Paramagnetische relaxatieverbetering voor het detecteren en karakteriseren van zelfassociaties van intrinsiek ongeordende eiwitten

De paramagnetische relaxatieverbeteringstechniek kan worden gebruikt om intermoleculaire afstanden te karakteriseren en te meten en voorbijgaande en / of laagbevolkte biomoleculaire interacties te kwantificeren. Hier hebben we deze techniek toegepast om interacties vast te leggen die voorafgaan aan eiwitcondensatie. De gevoeligheid van PREs maakt identificatie van atomaire resolutie, detectie en kwantificering van dynamische toestanden mogelijk die onzichtbaar en ontoegankelijk blijven voor andere NMR-technieken.

Belangrijke stappen in dit protocol zijn het verwijderen van het ongeconjugeerde nitroxide spinlabel en het zorgvuldig analyseren van de spectra om de piekhoogte nauwkeurig te meten. Bovendien moet voorzichtigheid worden betracht tijdens het instellen van het NMR-experiment en de pulskalibratie. Voeg om te beginnen 3-maleimido-PROXYL toe uit een stamoplossing met 20 keer molaire overmaat van het 15N isotopisch gelabelde eiwit van belang.

Incubeer 's nachts bij kamertemperatuur of vier graden Celsius beschermd tegen licht en zuurstof en met zacht schommelen of nutatie. Verwijder de volgende dag het niet-gereageerde vrije spinlabel om niet-specifiek oplosmiddel PRE te voorkomen met behulp van uitgebreide dialyse van het eiwitmonster of met behulp van gelfiltratie. Gebruik vervolgens het reagens van Ellman om vrije sulfhydrylgroepen in de oplossing te kwantificeren.

Meet de absorptie met behulp van een microplaatlezer en construeer de standaardcurve. Om intramoleculaire PRE te meten, bereidt u 15N isotopisch verrijkt spin-gelabeld eiwit tot een concentratie van ten minste 100 micromolair, maar niet meer dan 300 micromolair, in een buffer die geschikt is voor NMR. Breng vervolgens met behulp van een glazen pipet met lange steel of micropipet het NMR-monster over naar een NMR-buis van vijf millimeter die geschikt is voor gebruik in magneten met een hoog veld.

Plaats het monster in de magneet. Vergrendel het deuteriumsignaal met behulp van het vergrendelingscommando en stem het protonkanaal af en match het volgens de facilitaire protocollen. Pas vervolgens de shims aan met behulp van de bovenste shim-subroutine om de onderdrukking van het oplosmiddelsignaal te optimaliseren.

Kalibreer vervolgens de protonenpuls met behulp van het P-OPT-programma. Kalibreer vervolgens de 15N-puls tegen een standaardmonster. Bepaal de juiste demping voor gevormde pulsen met behulp van de subroutine van het vormgereedschap.

Open vervolgens het juiste pulsvormbestand door op het mappictogram te klikken. De gevormde pulsen zijn te vinden in de sectie pulsparameters van acquisitieparameters. Nadat u het pulsdefinitiebestand hebt geladen, klikt u op Golfvorm analyseren, gevolgd door Shape integreren.

Voer het gekalibreerde proton 90 graden harde puls, gewenste vorm pulslengte en rotatie in. Bereken vervolgens het vermogensniveau van de gevormde puls door de verandering van het vermogensniveau toe te voegen aan de demping voor de gekalibreerde puls van 90 graden. Neem een standaard proton 15N HSQC op om de veegbreedte, de draaggolffrequentie te optimaliseren en de wateronderdrukking te controleren.

Pas ten slotte de veegbreedte en het aantal indirecte dimensieverhogingen aan met de opdrachten SW en TD of rechtstreeks in de juiste dialoogvensters. Kalibreer de gevormde pulsen zoals eerder gedemonstreerd. Voer vervolgens de gekalibreerde pulslengtes in het gedeelte pulsparameters in op het tabblad Acquisitieparameters.

Om het amideproton T2 te meten met behulp van de tweetijdsvertragingspuntbenadering, stelt u de tijdvertragingen in door het VD-lijstbestand te bewerken. De eerste vertraging is ingesteld op 0,01 milliseconden. Gebruik de relatie met de verwachte maximale PRE en kies de tweede vertraging.

Bepaal vervolgens een geschikte waarde door de eerste stappen van de eerste en tweede vertragingsspectra te vergelijken en de tweede vertraging zodanig aan te passen dat het signaal vervalt tot 40 tot 50% van de beginwaarde. Bepaal het aantal complexe punten dat moet worden vastgelegd en het aantal scans voor voldoende signaalgemiddelde. Gebruik vervolgens de opdracht EXPT om de experimenttijd te berekenen en start het experiment met de opdracht ZG. Na het oplossen van natriumascorbaat in de NMR-buffer, past u de pH aan die van de oorspronkelijke NMR-buffer aan.

Voeg vervolgens het ascorbinezuur toe aan de NMR-buis met een 10 keer molaire overmaat boven de concentratie van het spinlabel door een druppel onder de rand van de buis te plaatsen. Sluit de buis af en keer voorzichtig om om te mengen. Draai op 200 tot 400 G gedurende 10 tot 20 seconden in een met de hand aangedreven centrifuge om het monster op de bodem van de buis te laten bezinken.

Nadat u de buis in folie hebt gewikkeld, laat u de reactie minstens drie uur doorgaan. Neem vervolgens amideproton T2 op het diamagnetische monster op met dezelfde parameters die voor het paramagnetische monster worden gebruikt. Intramoleculaire amide proton gamma's PREs werden geregistreerd op een zelf-associërend intrinsiek ongeordend fragment afgeleid van het lage complexiteitsdomein van het RNA-bindende eiwit EWSR1.

Residuen in de nabijheid van het bevestigingspunt van het spinlabel zullen naar verwachting aanzienlijk worden verbreed en zijn niet detecteerbaar in het spectrum. Residuen die sequentieel van het aanhechtingspunt waren geplaatst, maar toch een verbeterd gamma vertoonden, lagen ruimtelijk dicht bij het spinlabel. In het geval van intrinsiek ongeordende eiwitten zal het registreren en analyseren van purees informatie opleveren over intramoleculaire contacten en voorbijgaande interactieoppervlakken.

Het combineren van PRE-metingen met andere biofysische methoden zoals dynamische lichtverstrooiing, grootte-uitsluitingschromatografie, analytische ultracentrifugatie en computationele methoden kan diepere inzichten bieden. PRE-meting helpt bij het karakteriseren van voorbijgaande dunbevolkte toestanden. Deze benadering kan worden uitgebreid om interacties te karakteriseren die belangrijk zijn voor talloze biologische processen zoals moleculaire herkenning, allosterische conformatieselectie en assemblageprocessen, waaronder het assembleren van membraanloze organellen via fasescheiding.