Directe en indirecte kweekmethoden voor het bestuderen van biologisch afbreekbare implantaatmaterialen in vitro

Directe en indirecte kweekmethoden voor het bestuderen van biologisch afbreekbare implantaatmaterialen in vitro. In de afgelopen decennia zijn biologisch afbreekbare materialen uitgebreid onderzocht voor biomedische toepassingen, zoals orthopedische, tandheelkundige en craniale maxillofaciale implantaten. om de biologisch afbreekbare materialen voor biomedische toepassingen te screenen, is het noodzakelijk om deze materialen te evalueren in termen van in vitro celresponsen, cytocompatibiliteit en cytotoxiciteit.

Normen in de International Organization for Standardization zijn op grote schaal gebruikt bij de evaluaties van biomaterialen. De meeste ISO-normen zijn echter oorspronkelijk vastgesteld om de stijltoxiciteit van niet-afbreekbare materialen te beoordelen, waardoor een beperkte waarde wordt geboden voor het screenen van biologisch afbreekbare materialen. In deze video zullen we drie verschillende kweekmethoden introduceren en bespreken, namelijk de directe kweekmethode, de directe blootstellingscultuurmethode en de blootstellingscultuurmethode voor het evalueren van de in vitro cytocompatibiliteit van biologisch afbreekbare implantaatmaterialen.

Concreet evalueert de directe kweekmethode de interacties tussen nieuw gezaaide cellen en de implantaten. Directe blootstellingscultuur bootst de interacties tussen de gevestigde cellen in het lichaam en de implantaten na. Blootstellingscultuur kenmerkt de interacties tussen gevestigde cellen en de implantaten wanneer ze niet in direct contact met elkaar zijn, maar in dezelfde omgeving waar de materialen afbreken.

Deze video geeft voorbeelden van het gebruik van deze drie kweekmethoden voor het bestuderen van de in vitro cytocompatibiliteit van biologisch afbreekbare implantaatmaterialen en hun interacties met van beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen. De in vitro methoden die in deze video worden beschreven, bootsen verschillende scenario's van de in vivo omgeving na, waardoor de toepasbaarheid en relevantie van de in vitro cytocompatibiliteitstests van verschillende materialen voor verschillende biomedische toepassingen wordt verbreed. We volgen een protocol dat is goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Community aan de Universiteit van Californië in Riverside voor het oogsten van cellen en weefsels.

Celkweekvoorbereiding. De drie kweekmethoden die in deze video worden beschreven, zijn algemeen toepasbaar voor verschillende celtypen die aanhangen. Hier zullen BMSC's geoogst van rattenspenen worden geïntroduceerd als voorbeeld voor celkweekpreparaat Het oogsten van van beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen van rattenspenen.

Het schematische diagram in deze figuur toont de stappen om BMSC's te oogsten van speenvogels. Verwijder de huid en spieren en bindweefsels om het dijbeen uit de geëuthanaseerde rat te ontleden. Plaats de femorale botten in een conische buis van 15 ml met celkweekmedia.

Plaats de conische buizen op ijs tot het moment van het uitvoeren van celextractie. Breng de botten over naar een petrischaaltje in de biologische veiligheidskast. Snijd de uiteinden van het bot met een chirurgisch mes en spoel het beenmerg in een conische buis van 50 ml door de beenmergholte te wassen met celkweekmedia met behulp van een spuit met de naald van 25 1/2 gauge.

Filter de celsuspensie met behulp van een filter van 70 micrometer, gevolgd door centrifugering bij 126 keer de zwaartekracht gedurende vijf minuten om de celkorrels uit bovennatuurlijke media te halen en aan te vullen met 10 ml verse media. Pipetteer voorzichtig op en neer om de cellen opnieuw te suspenderen met behulp van een serologische pipet van 10 ml. Pipetteer de suspensie direct aan de binnenkant van een T-75 kolf en voeg media toe om het volume tot 25 milliliter te brengen.

Kweek de cellen in een incubator in een standaard steriele celkweekomgeving van 37 graden Celsius, bevochtigde atmosfeer met 5% koolstofdioxide en 95% lucht. Spoel na drie tot zeven dagen de niet-hechtende cellen weg door de oude media te aspirineren en aan te vullen met verse media. Ga door met het kweken en voeden van de cellen met verse media totdat ze klaar zijn voor celpassage, bevriezing of gebruik in een experiment.

Monstervoorbereiding en sterilisatie. Steriliseer of desinfecteer alle monsters vóór de celkweek. Sterilisatie- of desinfectiemethoden voor verschillende monstertypen variëren afhankelijk van de verschillende eigenschappen van de materialen.

Gebruik over het algemeen ultraviolette straling om biologisch afbreekbare metalen te desinfecteren voor in vitro studies. Celkweekmethoden. Het schematische diagram in deze figuur toont de stappen van de directe kweekmethode.

In deze video werden BMSC's gekweekt op een van magnesium afgeleide plaat die in de putten van een met 12-putjes weefselkweek behandelde plaat werd geplaatst als een voorbeeld om de kweekmethode te illustreren. Gebruik een 90% confluentkolf om de celconcentratie in de celsuspensie te bepalen met behulp van een hemocytometer. Verdun de celsuspensie met verse media tot een voorgeschreven celconcentratie die nodig is voor het celonderzoek in vitro.

Plaats de monsters in het midden van de 12-well weefselkweekplaten. Spoel de kweekplaten achtereenvolgens met 2 ml PBS en 2 ml DMEM om de osmotische druk onder steriele omstandigheden te kalibreren. Voeg 3 ml van de verdunde celsuspensie toe aan elke put aan de monsters van belang.

Kweek de cellen in een incubator onder standaard celkweekomstandigheden gedurende 24 uur. Het schematische diagram in misvorming toont de stappen van de directe blootstellingscultuur. Bereid de celsuspensie voor met de vereiste concentraties cellen op basis van het experimentele ontwerp voor verschillende celtypen en beoogde toepassingen.

Spoel de kweekplaten achtereenvolgens met 2 ml PBS en 2 ml DMEM om de osmotische druk onder steriele omstandigheden te kalibreren. Voeg 3 ml van de verdunde celsuspensie toe aan elk putje. Kweek de cellen in de bevochtigde incubator onder standaard celkweekomstandigheden gedurende 24 uur of totdat de cellen 50% tot 80% confluentie bereiken.

Na 24 uur spoelen de cellen in de putplaat met PBS met behulp van een pipet om zwevende dode cellen te verwijderen. Plaats de gedesinfecteerde of gesteriliseerde monsters direct op de aangehechte cellen. Voeg 3 ml verse media toe aan elke put.

Kweek de cellen onder standaard celkweekomstandigheden gedurende nog eens 24 uur. Het schematische diagram in deze figuur toont de stappen van de belichtingscultuurmethode. De eerste stappen voor celvoorbereiding zijn hetzelfde als de kweek van directe blootstelling.

Plaats daarna de monsters in de putinzetstukken met een membraanporiëngrootte van 0,4 micrometer en plaats de putinzetstukken met de monsters in elke put met de cellen. Kweek de cellen onder standaard celkweekomstandigheden gedurende nog eens 24 uur. Postculture karakterisering van cellen.

Voor directe kweek en directe blootstellingscultuur, fix, kleuring, beeld en analyseer de cellen die zich hechten aan zowel putplaten als monsters. Analyseer voor blootstellingscultuur de cellen die zich aan de putplaten hebben gehecht. Verzamel de postcultuurmedia uit elke put in een overeenkomstige conische buis van 15 ml voor verdere analyse.

Verzamel alle monsters na de kweek voor verdere analyse. Spoel de cellen die zich hechten op zowel monsters als putplaten drie keer met PBS. Voeg 1 ml 4% paraformaldehyde toe aan elke putplaat.

Plaats het deksel terug op de putplaat en laat de PFA 20 minuten reageren. Na 20 minuten zuigt u de PFA op en doseert u deze in een afvalfles. Spoel de putplaat drie keer af met PBS om de PFA te verwijderen en breng het afval over naar de afvalfles.

Bereid de werkvoorraden van de kleuringsmiddelen voor Volgens de instructies van de fabrikant. Voeg 200 tot 400 microliter verdund Alexa Fluor 488 falloïdinekleurmiddel toe aan elke put om de cellen op de putplaat en het monster te bedekken. Wikkel de putplaat in aluminiumfolie om blootstelling aan licht te voorkomen en laat de Alexa Fluor 488 Phalloidin gedurende 20 minuten reageren bij kamertemperatuur.

Verzamel het Alexa Fluor 488 falloïdine kleurmiddel en doseer het in de bijbehorende afvalfles. Spoel de wandplaten drie keer met PBS om de overtollige Alexa Fluor 488 Phalloidin te verwijderen en de gebruikte PBS in de bijbehorende afvalfles te doseren. Voeg 200 tot 400 microliter verdunde DAPI toe aan elke put om de cellen in de put en op het monster te bedekken.

Wikkel de putplaat in aluminiumfolie en laat de DAPI vijf minuten reageren bij kamertemperatuur. Spoel de putplaat driemaal af met PBS en doseer de gebruikte PBS in de bijbehorende afvalfles. Stel na het kleuren de cellen in beeld met behulp van een fluorescentiemicroscoop.

Maak waar mogelijk fasecontrastbeelden van cellen naast fluorescentiebeelden. Stel de cellen op de biologisch afbreekbare monsters zo snel mogelijk of onmiddellijk na het kleuren af om mogelijke veranderingen veroorzaakt door de voortdurende afbraak van monsters te voorkomen of te verminderen. Voor directe kweek en directe blootstellingscultuur, beeld en evalueer twee soorten cellen.

Eén, de cellen op de monsters in direct contact met de monsters, en twee, de cellen hechtten zich op de putplaat rond de monsters in direct contact met de monsters zoals weergegeven in de figuur. Gebruik voor belichtingscultuur, zoals hier weergegeven, de afbeeldingsgids bij het maken van de fluorescentiebeelden van cellen om te bepalen of de reactie van de cel anders zou zijn als reactie op de dynamische degradatiegradiënt van de monsters. Beeld en analyseert cellen die zich bevinden in het gebied binnen de binnenste ring, op 3,5 mm afstand van het midden, en de buitenste ring, die 7 mm van het centrum afzonderlijk verwijderd is.

Neem voor elk monster, en terwijl u zich in de kweekplaten bevindt, willekeurig ten minste vijf afbeeldingen van elk interessegebied waar de cellen indirect contact of indirect contact met de monsters op een vooraf gedefinieerde afstand hebben. Kwantificeer uit alle celbeelden verkregen uit stap 4.3 de celmorfologie door het celspreidingsgebied en de beeldverhouding te meten voor beeldanalyse. Tel het aantal cellen in elk afbeeldingsgebied.

Bereken de celhechtingsdichtheid onder directe en indirecte contactomstandigheden als het aantal cellen per oppervlakte-eenheid. Postculturele analyses van media en steekproeven. Verzamel voor zelffixatie de postcultuurmedia.

Meet de pH-waarden van de postculture media in elke put onmiddellijk na het verzamelen met behulp van een vooraf gekalibreerde pH-meter. Na de vorige stap van de pH-meting, verzamel en verdun de media met behulp van een gewenste verdunningsfactor voor optimale metingen van ionconcentraties. Meet de concentraties van de interessante ionen in de postkweekmedia met behulp van een inductief gekoppelde plasma-optische emissiespectrometer afgekort als ICP-OES.

Na in vitro celstudie kunnen de biologisch afbreekbare monsters veranderen in afmeting, massa, oppervlaktemorfologie, microstructuur en samenstelling. Postculture-analyse van monsters helpt het afbraakmechanisme van monsters te begrijpen. Maak na de celkweek de foto's van de monsters om mogelijke veranderingen in monsterdimensie, kleur, morfologie en andere zichtbare kenmerken te laten zien.

Droog of droog de postcultuurmonsters en meet de massa, dimensie en volume van het monster om eventuele veranderingen in massa, dimensie en volume te kwantificeren. Gebruik een scanning elektronenmicroscoop om de microstructuur en morfologie van de monsters te karakteriseren. Gebruik energiedispersieve röntgenspectroscopie en röntgendefraction om de samenstelling en fase van de afbraakproducten op de monsters te karakteriseren.

Gebruik FTIR of ATR om de chemische binding op monsteroppervlakken te detecteren. Representatieve resultaten. Hier toont de figuur de representatieve fluorescentiebeelden van beenmerg afgeleide stamcellen onder directe en indirecte contactomstandigheden met behulp van verschillende kweekmethoden.

Deze figuur toont de voorbeeldgegevens voor gekwantificeerde celadhesiedichtheid. Zoals te zien is in figuur A, hebben BMSC's in direct contact met de ZC21 in de 24-uurs directe blootstellingscultuur een significant grotere celadhesiedichtheid dan welke andere groep dan ook. Zoals te zien is in figuur B, is de BMSC-adhesiedichtheid in de indirecte contactconditie van de directe blootstellingscultuur significant hoger voor de ZC21-groep dan voor de magnesiumgroep.

Het toont echter geen significant verschil in vergelijking met de T64 en cellen alleen controlegroepen. Hier toont figuur A de pH-waarde van postculturele media na de directe blootstellingscultuur en directe cultuur. Voor de directe blootstellingscultuur variëren de pH-waarden van media van 8,3 tot 8,4 voor alle monsters.

In de directe cultuur variëren de pH-waarden van media van 7,9 tot 8 tussen de groepen. Figuur B toont de magnesiumionenconcentratie in de postculturele media. In zowel de directe blootstellingscultuur als de directe kweek zijn hun magnesiumionconcentraties in de ZC21- en magnesiumgroepen significant hoger dan in alle andere controlegroepen.

Deze figuur toont de XRD-patronen voor ZSr41 en zuiver magnesium na een blootstellingscultuur van drie dagen. De kristallijne fasen van verschillende samenstellingen, zoals magnesium, zinkoxide en hydroxyapatiet werden waargenomen. Hier toont figuur A de overlay van SEM-afbeeldingen en EDX-kaarten van de oppervlakte-elementaire samenstelling voor magnesiumoxide-gecoat magnesium, en de controle van magnesiumsubstraten en glas na 24 uur directe kweek met BMSCs.

Figuur B toont de kwantitatieve oppervlakte-elementaire samenstelling van de monsteroppervlakken, wat wijst op verschillende afzettingen gevormd tijdens de celkweek. Conclusies. In deze video introduceerden we drie verschillende in vitro methoden voor het evalueren van de cytocompatibiliteit van biologisch afbreekbare implantaatmaterialen op basis van verschillende experimentele ontwerpen en beoogde toepassingen. De interacties tussen materialen en verschillende soorten cellen kunnen worden onderzocht via de directe kweekmethode, directe blootstellingscultuurmethode en blootstellingscultuurmethode.

Deze video heeft belangrijke in vitro methoden gepresenteerd om het effect van biologisch afbreekbare materialen samen met hun afbraakproducten op celgedrag te bestuderen voor een verscheidenheid aan medische implantaattoepassingen.