMG Ontspanningsdispersie voor het onderzoek van eiwitconformatiedynamiek op de μs-ms tijdschaal

Hier presenteren we een protocol waarin de verwerving, verwerking en analyse van een reeks NMR-experimenten wordt beschreven die gericht zijn op het karakteriseren van eiwit-glycaaninteracties in oplossing. De meest voorkomende op liganden gebaseerde en op eiwitten gebaseerde methodologieën worden geschetst, die ongetwijfeld bijdragen aan de gebieden van structurele glycobiologie en moleculaire herkenningsstudies.

Ontwarren van glycaan-eiwitinteracties: nucleaire magnetische resonantie (NMR) om te redden

Nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie kan de structurele eiwitdynamica op een residuspecifieke manier karakteriseren. We bieden een hands-on protocol voor het opnemen van NMR 15N, R1 en R2 relaxatie en {1H}-15N heteronucleair Overhauser effect (hetNOE) experimenten, gevoelig voor de picoseconden tot nanoseconden tijdschaal.

NMR 15N relaxatie-experimenten voor het onderzoek van de picoseconde tot nanoseconde structurele dynamica van eiwitten

Elektron paramagnetisch resonantie (EPR) spectroscopie is een eenduidige methode voor het meten van vrije radicalen. Het gebruik van selectieve spin sondes zorgt voor detectie van vrije radicalen in andere cellulaire compartimenten. Presenteren we een praktische, efficiënte methode voor het verzamelen van biologische monsters die behandeling, opslaan en overzetten van monsters voor EPR metingen te vergemakkelijken.

Gebruik van Electron paramagnetisch resonantie in biologische monsters bij kamertemperatuur en 77 K

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol waarin een nieuwe TL kleuring techniek voor de detectie van de totale proteïne in polyacrylamide gels. Het protocol maakt gebruik van een zilveren ion-specifieke fluorescentie turn-on sonde, die Ag+detecteert-eiwitcomplexen, en elimineert bepaalde beperkingen van traditionele chromogenic zilveren vlekken.

Fluorescerende zilveren kleuring van eiwitten in Polyacrylamide Gels

Leer paramagnetische relaxatieverbetering met PRE-NMR-spectroscopie voor het detecteren van zwakke interacties in intrinsiek ongeordende eiwitten. Deze methode kwantificeert biomoleculaire dynamiek met atomair resolutie.

Paramagnetische relaxatieverbetering voor het detecteren en karakteriseren van zelfassociaties van intrinsiek ongeordende eiwitten (Video) | JoVE Journal

Paramagnetische relaxatieverbetering voor het detecteren en karakteriseren van zelfassociaties van intrinsiek ongeordende eiwitten

Meer video's verkennen