Verbetering van de reproduceerbaarheid om te voldoen aan minimale informatie voor studies van extracellulaire blaasjes 2018 Richtlijnen voor het volgen van nanodeeltjes

Dit protocol is ontwikkeld voor beginnende operators van de NanoSight LM10. Door de stapsgewijze instructies te volgen, kunnen nauwkeurige en reproduceerbare resultaten worden verkregen. Deze techniek zorgt voor consistente resultaten in meerdere proefversies, ongeacht het vaardigheidsniveau van de gebruiker.

Nanodeeltjeskarakterisering, met name kwantificering, blijft een uitdaging in het onderzoeksveld van extracellulaire blaasjes. Dit protocol maakt een consistente grootte- en concentratieanalyse van nanodeeltjes in suspensie mogelijk. Begin met het reinigen van de glasoppervlakken van de lasermodule met een lensreiniger van goede kwaliteit en lenspapier.

Voordat u de module monteert, moet u ervoor zorgen dat de O-ringafdichting goed in de groef van het deksel van de stroomcel zit. Plaats vervolgens het deksel van de stroomcel op de lasermodule en zorg ervoor dat de elektrische contacten in de juiste richting staan. Plaats vervolgens de vier veerbelaste duimschroeven door de stroomcelplaat en schakel de draden van de lasermodule in zonder afzonderlijk aan te spannen.

Terwijl u een gelijkmatige druk uitoefent op het deksel van de stroomcel, draait u de duimschroeven gelijkmatig aan op een afwisselend diagonale manier totdat ze goed zitten. Spoel twee tuberculinespuiten van één milliliter met sliplockadapters drie keer door met één milliliter DPBS. Verwijder de zuiger uit de eerste tuberculinespuit en gooi deze weg voordat u de spuit in de resterende poort steekt om als een leeggemaakt verdunningsmiddel of monsterreservoir te dienen.

Vul vervolgens de tweede spuit met één milliliter DPBS en bevestig deze aan de inlaatpoort van het deksel van de stroomcel. Houd de lasermodule gekanteld met de poort van de uitlaatspuit omhoog zodat lucht uit de kamer kan worden gespoeld terwijl de DPBS langzaam in de lasermodule wordt geïnjecteerd. Spoel de resterende DPBS uit de lasermodule door één milliliter lucht in de inlaatpoort te injecteren.

Herhaal het spoelen twee keer. Leeg na de laatste spoeling de lasermodule zo volledig mogelijk en laad de module voor scherpstellen en positioneren. Open de software.

Klik onder het tabblad Vastleggen in het vak in de linkerbovenhoek op Camera starten. Als de camera na vijf minuten automatisch wordt uitgeschakeld, klikt u op Camera starten om deze opnieuw op te starten. Pas op hetzelfde tabblad het cameraniveau aan op 14 tot 16 om de laserlijn helderder te maken en de identificatie en focus van deeltjes te vereenvoudigen.

Door de bovenste schuifregelaar aan de linkerkant van het hoofdstuk naar binnen of naar buiten te bewegen, leidt u het beeld van de camera naar de oculairs. Zoek in het gezichtsveld het gebied met verhoogde dichtheid, aangeduid als de vingerafdruk en het midden, en focus de vingerafdruk verticaal. Centreer in het gezichtsveld de laserlijn en verplaats vervolgens de bovenste schuifregelaar om licht naar de camera te leiden zoals waargenomen op het computerscherm.

Het beeld op het computerscherm is een spiegelbeeld van het zicht in de microscoop oculairs. Pas de scherpstelling aan om het beeld van individuele bewegende deeltjes op het scherm te verscherpen met de scherpstelknop. Om de monsters te laden, zuigt u één milliliter van het monster op in een gespoelde tuberculinespuit van één milliliter en bevestigt u de spuit aan de inlaatpoort van het deksel van de stroomcel.

Blijf de zuiger naar voren schuiven totdat er vloeistof zichtbaar is in de open spuit die aan de uitlaatpoort is bevestigd. De module moet worden gekanteld zodat lucht uit de lasermodule kan worden gezuiverd. Verplaats in de cameraweergave de scherpstelling rechts van de laserlijn naar een gebied met een uniform aantal deeltjes.

Pas de verticale oriëntatie aan om de horizontale lichtbanden te centreren en stel opnieuw scherp totdat het grootste aantal deeltjes in beeld is. Zorg ervoor dat de positie van de focus consistent blijft voor alle volgende maatregelen. Pas het cameraniveau aan op het punt dat het donkere informatiesymbool met tussenpozen in- en uitschakelt in de rechterbovenhoek van de cameraweergave.

Voor nanodeeltjestrackinganalyse of NTA stelt u de duur in op 30 of 60 seconden en het aantal video's op vijf. Als u de bestaande basisbestandsnaam wilt wijzigen, klikt u op het tabblad voor een nieuwe opslagsite voor gegenereerde gegevens met een nieuwe bestandsnaam. Vink vervolgens het vakje doeltemperatuur aan om de gewenste temperatuur in te voeren en klik op script maken om de standaardmeting opnieuw te gebruiken.

Zodra het voorbeeld is geladen en het experiment klaar is om te worden uitgevoerd, klikt u op Script maken en uitvoeren. Vul in het pop-upscherm met ingestelde rapportdetails de velden in met de benodigde informatie over de operator, het monster en het verdunningsmiddel. Wanneer alle gewenste velden zijn ingevuld, klikt u op instellingen OK om het script te starten.

Zoek voorafgaand aan elke video-opname naar een prompt om de zuiger handmatig vooruit te helpen. Injecteer ongeveer 0,05 milliliter van het monster in de laserkamer. Als de deeltjes tot rust komen, klikt u op OK. Na het voltooien van de vijfde video-opname verschijnt er een bevestigingsvak voor instellingen samen met het procesvak.

Aangezien de frames handmatig vanaf de onderkant van het videoscherm worden gevorderd, noteert u het aantal blauwe kruisen dat deeltjes op het scherm maakt en stelt u de detectiedrempel in voor de verwerking van het monster. Wacht tot de video's automatisch worden verwerkt in een histogram met resultaten voordat een dialoogvenstermelding van voltooiing wordt weergegeven en druk vervolgens op OK. Nadat het vak exportinstellingen is weergegeven, slaat u de resultaten op door op exporteren te klikken. Markeer alle vijf de opnamevideo's die in het huidige experiment worden vermeld.

Klik vervolgens op geselecteerde bestanden verwerken en wacht tot het bevestigingsvak voor de instelling in het procesvak verschijnt om de detectiedrempel te wijzigen, pas vervolgens de detectiedrempel aan op het gewenste niveau en ga naar instelling en klik op OK. De video's worden automatisch verwerkt in een histogram van resultaten en er wordt een dialoogvenstermelding van voltooiing weergegeven. Klik OK.In de representatieve analyse, de resultaten van de nanotracking analyse, of NTA, voor de liposoommonsters en een representatief DPBS verdunningsmiddel worden getoond. Gefilterde monsters hadden een gemiddelde deeltjesdiameter van 108 nanometer en een concentratie van 7,4 keer 10 tot de achtste deeltjes per milliliter.

Ongefilterde monsters hadden daarentegen een gemiddelde deeltjesdiameter van 159 nanometer en een concentratie van 7,6 keer 10 tot de achtste deeltjes per milliliter. Op gecombineerde cameraniveaus, toen de detectiedrempel werd verhoogd van twee naar vijf, vertoonden de gemiddelde en modusdeeltjesgrootte een significante afname van de deeltjesgrootte van de gefilterde monsters. Deeltjesconcentraties bij gecombineerde cameraniveaus daalden naarmate de detectiedrempel werd verhoogd.

Er werd geen significant verschil in deeltjesconcentraties tussen gefilterde en ongefilterde monsters gedetecteerd. Bij gecombineerde detectiedrempels, toen het cameraniveau steeg van 12 naar 14, werd een afname van de gemiddelde en modusdeeltjesgrootte van de gefilterde monsters opgemerkt. Deeltjesconcentraties bij gecombineerde detectiedrempels namen toe naarmate de cameraniveaus toenamen van 12 naar 14.

Er werden geen significante verschillen waargenomen tussen gefilterde en ongefilterde monsters. Stap 4.1 tot en met 5.2 zijn belangrijk om het juiste weergavegebied te vinden. Het bereiken van consistente resultaten in meerdere proefruns hangt af van deze herhaalbare vaardigheid.

Dynamische lichtverstrooiing wordt vaak gebruikt als een metgezel voor nanodeeltjesvolganalyse, voornamelijk om de zetapotentiaal te krijgen, wat de oppervlaktelading van de deeltjes is. Voor nanodeeltjesanalyse blijft NTA een zeer waardevolle methode voor kwantificering van deeltjes die nuttig zijn voor extracellulair blaasjesonderzoek.