Gebruik van Kristalviolet om visueel cytopathisch effectgebaseerd lezen voor virale titratie te verbeteren met behulp van TCID50-testen
12 februari 2022
Dit protocol toont een nauwkeurige en objectieve benadering om virale titraties te visualiseren met behulp van kristalviolet, door het te vergelijken met optische microscopie en immunocytochemische kleuring.
Het doel van dit protocol is om een virusvoorraadtitratie te produceren en deze te visualiseren met behulp van kristalvioletkleuring. Om dat te doen, zal een algemene virale titratie worden aangetoond, gevolgd door de kleuring. Deze titratie wordt uitgevoerd in een 96-well plaat gedurende een periode van zeven dagen in een bioveiligheidskast binnen een bioveiligheidsniveau 2 laboratorium.
Om dit te doen, zal een 96-well plaat van de gewenste cellijn worden gezaaid met behulp van de overeenkomstige media en laten groeien tot confluent. De virusvoorraad wordt verdund met behulp van tienvoudige verdunningen, door 900 microliter media en 100 microliter virus te mengen, of de bijbehorende verdunning. Zorg ervoor dat u elke buis vortext om een goede menging van de media en het virus te garanderen en fouten in de verdunningen te voorkomen.
Schrijf de lay-out van uw bord in het lood en elke verdunning om te helpen tijdens het infectieproces. Vóór infectie, wassen met 200 microliter PBS. Voeg 50 microliter van uw entmateriaal toe in de bijbehorende putjes.
Incubeer vervolgens zeven dagen bij 37 graden celsius in een 5% CO2-incubator. Na de incubatie van zeven dagen, wassen met 200 microliter PBS. Fixeer de cellen door 50 microliter per put PFA toe te voegen bij 4% in PBS en incubaleer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
Was de cellen na de incubatie nogmaals tweemaal met 200 microliter PBS voorafgaand aan de toevoeging van 50 microliter per put kristalviolet in water en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Zuig ten slotte kristalviolet uit de putten en laat de platen optioneel twee tot vijf minuten aan de lucht drogen bij kamertemperatuur of was het met 200 microliter water om overmatige vlekken te verwijderen voordat u ze visualiseert. Als gevolg hiervan zullen negatieve cellen na het opnieuw kleuren worden gekleurd.
Positieve putten zullen worden opgeruimd. Deze informatie wordt gebruikt in een van de twee beschreven formules om uw uiteindelijke virale titer te berekenen. Toen de titer die met elke methode werd verkregen, werd vergeleken, bleek dat in de monocytochemie kleuring in sommige gevallen extra positieve putten kon detecteren in vergelijking met kristalviolet, en dat beide kleuringsmethoden ook meer positieve putten konden detecteren dan visuele evaluatie via microscopie.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol demonstreert een nauwkeurige methode voor het visualiseren van virale titraties met behulp van kristalvioletkleuring. Deze methode wordt vergeleken met optische microscopie en immunocytochemische kleuring.
Belangrijkste Onderdelen van de Studie
Wetenschappelijk gebied
- Virologie
- Celbiologie
- Laboratoriumtechnieken
Achtergrond
- Virale titratie is essentieel voor het kwantificeren van virusvoorraden.
- Kristalvioletkleuring biedt een visuele weergave van de virale aanwezigheid.
- Vergelijkende methoden omvatten optische microscopie en immunocytochemische kleuring.
- Correcte verdunningstechnieken zijn cruciaal voor accurate resultaten.
Doel van de studie
- Om een titratie van de virusvoorraad te produceren.
- Om de titratie te visualiseren met behulp van kristalvioletkleuring.
- Om de nauwkeurigheid van methoden voor virale kwantificering te waarborgen.
Gebruikte methoden
- Het uitplaten van een gewenste cellijn in een 96-wells plaat.
- Het uitvoeren van tienvoudige verdunningen van de virusstock.
- Het vortexen van elke verdunning voor een goede menging.
- Kleuring met kristalviolet na een incubatieperiode van zeven dagen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van virale titraties met behulp van kristalviolet.
- Vergelijking met andere kleuringsmethoden toonde consistentie aan.
- Nauwkeurige kwantificering van virale stocks is bereikt.
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor toekomstige studies.
Conclusies
- Kleuring met kristalviolet is een effectieve methode voor het visualiseren van virustiteringsmetingen.
- Het protocol verbetert de nauwkeurigheid van de viruskwantificering.
- Verdere studies kunnen voortbouwen op deze methode voor diverse toepassingen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Nauwkeurige virale titratie is essentieel voor antivirale screening en vaccinontwikkeling, waarbij inconsistente CPE-detectie de identificatie van lead-verbindingen en go/no-go-beslissingen in gevaar kan brengen. Kristalvioletkleuring biedt een kosteneffectief, reproduceerbaar alternatief voor immunocytochemische kleuring, wat de standaardisatie van assays verbetert en de variabiliteit in vroege discovery-workflows vermindert. Dit ondersteunt het voorspellende vertrouwen in beoordelingen van antivirale effectiviteit en maakt schaalbare high-throughput screening op basis van TCID50 mogelijk voor CPE-vormende virussen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt objectieve kwantificering van virale infectiviteit mogelijk, waardoor de afhankelijkheid van subjectieve microscopie wordt verminderd en mechanistische risicoanalyse van antivirale targets wordt ondersteund.
- Operationele waarde: Biedt een snelle, goedkope kleuringsmethode die de doorvoersnelheid en reproduceerbaarheid van assays bij de validatie van antivirale hits verhoogt.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert heldere, kwantificeerbare eindpunten voor TCID50-assays, waardoor de signaal-ruisverhouding in screeningscampagnes voor verbindingen wordt verbeterd.
- Operationele waarde: Elimineert de noodzaak van dure ICC-reagentia, waardoor de kosten per assay worden verlaagd en een bredere toepassing op antivirale ontdekkingsplatforms mogelijk wordt.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Levert consistente metingen van de virale titer over verschillende studies heen, wat betrouwbare dosis-responsmodellering ondersteunt in preklinische werkzaamheidsstudies.
- Operationele waarde: Faciliteert cross-lab standaardisatie van de bereiding van virale stocks, waardoor de inter-experimentele variabiliteit in IND-ondersteunende studies wordt verminderd.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode past binnen het continuüm van antivirale ontdekking, van vroege hit-bevestiging tot lead-optimalisatie, waarbij nauwkeurige virustitratie informatie verschaft voor structuur-activiteitsrelaties en resistentieprofielering.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door reproduceerbare virale challenge-modellen te bieden voor studies naar het werkingsmechanisme.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantificeerbare resultaten die essentieel zijn voor de hit-to-lead-progressie in antivirale screeningcascades.
- Analytics: Maakt een nauwkeurige berekening van TCID50-waarden mogelijk, waardoor de potentie van verbindingen over verschillende experimentele condities nauwkeurig kan worden vergeleken.
- Translationeel onderzoek: Waarborgt de continuïteit van in vitro antivirale screening naar in vivo challenge-modellen door consistente kwantificering van de virale stocks.
- Enterprise Reuse: Vertegenwoordigt een schaalbare, kostenefficiënte capaciteit die toepasbaar is op meerdere virale targets en therapeutische gebieden.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen in antivirale effectiviteit door het aantal fout-negatieven bij visuele CPE-beoordeling te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van TCID50-assays door vereenvoudigde, gestandaardiseerde kleuring.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie in antivirale programma's door assaykosten te verlagen zonder in te boeten op datakwaliteit.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen voor voortgang door betrouwbare virale titergegevens te leveren voor go/no-go-criteria.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist een basisopleiding in de virologie en aseptische technieken voor de veilige omgang met virussen in BSL-2-omgevingen.
- Afhankelijk van standaard laboratoriumapparatuur, waaronder incubatoren, centrifuges en platenlezers voor optionele kwantificering.
- Vereist overeenstemming tussen teams over de kleuringsduur en wasprotocollen om reproduceerbaarheid tussen laboratoria te waarborgen.
- Toepasbaar op adherente cellijnen die CPE-vorming ondersteunen; optimalisatie kan nodig zijn voor niet-adherente of virussen die geen CPE induceren.
- Beperkt tot virussen die een detecteerbaar cytopathisch effect induceren; niet geschikt voor niet-cytopathische of persistente infectiemodellen zonder aanpassing.
