Name: Monitoring van borstkankergroei en gemetastaseerde kolonievorming bij muizen met behulp van bioluminescentie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Leer een niet-invasieve methode voor real-time monitoring van borstkankergroei en metastatische kolonisatie bij muizen met behulp van bioluminescentie en fluorescentie. Dit protocol is waardevol voor preklinisch oncologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken de leden van het Y.D.S. laboratorium. We willen het Wohl Institute for Translational Medicine in het Hadassah Medical Center, Jeruzalem, bedanken voor het bieden van de beeldvormingsfaciliteit voor kleine dieren. Deze studie werd ondersteund door de Research Career Development Award van het Israel Cancer Research Fund.

Alle muisexperimenten werden uitgevoerd onder het door de Hebrew University Institutional Animal Care and Use Committee goedgekeurde protocol MD-21-16429-5. Bovendien is de Hebreeuwse Universiteit gecertificeerd door de Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC).
1. Cellijn onderhoud
OPMERKING: De menselijke borstkankercellijnen (MCF-7, MDA-MB-468 en MDA-MB-231) werden in dit protocol gebruikt.
<ol><li>Kweek alle borstkankercellijnen in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM), aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine bij 37 °C in een bevochtigde kooldioxide (5% CO2) incubator. OPMERKING: Controleer de celdichtheid regelmatig; splitsen en uitbreiden voor toekomstig gebruik wanneer ze 70% confluency bereiken.</li>
</ol>2. Virusvoorbereiding
<ol><li>Behandel de HEK293T-cellen met 1 ml trypsine totdat ze loskomen.</li>
	<li>Voeg 10 ml DMEM (10% FBS) toe om de trypsine-activiteit te neutraliseren en breng de celsuspensie over naar een nieuwe centrifugebuis van 15 ml.</li>
	<li>Centrifugeer bij 150 × g gedurende 5 minuten om de cellen te bezinken. Gooi het supernatant na de centrifugering weg en voeg 1 ml vers DMEM-medium toe.</li>
	<li>Bepaal de celconcentratie en zaad 1,2 × 106 cellen/put in een zes-well plaat.</li>
	<li>Verwarm de volgende dag alle benodigde reagentia voor, waaronder transfectiereagens, serumvrij DMEM, envelopplasmide (VSV-G), lentivirusverpakkingsplasmide (ΔVPR) en pLX304 Luciferase-V5 blastplasmide of FUW GFP-plasmide.</li>
	<li>Meng in een 1,5 ml geautoclaveerde centrifugebuis 50 μL serumvrije DMEM met 0,3 μg VSV-G plasmide, 1 μg ΔVPR en 1,2 μg pLX304 Luciferase-V5 blastplasmide of FUW GFP-plasmide.</li>
	<li>Voeg na het grondig mengen van deze plasmiden met het medium 5 μL van het transfectiereagentiaat toe, meng voorzichtig en incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Voeg na incubatie het mengsel druppelsgewijs toe aan de HEK293T-cellen.</li>
	<li>Vervang na 24 uur het groeimedium door 2 ml (30% FBS) DMEM. Oogst de volgende dag (48 uur na de transfectie) het medium dat de virussen bevat ("pLX304 Luciferase-V5 of de FUW GFP-virussen"). OPMERKING: Het gebruik van 30% FBS verbetert de efficiëntie van de virusproductie.</li>
	<li>Om HEK293T-celresiduen te voorkomen, voert u het virusbevattende medium door een spuitfilter van 0,45 μm of centrifuge bij 150 × g gedurende 5 minuten en verzamelt u het supernatant. OPMERKING: Houd voor langdurige opslag de werkende aliquots van het virus op -80 °C.</li>
</ol>3. Het vaststellen van cellen die stabiel GFP en luciferase tot expressie brengen ("GFP + Luc + cellen")
<ol><li>De dag voor het infecteren van de cellen, zaad 8 × 105 cellen per put in een zes-well plaat.</li>
	<li>Vervang na de incubatie 's nachts het groeimedium door vers medium met 8 μg/ml polybreen. Voeg druppelsgewijs 200 μL FUW GFP-virussen toe aan de cellen.</li>
	<li>Optioneel: Om de virusefficiëntie te verbeteren, centrifugeert u de plaat bij 560 × g gedurende 30 minuten (37 °C) (spininfectie).</li>
	<li>Incubeer de cellen gedurende 48 uur en verifieer de GFP-expressie door fluorescentiemicroscopie.</li>
	<li>Sorteer de GFP-tot expressie brengende cellen op fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) (GFP+) (Figuur 1A).</li>
	<li>Infecteer de GFP-gesorteerde cellen met de pLX304 Luciferase-V5 blastvirussen zoals beschreven in stap 3.2.</li>
	<li>Behandel de cellen met blasticidin (10 μg/ml) 30 uur na infectie om te verrijken voor pLX304 Luciferase-V5 blast-expressing cellen (GFP+, Luc+ cellen). Vervang vervolgens om de twee dagen door vers medium dat blasticidin bevat. Behandel bovendien, als controle, naïeve cellen met hetzelfde blasticidin-bevattende medium. OPMERKING: Een duidelijk verschil tussen de geïnfecteerde en controlecellen moet worden waargenomen na een paar dagen behandeling met blasticidin. Dit effect is cellijnafhankelijk en duurt meestal ~ 8-10 dagen. Een slechte overlevingskans duidt op een lage virale productieopbrengst. Als dat zo is, produceer dan een nieuwe partij virussen, omdat een lage efficiëntie toekomstige experimenten kan beïnvloeden.</li>
</ol>4. Valideren van in vitro luciferase activiteit
<ol><li>Kweek de MCF-7, MDA-MB-468 en MDA-MB-231 GFP+ Luc+ cellen in een plaat van 15 cm tot 80% confluency. Oogst de cellen door trypsinisatie, zoals beschreven in stappen 2.1-2.2.</li>
	<li>Zaai een toenemend aantal cellen in elke put (0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4 × 104) in een zwarte 96-putplaat. OPMERKING: Zwarte 96-well platen zijn meer geschikt voor het meten van luciferaseniveaus, omdat witte of transparante platen autoluminescentiesignalen produceren. Gebruik ter controle fosfaatbuffered saline (PBS) alleen in één put om ervoor te zorgen dat er geen autoluminescentie van PBS is.</li>
	<li>Vul alle putjes met 100 μL DMEM en incubeer gedurende 16-24 uur.</li>
	<li>Bereid luciferine-oplossing in PBS met een concentratie van 1,5 mg / ml uit de voorraad van 30 mg / ml. Vul de voorraad luciferineoplossing aan en bewaar bij -20 °C.</li>
	<li>Was de cellen eenmaal voorzichtig met PBS, voeg 100 μL luciferine-oplossing toe aan elk putje en wacht 2 minuten. Meet ten slotte de luciferase-activiteit in alle borstkankercellen met behulp van bioluminescentie. OPMERKING: Het onderzoeken van in vitro GFP- en luciferase-expressie voorafgaand aan dierproeven is cruciaal. Bovendien worden lege putjes gebruikt om de achtergrond af te trekken.</li>
</ol>5. Muizen injecteren met GFP+ Luc+ cellen
<ol><li>Breng 5 × 106 (MCF-7 en MDA-MB-468) of 2 × 106 (MDA-MB-231) GFP+ Luc+ cellen over in respectievelijk 200 μL of 100 μL PBS.</li>
	<li>Reinig vóór de injectie de steriele biologische kap met een 5% desinfecterende oplossing (zie de tabel met materialen). Verdoof vervolgens de muizen met gefilterde (0,2 μm) lucht die 4% isofluraan bevat bij een luchtdebiet van 1 l / min gedurende 2−3 minuten. OPMERKING: Het is essentieel om de juiste verdoving te bevestigen; knijp in de teen van de muis en zoek naar een reactie.</li>
	<li>Plaats een kegel over de verdoofde muizenkop in rugligging. Breng dierenartszalf aan op zijn ogen om droogheid onder narcose te voorkomen.</li>
	<li>Veeg de buikstreek van de muis, boven de borstklier, met ethanol met behulp van een wattenstaafje en til de4e borstklier op met een tang.</li>
	<li>Steek de naald 27 G x 3/4 (0,4 x 19 mm) onder het vetkussen en injecteer langzaam 100 μL van de celsuspensie. OPMERKING: Er verschijnt een ronde uitstulping onder de huid. Bovendien kan een onjuiste injectie leiden tot afwijking in de tumorgroeisnelheid of afwezigheid van tumor in dezelfde experimentele groep.</li>
	<li>Haal na de injectieprocedure de muizen uit de kap en breng ze over naar een nieuwe kooi. Houd de muizen in de gaten totdat ze weer bij bewustzijn komen. OPMERKING: Zorg ervoor dat alle gebruikte naalden en spuiten in de naaldendoos worden weggegooid.</li>
</ol>6. Meten van de luciferase niveaus in GFP+ Luc+ muizen
<ol><li>Houd vóór de bioluminescentiedetectie de bewuste muis in bedwang door zijn nek met de linkerhand vast te houden. Kantel vervolgens de hand naar links, wat resulteert in de muis naar boven gericht met het onderlichaam in rugligging.</li>
	<li>Injecteer 100 μL luciferine (30 mg/ml) intraperitoneaal (i.p.) in het buikoppervlak van de muis in het kwadrant linksonder in de buik met behulp van een spuit van 1,0 ml met naaldgrootte 27 G x 3/4 (0,4 x 19 mm). OPMERKING: De punt van de naald mag niet meer dan 3-5 mm van de buikwand worden ingebracht, omdat deze viscerale organen kan binnendringen. Bovendien wordt aanbevolen om i.p. injectie zonder anesthesie uit te voeren, omdat de luciferineverdeling in het lichaam van verdoofde muizen langzamer is dan bij bewuste muizen. Het monitoren van luciferaseniveaus bij bewuste muizen is dus een snellere procedure.</li>
	<li>Houd de muis gedurende 7 minuten zonder verdoving gevolgd door 3 minuten in de anesthesiekamer voordat de tumorkinetiek wordt gemeten. OPMERKING: De incubatietijd varieert tussen de verschillende experimenten, cellijnen en soort tot soort. Daarom wordt aanbevolen om de incubatietijd te kalibreren voordat de experimenten worden gestart.</li>
	<li>Verdoof de muizen zoals beschreven in stappen 5.2-5.3.</li>
	<li>Open de software (Tabel met materialen) tijdens de incubatie, initialiseer het beeldvormingssysteem en klik op de knop Initialiseren . OPMERKING: Houd er rekening mee dat de camera ~ 10 minuten nodig heeft om af te koelen en -90 ° C te bereiken. Bovendien, als achtergrondcontrole, meet de luciferaseniveaus in naïeve muizen (d.w.z. GFP + -muizen geïnjecteerd met cellen die het luciferase-gen niet tot expressie brengen).</li>
	<li>Houd de instelling in automatische belichting met behulp van de volgende instellingen: belichtingstijd automatisch, 60 s; Binning Medium, F/Stop 1; Excitatiefilter geblokkeerd; Emissiefilter open. Wanneer de initialisatie is beëindigd, selecteert u Wizard Imaging | Bioluminescentie en klik vervolgens op Volgende | Filter | openen selecteer Muis in het onderwerp van de afbeelding.</li>
	<li>Selecteer in Veldweergave fase C (10 cm) en Onderwerp hoogte: 1,50 cm.</li>
	<li>Klik op Image Setup Stage to C en voordat u op de knop Acquire klikt, moet u ervoor zorgen dat de muis in de juiste rugligging op het werktuig is geplaatst.</li>
	<li>Sluit de deur, klik op de knop Verwerven en wacht tot er een afbeelding op het scherm verschijnt. OPMERKING: Met de optie Automatische belichting duurt een sterk signaal 5-20 s, afhankelijk van het signaal; een zwak signaal duurt ongeveer 60 s.</li>
	<li>Herhaal deze stap voor de andere muizen.</li>
	<li>Om longmetastasen te detecteren, bedekt u het sterke signaal van de primaire tumor met dik zwart kartonpapier en stelt u alleen de ventrale kant van de longen bloot aan de camera. Leg de afbeelding vast met dezelfde parameters als hierboven beschreven.</li>
</ol>7. Ex vivo beeld verkrijgen met behulp van bioluminescentie en fluorescentie
<ol><li>Euthanaseer de muizen met behulp van koolstofdioxide (CO2) inademing in de exsiccator en ontleed de muizen met behulp van een autoclaaf schaar en tang.</li>
	<li>Perfuseer de muizen met 0,9% zoutoplossing, oogst de organen en spoel met 1x PBS om bloedvlekken uit het orgaan te verwijderen.</li>
	<li>Breng het gespoelde orgaan over in een petrischaaltje en plaats het in het stadium van de bioluminescentiemachine. Pas dezelfde bioluminescentie-instelling toe als beschreven in stap 6.2-6.6. OPMERKING: Vanwege de afname van het luciferasesignaal is deze stap tijdsbeperkend. Dus, na het euthanaseren van muizen, visualiseer het orgaan onmiddellijk door bioluminescentie.</li>
	<li>Voor GFP-afbeeldingen past u dezelfde instelling toe als beschreven in stap 6.3, met behulp van het GFP-filter fluorescentie in plaats van bioluminescentie.</li>
	<li>Maak longfoto's met een stereomicroscoop om de aanwezigheid van GFP + - kolonies te onderzoeken.</li>
</ol>8. Analyse van bioluminescentiegegevens
<ol><li>Dubbelklik op de software en selecteer Openen in het menu Bestand .</li>
	<li>Open alle bestanden en minimaliseer ze. Zorg ervoor dat alle eenheden Radiance (Photons) zijn. Klik bovendien op Toepassen op alles om dezelfde parameters voor alle afbeeldingen te behouden.</li>
	<li>Selecteer in het menu Beeld het gereedschapspalet, waarmee een nieuw venster wordt geopend.</li>
	<li>Selecteer in het venster Gereedschapspalet het tabblad ROI-gereedschappen en kies bij Type de gemiddelde ROI van Bkg.</li>
	<li>Selecteer cirkel in de ROI-gereedschappen en teken een kleine cirkel op het thoracale gebied van de muis.</li>
	<li>Dubbelklik op de cirkel, selecteer de optie Gebruiken als BKG voor toekomstige ROI's op het tabblad Achtergrond ROI en klik op Gereed.</li>
</ol>9. Meten van de totale flux
<ol><li>Selecteer in het venster Gereedschapspalet het tabblad ROI-gereedschappen en kies bij Type de optie Meting van ROI.</li>
	<li>Selecteer cirkel in de ROI-tools en teken een grote cirkel op de primaire tumor van de muis.</li>
	<li>Klik met de rechtermuisknop op ROI kopiëren en klik met de rechtermuisknop op ROI plakken in elk afzonderlijk bestand van elke muis.</li>
	<li>Klik op METEN VAN ROI's op het tabblad ROI-tools, dat een nieuw venster opent met de naam ROI-metingen. Houd op dit tabblad de metingentypen als uitstraling (fotonen) en afbeeldingskenmerken als alle ingevulde waarden.</li>
	<li>Exporteer het bestand als metingenbestand (*.txt) of Csv (*.csv) formaat.</li>
	<li>Open de geëxporteerde gegevens in een spreadsheet en neem de totale flux (p/s) en de waarden voor de weken. OPMERKING: Deze stap kan worden gebruikt om verschillende groepen te meten. Bijvoorbeeld muizen behandeld met een voertuig versus degenen die werden behandeld met een medicijn.</li>
	<li>Genereer een XY-plot, waarbij de tijd wordt weergegeven langs de X-as en de totale flux (p/s) langs de Y-as. Neem voor elke week de parameter Total Flux (p/s) voor elke steekproefgroep en bepaal eventuele significante verschillen met behulp van de niet-parametrische Student's t-test.</li>
</ol>

<ol><li>Waks, A. G., Winer, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+treatment%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Breast cancer treatment: A review.</a> JAMA. 321 (3), 288-300 (2019).</li>
<li>Jin, X., Mu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer%3A+Basic+and+Clinical+Research%22%5BJournal%5D)">Targeting breast cancer metastasis.</a> Breast Cancer: Basic and Clinical Research. 9, Suppl 1 23-34 (2015).</li>
<li>Saha, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+of+tumor+hypoxia+dynamics+of+breast+cancer+brain+metastasis+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3175(2011).</li>
<li>Rashid, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+tail+vein+injection+a+relevant+breast+cancer+lung+metastasis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Disease%22%5BJournal%5D)">Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model.</a> Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).</li>
<li>Fantozzi, A., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Mouse models of breast cancer metastasis.</a> Breast Cancer Research. 8 (4), 212(2006).</li>
<li>Kocatürk, B., Versteeg, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+injection+of+breast+cancer+cells+into+the+mammary+fat+pad+of+mice+to+study+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e51967(2015).</li>
<li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+whole+picture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The whole picture.</a> Nature. 463 (7283), 977-979 (2010).</li>
<li>Wang, Y., Tseng, J. -C., Sun, Y., Beck, A. H., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+imaging+of+tumor+burden+and+molecular+pathways+in+mouse+models+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Noninvasive imaging of tumor burden and molecular pathways in mouse models of cancer.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 135-144 (2015).</li>
<li>Kim, J. E., Kalimuthu, S., Ahn, B. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cell+tracking+with+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nuclear+Medicine+and+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">In vivo cell tracking with bioluminescence imaging.</a> Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (1), 3-10 (2015).</li>
<li>Paschall, A. V., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthotopic+mouse+model+of+spontaneous+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">An orthotopic mouse model of spontaneous breast cancer metastasis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), (2016).</li>
<li>Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Three+Different+Methods+for+Determining+Cell+Proliferation+in+Breast+Cancer+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), e54040(2016).</li>
<li>Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+metastasis+and+CTL+adoptive+transfer+immunotherapy+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Experimental metastasis and CTL adoptive transfer immunotherapy mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2077(2010).</li>
<li>Lv, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+transplantation+of+breast+tumors+as+preclinical+models+for+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Orthotopic transplantation of breast tumors as preclinical models for breast cancer.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61173(2020).</li>
<li>Cheng, R. Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+triple+negative+breast+cancer+using+orthotopic+breast+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Studying triple negative breast cancer using orthotopic breast cancer model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60316(2020).</li>
<li>Bajikar, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-suppressor+inactivation+of+GDF11+occurs+by+precursor+sequestration+in+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor-suppressor inactivation of GDF11 occurs by precursor sequestration in triple-negative breast cancer.</a> Developmental Cell. 43 (4), 418-435 (2017).</li>
<li>Khatib, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glutathione+peroxidase+8+%28GPX8%29%2FIL-6%2FSTAT3+axis+is+essential+in+maintaining+an+aggressive+breast+cancer+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The glutathione peroxidase 8 (GPX8)/IL-6/STAT3 axis is essential in maintaining an aggressive breast cancer phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21420-21431 (2020).</li>
</ol>

Alle auteurs hebben bekendgemaakt dat ze geen belangenconflicten hebben.

Dierproeven zijn verplicht voor kankeronderzoek 7,8,9, en inderdaad zijn er veel protocollen ontwikkeld 3,6,10,11,12,13,14. De meeste van deze studies bepaalden het biologische effect echter pas aan...

Borstkankers zijn wereldwijd frequente vormen van kanker, met ongeveer 250.000 nieuwe gevallen die elk jaar in de Verenigde Staten worden gediagnosticeerd1. Ondanks de hoge incidentie heeft een nieuwe reeks geneesmiddelen tegen kanker de resultaten van borstkankerpatiënten aanzienlijk verbeterd2. Deze behandelingen zijn echter nog steeds ontoereikend, omdat veel patiënten een terugval van de ziekte en gemetastaseerde verspreiding naar vitale organenervaren 2, wat de primaire oorzaak is van morbiditeit en mortaliteit van de patiënt. Daarom is een van de belangrijkste uitdagingen in borstkankeronderzoek het identificeren van de moleculaire mechanismen die de vorming van distale metastasen reguleren om nieuwe middelen te ontwikkelen om hun ontwikkeling te remmen.
Kankermetastase is een dynamisch proces waarbij cellen zich losmaken van de primaire tumor en via de bloedcirculatie naburige weefsels binnendringen. Diermodellen waarin de cellen een vergelijkbare gemetastaseerde cascade ondergaan, kunnen dus de identificatie van de mechanismen die dit proces beheersenvergemakkelijken 3,4. Bovendien zijn deze in vivo modellen essentieel voor de ontwikkeling van borstkanker therapeutische middelen 5,6. Deze orthotopische modellen kunnen echter niet de werkelijke tumorgroeikinetiek aangeven, omdat het effect pas bij beëindiging wordt bepaald. Daarom hebben we een op luciferase gebaseerd hulpmiddel opgezet om tumorontwikkeling en gemetastaseerde kolonisatie in realtime te detecteren. Bovendien drukken deze cellen GFP uit om de gemetastaseerde kolonies te detecteren. Deze aanpak is relatief eenvoudig en omvat geen invasieve procedures3. Het combineren van luciferase en fluorescentiedetectie is dus een nuttige strategie om de preklinische studies van borstkankertherapieën en ziektebeheer te bevorderen.

<table><tbody><tr><td>1.7 mL eppendorf tubes</td><td>Lifegene</td><td>LMCT1.7B-500</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro;L tips</td><td>Lifegene</td><td>LRT10</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro;L tips</td><td>Lifegene</td><td>LRT1000</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tubes</td><td>Lifegene</td><td>LTB15-500</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro;L tips</td><td>Lifegene</td><td>LRT200</td><td></td></tr><tr><td>6 well cell culture plate</td><td>COSTAR</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>96 well Plates BLACK flat bottom</td><td>Bar Naor</td><td>BN30496</td><td></td></tr><tr><td>Automated Cell Counters</td><td>Thermofisher</td><td>A50298</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria III sorter</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Microlance 3 Needles 27 G (3/4'')</td><td>BD</td><td>302200</td><td></td></tr><tr><td>BD Plastipak Syringes 1 mL x 120</td><td>BD</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>Corning 100 mm x 20 mm Style Dish</td><td>CORNING</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Corning 150 mm x 20 mm Style Dish</td><td>CORNING</td><td>430599</td><td></td></tr><tr><td>Countess cell counting chamber slides</td><td>Thermofisher</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), high glucose, no glutamine</td><td>Biological Industries</td><td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse 80i microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>eppendorf Centrifuge 5810 R</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EP5820740000</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Biological Industries</td><td>04-127-1A</td><td></td></tr><tr><td>FUW GFP</td><td></td><td></td><td>Gifted from Dr. Yossi Buganim's lab (Hebrew University of Jerusalem)</td></tr><tr><td>HEK293T</td><td></td><td></td><td>Gifted from Dr. Lior Nissim's lab (Hebrew University of Jerusalem)</td></tr><tr><td>Isoflurane, USP Terrell</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-01-25</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine Solution</td><td>Biological industries</td><td>03-020-1A</td><td></td></tr><tr><td>Living Image Software</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>bioluminescence measurement</td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-468</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB-132</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipettes</td><td>NORMAX</td><td>2430-475</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hylabs</td><td>BP655/500D</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-dR8.2-dvpr</td><td>Addgene</td><td>#8455</td><td>Provided by David M. Sabatini&rsquo;s lab (Whitehead institute, Boston, USA)</td></tr><tr><td>pCMV-VSV-G</td><td>Addgene</td><td>#8454</td><td>Provided by David M. Sabatini&rsquo;s lab (Whitehead institute, Boston, USA)</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution</td><td>Biological Industries</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 90 mm (90x15)</td><td>MINI PLAST</td><td>820-090-01-017</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes 10ml</td><td>Lifegene</td><td>LG-GSP010010S</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes 25ml</td><td>Lifegene</td><td>LG-GSP010050S</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes 5ml</td><td>Lifegene</td><td>LG-GSP010005S</td><td></td></tr><tr><td>pLX304 Luciferase-V5 blast plasmid</td><td>Addgene</td><td>#98580</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#107689</td><td></td></tr><tr><td>Prism 9</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagent Reservoirs</td><td>Bar Naor</td><td>BN20621STR200TC</td><td></td></tr><tr><td>SMZ18 Stereo microscopes</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Bio-Lab</td><td>190359400</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filters</td><td>Lifegene</td><td>LG-FPV403030S</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue 0.5% solution</td><td>Biological industries</td><td>03-102-1B</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%)</td><td>Biological Industries</td><td>03-052-1a</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum driven Filters</td><td>SOFRA LIFE SCIENCE</td><td>SPE-22-500</td><td></td></tr><tr><td>Virusolve</td><td></td><td>disinfectant</td><td></td></tr><tr><td>VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade</td><td>Promega</td><td>P1043</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#6366236001</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoring van borstkankergroei en gemetastaseerde kolonievorming bij muizen met behulp van bioluminescentie

Monitoring Breast Cancer Growth and Metastatic Colony Formation in Mice using Bioluminescence

Borstkanker is een frequente heterogene maligniteit en de tweede belangrijkste doodsoorzaak bij vrouwen, voornamelijk als gevolg van orgaanmetastase op afstand. Er zijn verschillende diermodellen gegenereerd, waaronder de veelgebruikte orthotopische muismodellen, waarbij kankercellen in het borstvetkussen worden geïnjecteerd. Deze modellen kunnen echter niet helpen bij het monitoren van tumorgroeikinetiek en gemetastaseerde kolonisatie. Geavanceerde hulpmiddelen om kankercellen in realtime bij muizen te volgen, zullen het begrip van tumorbiologie aanzienlijk verbeteren. 
Hier werden borstkankercellijnen vastgesteld die stabiel luciferase en groen fluorescerend eiwit (GFP) tot expressie brengen. Specifiek bevat deze techniek twee opeenvolgende stappen geïnitieerd door het meten van de luciferase-activiteit in vitro en gevolgd door de implantatie van de kankercellen in borstvetkussens van niet-obese diabetische-ernstige gecombineerde immunodeficiëntie (NOD-SCID) muizen. Na de injectie worden zowel de tumorgroei als de gemetastaseerde kolonisatie in realtime gevolgd door het niet-invasieve bioluminescentiebeeldvormingssysteem. Vervolgens zal de kwantificering van GFP-expresserende metastasen in de longen worden onderzocht door fluorescentiemicroscopie om de waargenomen bioluminescentieresultaten te valideren. Dit geavanceerde systeem dat luciferase en fluorescentie-gebaseerde detectietools combineert, evalueert kankermetastase in vivo, wat een groot potentieel heeft voor gebruik in borstkankertherapieën en ziektebeheer.

We genereerden borstkankercellijnen (MDA-MB-231, MCF-7 en MDA-MB-468) die GFP- en luciferasevectoren tot expressie brachten. Concreet werd dit bereikt door een sequentiële infectie. Eerst werden de borstkankercellijnen geïnfecteerd met een lentivirusvector die fluorescerende GFP tot expressie brengt. De GFP-positieve cellen (GFP+) werden 2 dagen na infectie gesorteerd (figuur 1A,B) en geïnfecteerd met de pLX304 Luciferase-V5 vector. Vervolgens werd blasticidin geb...

Hier beschrijven we een niet-invasieve monitoringmethode met luciferase en groene fluorescerende eiwitexpressie in verschillende borstkankercellijnen. Dit protocol biedt een techniek om tumorvorming en gemetastaseerde kolonisatie in realtime bij muizen te volgen.

Monitoring van borstkankergroei en gemetastaseerde kolonievorming bij muizen met behulp van bioluminescentie

Breast cancer is a frequent heterogeneous malignancy and the second leading cause of mortality in women, mainly due to distant organ metastasis. Several ...

Met behulp van deze geavanceerde, niet-invasieve tool kunnen we real-time tumorgroeikinetiek en gemetastaseerde kolonisatie bij muizen volgen, wat een groot potentieel heeft in therapeutisch en ziektebeheer van borstkanker. Het combineren van luciferase en fluorescentiedetectie is een nuttige strategie om de preklinische studies van borstkankerprogressie en ziektebeheer te bevorderen. Dit kan worden toegepast voor geneesmiddelenstudies tegen kanker.Dit protocol is niet beperkt tot borstkanker en kan worden toegepast op andere carcinomen, zoals long- en pancreaskanker. Begin met het kweken van de MCF-7, MDA-MB-468 en MDA-MB-231 GFP en luciferase-positieve cellen afzonderlijk in een plaat van 16 centimeter tot 80% confluentie. Na het oogsten van de cellen door trypsinisatie, zaai een toenemend aantal cellen in elke put in een zwarte 96-well plaat.Vul vervolgens alle putten met 100 microliter DMEM en incubeer gedurende 16 tot 24 uur in 37 graden Celsius, 5% CO2-incubator. Bereid luciferine-oplossing in PBS met een concentratie van 1,5 milligram per milliliter en bewaar de oplossing bij min 20 graden Celsius. Was de cellen na de incubatie eenmaal met PBS voorzichtig voordat u 100 micro

monitoring-breast-cancer-growth-metastatic-colony-formation-mice

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Een experimenteel muismodel van bot metastase is opgericht naar aanleiding intracardiale levering van luciferase expressie mamma tumorcellen. De ontwikkeling van tumoren en resulteerde osteolytische laesie werden longitudinaal gevolgd met bioluminescentie en micro-CT beeldvorming.

Monitoring tumormetastasen en osteolytische laesies met bioluminescentie en Micro CT Imaging

Bioluminescentie beeldvorming van hypoxie induceerbare factor-1α-activiteit wordt toegepast op intracraniale tumor hypoxie ontwikkeling in een borstkanker hersenmetastasen muismodel te controleren.

In vivo bioluminescentie van Tumor Hypoxie Dynamiek van Borstkanker hersenmetastasen in een muismodel

Source: Marina Arantes Radicchi1, Victor Carlos Mello1, Victória Paz Machado1, Márcia Cristina Oliveira da Rocha1, Jaqueline Vaz de Oliveira1, Luana Cristina Camargo1,2, Luís Alexandre Muehlmann1, Ricardo Bentes Azevedo1, Sônia Nair Bao1, João Paulo Figueiró Longo11Institute of Biological Sciences, University of Brasília, 2Department of Basic Psychological Processes, Institute of Psychology, University of BrasíliaThis video demonstrates the procedure for tracking tumor progression in vivo by...

Bioluminescent Imaging of Breast Tumor Progression in a Female Mouse Model

Bioluminescentie beeldvorming is een bekend hulpmiddel voor het lokaliseren van tumoren en metastasen, maar kwantificering van deze beelden zijn vaak complexe berekeningen en bijzondere instrumenten. We beschrijven de easy-to-use luminoscore methode, gebaseerd op een nauwkeurige overname voorwaarden, vereist geen berekeningen, en het mogelijk maken tumorlast en de respons op de behandeling te kunnen houden in muismodellen.

-Bioluminescentie Based Tumor kwantificatie methode voor de controle progressie van de tumor en de effecten van de behandeling in de muis lymfoom Models

Een orthotope borstkanker primaire tumor model en chirurgische verwijdering van de primaire tumor de muis het leven uit te breiden tot spontane metastase genereren beschreven. De tumorgroei en progressie worden gecontroleerd en gekwantificeerd luciferase fluorescentiebeeldvorming.

Een orthotope Muis Model van Spontane uitzaaiing van borstkanker

Wij introduceren een lymfkliertest orthotopic borst kanker en radicale mastectomie model met bioluminescentie technologie te kwantificeren van de last van de tumor om na te bootsen menselijke borst kanker progressie.

Het genereren van een lymfkliertest Orthotopic uitgezaaide borst kanker Model en het uitvoeren van lymfkliertest radicale mastectomie

Dit protocol beschrijft de oprichting van een tumor-lager muismodel om te controleren van de progressie van de tumor en angiogenese in real-time door dubbele bioluminescentie beeldvorming.

Dubbele bioluminescentie beeldvorming van tumor progressie en angiogenese

Dit werk presets een geavanceerd protocol om nauwkeurig te beoordelen tumor laden door detectie van groene fluorescerende eiwitten en bioluminescentie signalen, alsmede de integratie van kwantitatieve moleculaire detectie techniek.

Studeren Triple Negatieve Borstkanker met behulp van Orthotopische Borstkanker Model

De beschreven aanpak combineert experimentele staart ader metastase assays met in vivo levende dierlijke beeldvorming zodat real-time monitoring van borstkanker metastase vorming en groei in aanvulling op de kwantificering van metastasen aantal en grootte in de longen.

Gecombineerd gebruik van staart ader metastase assays en real-time in vivo beeldvorming om borstkanker te kwantificeren gemetastaseerde kolonisatie en last in de longen

Het manuscript beschrijft een methodologie voor het opzetten en longitudinaal monitoren van spontane longmetastasen van orthotopisch geïnjecteerde borsttumoren, die vatbaar is voor interventie in alle stadia van de metastatische cascade.

In vivo Beeldvorming om spontane longmetastasen van orthotopisch geïnjecteerde borsttumorcellen te meten

Hier beschrijven we het protocol voor in vivo toediening van magnetische ijzeroxide nanodeeltjes die RNA-oligomeren vervoeren naar uitgezaaide borstkanker in diermodellen, waardoor een klinisch haalbare benadering wordt geboden voor de therapeutische uitschakeling van oncogene nucleïnezuren.

Monitoring van de accumulatie van nanodrugs bij borstkankermetastasen bij muizen

Leer een niet-invasieve methode voor real-time monitoring van borstkankergroei en metastatische kolonisatie bij muizen met behulp van bioluminescentie en fluorescentie. Dit protocol is waardevol voor preklinisch oncologisch onderzoek.

Monitoring van borstkankergroei en gemetastaseerde kolonievorming bij muizen met behulp van bioluminescentie

Meer video's verkennen