Isolatie en karakterisering van primaire leverbijholteelcellen van muizen
16 december 2021
Hier schetsen en demonstreren we een protocol voor primaire muis lever sinusoïdale endotheelcel (LSEC) isolatie. Het protocol is gebaseerd op levercollageaseperfusie, niet-parenchymale celzuivering door centrifugeren met lage snelheid en CD146 magnetische kraalselectie. We fenotyperen en karakteriseren deze geïsoleerde LSEC's ook met behulp van flowcytometrie en scanning elektronenmicroscopie.
Hier demonstreren we ons protocol van primaire muis lever sinusoïdale celisolatie of LSEC-isolatie. Het protocol bestaat uit lever collagenase perfusie en lage snelheid ultracentrifugatie voor niet-parenchymale celzuivering en CD146 magnetische kraalselectie. Onze LSEC-isolatiemethode is zeer efficiënt en toepasbaar op gezonde en zieke muizenlever.
De geïsoleerde LSEC's vertonen een hoge zuiverheid en behouden de structuur en functie. LSEC's geïsoleerd met behulp van dit protocol zijn optimaal voor functionele en moleculaire studies en multi-omics datageneratie. Dit protocol zal nuttig zijn voor het bestuderen van intercellulaire communicatie in de lever.
Begin met het coaten van 10-centimeter kweekschalen met drie milliliter collageenoplossing. Incubeer vervolgens de gerechten op kamertemperatuur gedurende een uur. Verwijder na een uur het overtollige vocht van het gecoate oppervlak.
Was de afwas met PBS drie keer en laat ze aan de lucht drogen. Stel het verwarmde en bevochtigde recirculatieperfusieapparaat in. Spoel het perfusiesysteem gedurende vijf minuten met 10% bleekmiddel.
Spoel het systeem vervolgens nog eens 10 minuten af met steriel water. Giet de spoelvloeistof zoveel mogelijk af voordat u doordrenkt met collagenase-oplossing. Infundeer de collagenase-oplossing door het perfusiesysteem om het voor te verwarmen tot 37 graden Celsius.
Stel de pompsnelheid in op snelheid op de snelheidsregelaar. Houd de snelheid gedurende de hele procedure gelijk. Weeg de muis voor de procedure.
Bevestig het vervolgens aan het chirurgische oppervlak. Spuit de buik van de muis in met 70% ethanol. Maak met behulp van een chirurgische schaar een incisie van ongeveer vijf centimeter vanaf het onderste deel van de buik tot aan het xiphoid-proces.
Maak daarna twee zijwaartse sneden met behulp van een kleine irisschaar aan elke kant van de buik om de buikorganen volledig bloot te leggen. Plaats de schede van de infuuskatheter onder de rug van het dier om de buik op te tillen en waterpas te zetten. Trek met behulp van een gewone gebogen verbandtang voorzichtig de darmen en de maag links van het dier af.
Plaats vervolgens een 5-0 chirurgische hechting onder de inferieure vena cava, of IVC, net onder de blootgestelde linker nier. Bind een losse trekhaak in de hechtdraad. Plaats vervolgens nog een 5-0 chirurgische hechting rond de ader van het leverportaal.
Plaats de hechting net boven het vertakkingspunt van de hepatische poortader. Knoop nogmaals een losse trekhaak in de hechting. Gebruik de poortadernaad als spanning en plaats de 20-gauge IV-katheter in de hepatische poortader een centimeter lager waar deze zich vertakt naar de rechter- en linker hepatische poortader.
Schuif vervolgens de katheter door de ader, maar houd deze onder het vertakkingsgebied. Laat het bloed door de katheter stromen totdat het begint uit te druipen. Zet de infuuskatheter vast met de poortader hechtdraad.
Gebruik een infuuslijn om een infuusfles met buffer A aan de katheter te bevestigen. Spoel vervolgens de lever met deze oplossing terwijl u de toegang van lucht in het systeem vermijdt. Bind de hechting rond de IVC onder de nier af.
Snijd daarna de IVC onder de hechting om het dier te laten bloeden. Eenmaal doordrenkt, snijdt u de maag, darmen, milt en andere ingewanden weg die aan de lever zijn bevestigd. Snijd vervolgens het diafragma en de belangrijkste bloedvaten weg uit de thoracale holte.
Verwijder de lever van het dier en plaats deze op de perfusiebak. Verwijder voorzichtig de infuuslijn en sluit de collagenase-oplossing aan in de recirculatiekamer. Laat de lever perfuseren totdat de capsule gemodelleerd wordt en papperig lijkt.
Dit duurt meestal 10 tot 15 minuten. Eenmaal verteerd, verwijder de lever uit de kamer en plaats deze op een petrischaaltje van 10 centimeter met ongeveer 20 milliliter serumvrije DMEM. Haal de lever voorzichtig uit elkaar met een paar pipetpunten en gooi de galboom weg.
Filter daarna de leversuspensie door een celzeef van 70 micrometer in een conische buis van 50 milliliter. Centrifugeer de celsuspensie gedurende twee minuten bij kamertemperatuur op 50 maal G. Verzamel vervolgens het supernatant dat niet-parenchymale levercellen bevat.
Centrifugeer het supernatant gedurende vijf minuten bij 300 maal G bij vier graden Celsius. Verzamel daarna de celkorrel en resuspend deze in een milliliter isolatiebuffer. Bepaal het celnummer met behulp van een automatische celteller volgens de instructies van de fabrikant.
Centrifugeer vervolgens de celsuspensie. Zuig het supernatant volledig op en resuspend de pellet met 90 microliter isolatiebuffer per 10 miljoen cellen. Voeg 10 microliter CD146 MicroBeads toe per 10 miljoen totale cellen.
Meng het goed en incubeer gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Om de cellen te wassen, voegt u één tot twee milliliter isolatiebuffer per 10 miljoen cellen toe. Centrifugeer de oplossing gedurende 10 minuten op 300 maal G.
Adem daarna het supernatant volledig op en resuspend tot een miljard cellen in 500 microliter isolatiebuffer. Bereid vervolgens de scheidingskolom voor door deze te spoelen met drie milliliter isolatiebuffer. Breng de celsuspensie aan op de kolom die is gestapeld met 70 micrometer voorscheidingsfilters.
Was de kolom drie keer met drie milliliter isolatiebuffer. Verwijder daarna de kolom uit de separator en plaats deze op een centrifugebuis van 15 milliliter. Pipetteer vijf milliliter isolatiebuffer op de kolom.
Om de magnetische cellen met kralenlabels te herstellen, duwt u de zuiger stevig in de kolom om de cellen weg te spoelen. Centrifugeer ten slotte de cellen gedurende vijf minuten bij 300 maal G bij vier graden Celsius. Geïsoleerde LSEC-zuiverheid en oppervlaktemarkers werden beoordeeld met flowcytometrie.
Data-analyse en gatingstrategie voor gated LSEC's en singlets zijn gebaseerd op forward scatter en side scatter data. Geïsoleerde LSEC's werden gekleurd met een levensvatbaarheidskleurstof en een combinatie van CD45-, CD146- en Stabilin-2-antilichamen. Levensvatbare LSEC's werden gated op CD45 negatieve populatie en geanalyseerd op CD146 en Stabilin-2 expressie.
Op basis van deze gegevens werd bevestigd dat de geïsoleerde LSEC's meer dan 94% levensvatbaar en meer dan 90% zuiverheid hadden. Het LSEC-specifieke fenotype van de geïsoleerde cellen werd verder bevestigd met behulp van lichtmicroscopie en scanningelektronenmicroscopie. Geïsoleerde LSEC's werden gedurende zes uur in het volledige groeimedium gekweekt en met lichtmicroscopie onderzocht.
De witte pijlen in de SEM-afbeelding geven LSEC-fenestrae aan, wat een kenmerkend morfologisch kenmerk is van LSEC's. De kritieke stappen om volledige perfusie van een leverweefsel te garanderen, zijn de juiste positionering van kathetertapes, het vermijden van de introductie van lucht in de katheter en de optimale timing van collagenasevertering. Hoogwaardige LSEC verkregen met behulp van ons protocol zal de identificatie van het moleculaire mechanisme van LSEC-functie vergemakkelijken en zal ons begrip van hun rol in intercellulaire communicatie in de lever, in gezondheid en bij ziekte verbeteren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie demonstreert een protocol voor de efficiënte isolatie van primaire muisleversinusoïdale endotheelcellen (LSECs) door gebruik van levercollagénase perfusie en magnetische kraalselectie. De geïsoleerde LSECs behouden een hoge zuiverheid en levensvatbaarheid, waardoor ze geschikt zijn voor verschillende functionele en moleculaire studies.
Belangrijkste Studieonderdelen
Onderzoeksgebied
- Celbiologie
- Leverfysiologie
- Functie van endotheelcellen
Achtergrond
- LSECs spelen een cruciale rol in de leverbiologie en intercellulaire communicatie.
- Het isoleren van LSECs met hoge zuiverheid is essentieel voor het bestuderen van leverfunctie en bijbehorende ziekten.
- Dit protocol biedt een betrouwbare methode voor de isolatie van LSECs uit zowel gezonde als zieke muislevers.
Gebruikte Methoden
- Levercollagénase perfusie gevolgd door ultracentrifugatie met lage snelheid.
- Muislever als biologisch systeem.
- Flowcytometrie en rasterelektronenmicroscopie voor celkarakterisering.
Belangrijkste Resultaten
- Het protocol levert LSECs op met een zuiverheid van meer dan 90% en een levensvatbaarheid van meer dan 94%.
- Geïsoleerde LSECs behouden hun structuur en functie, geschikt voor downstream-analyses.
- Deze methode maakt geavanceerde studies mogelijk over leverfunctie en cellulaire interacties.
Conclusies
- Deze studie presenteert een effectieve methode voor het isoleren van LSECs uit muislever.
- Het protocol draagt aanzienlijk bij aan het begrijpen van de leverbiologie en ziektemechanismen.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
High-purity isolation and characterization of mouse liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) enables robust investigation of liver microenvironment mechanisms relevant to metabolic, inflammatory, and fibrotic disease models. This protocol supports predictive confidence in early discovery and target validation by providing standardized, reproducible access to primary LSECs from both healthy and disease states. The approach facilitates translational continuity for multi-omics and functional studies across the preclinical pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of LSEC-specific pathways implicated in liver disease mechanisms.
- Supports biological de-risking by providing functionally validated primary endothelial cells.
- Facilitates mechanistic studies of intercellular communication within the hepatic niche.
- Improves predictive confidence for target selection in metabolic and fibrotic disease models.
Screening & Assay Development
- Provides a validated source of primary LSECs for quantitative adhesion and permeability assays.
- Enables assay standardization and reproducibility through high-purity cell preparations.
- Supports downstream screening workflows requiring disease-relevant endothelial systems.
- Facilitates platform reuse for multi-omics and pathway-specific analyses.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant model systems for NAFLD and chronic liver injury studies.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation using primary cell-based assays.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing mechanistic insight into LSEC function.
- Facilitates biomarker discovery and validation in translational liver research.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by supplying high-quality LSECs for hypothesis testing, pathway analysis, and multi-omics profiling.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking and pathway clarification in liver disease models.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for functional and molecular assays.
- Analytics: Enables flow cytometry and electron microscopy-based characterization for comparative studies.
- Translational Research: Provides primary cell systems for biomarker alignment and disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for LSEC isolation across multiple research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in liver research.
- Operational Value: Standardizes LSEC isolation for reproducibility and scalability across studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust target validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of liver disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in perfusion techniques and primary cell isolation.
- Needs access to flow cytometry, electron microscopy, and magnetic bead separation infrastructure.
- Demands cross-team standardization for consistent cell purity and viability metrics.
- Adaptable to both healthy and disease model systems for broad research applicability.
- Dependent on precise perfusion and digestion timing for optimal cell yield and quality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:01
Preparation of Collagen-Coated Culture Dish or Plate
1:25
Equipment Setup
2:01
Surgical Procedure
4:50
Separation of Nonparenchymal Hepatic Cells and LSECs Purification
6:29
Results: Assessment of Purity and Morphology of Isolated LSECs
7:37
Conclusion
