Name: Het bepalen van het basale energieverbruik en de capaciteit van thermogene adipocyten om energie te besteden aan zwaarlijvige muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Leer indirecte calorimetrie om het basale energieverbruik en de oxidatieve capaciteit van thermogene adipocyten in zwaarlijvige muizen te meten. Deze methode helpt onderzoekers obesitas en energiebalansmechanismen bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ML wordt gefinancierd door het Department of Medicine van UCLA, pilotsubsidies van P30 DK 41301 (UCLA: DDRC NIH) en P30 DK063491 (UCSD-UCLA DERC).

Alle experimenten werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Californië, Los Angeles (UCLA). Muizen kregen hun dieet en water ad libitum toegediend in de metabole kooi, gehuisvest in een temperatuurgecontroleerde omgeving (~ 21-22 of 30 ° C) met een licht / donkercyclus van 12 uur. 8 weken oude vrouwelijke muizen die gedurende 8 weken een vetrijk dieet of chow-dieet kregen, werden gebruikt voor deze studie.
1. Meting van de basale stofwisseling (BMR)
<ol><li>Meet het totale lichaamsgewicht van de muis met behulp van een weegschaal met een nauwkeurigheid in het bereik van 0,1 g. OPMERKING: Dit moet worden gedaan voordat de muizen in metabole kooien worden gehuisvest en na de 2-3 dagen van de acclimatisatieperiode aan de metabole kooien.</li>
	<li>Meet de lichaamssamenstelling, inclusief vet en vetvrije massa bij niet-verdoofde muizen, met behulp van een geschikt analysesysteem voor de lichaamssamenstelling (zie Tabel met materialen). OPMERKING: Deze metingen zijn nodig om het energieverbruik te bepalen en worden parallel aan metingen van het totale lichaamsgewicht uitgevoerd (stap 1.1).</li>
	<li>Stel de metabole kooien in en start de acclimatisatieperiode. OPMERKING: Het metabole kooisysteem omvat een behuizing waarmee de gebruiker de staltemperatuur en het licht van 12 kooien kan regelen (figuur 1A, B). Elke kooi heeft een waterfles, een feeder en een rooster (figuur 1C). Het raster scheidt de muis van de bodem van de kooi, waardoor uitwerpselen kunnen worden verzameld. Zodra de kooi op elke vooraf bepaalde ruimte is geïnstalleerd, bevat een deksel dat de kooi afsluit de sleuf voor waterflessen, de bemonsteringslucht van de buis, het luchtstroomsysteem en de fysieke activiteitssensor (figuur 1D).<ol>
<li>Schakel de temperatuurbehuizing, het luchtstroomsysteem en de computer 2 uur voordat u met de test begint in.</li>
		<li>Open na 2 uur de software die de behuizing bestuurt (zie Materiaaltabel) en de luchtstroom en laat de software de communicatie van de computer met de apparatuur testen. OPMERKING: Oxymax-software werd gebruikt voor het huidige werk.</li>
		<li>Zodra de communicatie tot stand is gebracht, klikt u op Bestand, vervolgens op Experimentconfiguratie openen (afbeelding 2A) en selecteert u de experimentconfiguratie die vooraf is ontworpen door de leverancier (of is ingesteld op basis van een eerdere test).</li>
		<li>Klik op Experiment en klik vervolgens op Eigenschappen, waardoor het venster Experimenteigenschappen wordt geopend (Figuur 2B).</li>
		<li>Stel in het venster Eigenschappen de parameters van de omgevingsbehuizing in, inclusief de omgevingstemperatuur (21 °C) en de 12 uur lichtcycli. OPMERKING: Door de software open en draaiende te houden, kan er lucht in de kooien en de behuizing stromen om de geselecteerde temperatuur en lichtcycli te behouden. Zo kan het hele systeem meerdere dagen met muizen in de kooien werken, zelfs zonder zuurstof en CO2 te meten.
</li>
		<li>Klik op Experiment, klik vervolgens op Setup en het venster Experiment Setup wordt geopend, waar de parameters van elke metabole kooi worden gedefinieerd.</li>
		<li>Wijs elke muis-ID toe aan de individuele kooi waarin de muis zich bevindt (figuur 2C).</li>
		<li>Neem alleen de vetvrije massa of het totale lichaamsgewicht voor elke muis op als er geen verschillen in lichaamsgewicht tussen groepen worden waargenomen. OPMERKING: Het verkrijgen van ruwe waarden van zuurstofverbruik en energieverbruik vergemakkelijkt ANCOVA-analyses.</li>
		<li>Stel de luchtstroomsnelheid naar de metabole kooi in op 0,5-0,6 l/min.</li>
		<li>Selecteer in het venster Experiment instellen het pad en de naam voor het opslaan van het bestand. Selecteer de back-upmap (Afbeelding 2D).</li>
		<li>Voeg een vooraf gewogen hoeveelheid voedsel toe aan de feeders die ten minste de voedselinname gedurende 1 dag dekt. OPMERKING: Als de kooien geïntegreerde weegschalen hebben, kan het voedsel direct worden toegevoegd en de software zal het opnemen.</li>
		<li>Voeg de waterflessen toe. Controleer of de fles correct is afgesloten en niet lekt.</li>
		<li>Weeg 24 uur na het toevoegen van het voedsel het voedsel dat op de kooi is achtergebleven. OPMERKING: De grammen voedsel die worden toegevoegd minus de grammen voedsel die overblijven, meten de voedselinname.</li>
		<li>Start de zuurstof-, CO2- en activiteitsmetingen (stap 1.4.10) zodra de voedselinnamewaarden dezelfde zijn als die van muizen die in reguliere kooien zijn gehuisvest. OPMERKING: Hier is de acclimatisatieperiode (meestal 2-3 dagen) voltooid en kunnen de metingen van het energieverbruik beginnen.</li>
	</ol></li>
	<li>Indirecte calorimetrie en activiteitsmetingen om het energieverbruik te beoordelen<ol>
<li>Meet het lichaamsgewicht, vet en vetvrije massa van alle muizen voordat u met de metingen begint. OPMERKING: Dit zijn de waarden voor lichaamsgewicht en vetvrije massa die worden gebruikt om ANCOVA-analyses uit te voeren.</li>
		<li>Kalibreer de op O2 en CO2 Zirconia gebaseerde detector van het CLAMS-systeem (zie Materiaaltabel) met de aanbevolen zuurstofconcentratie; kalibreer de detector altijd opnieuw voordat u een nieuw experiment start.</li>
		<li>Gebruik een kalibratiegas van bekende samenstelling (20,50% zuurstof en 0,50% CO2). OPMERKING: Gasleveranciers verwijzen vaak naar dit gas als "Primaire standaardkwaliteit".</li>
		<li>Schakel in en zorg ervoor dat de uitgangsdruk van de tank 5-10 psi is.</li>
		<li>Open de software van het kalibratiehulpprogramma voor het kalibreren en testen van de gassensoren (figuur 2E). Klik op Experiment en vervolgens op Kalibreren.</li>
		<li>Druk op Start. Wacht vervolgens tot de sensoren zijn getest en tot de software de gebruiker vraagt om aan de knoppen van de gassensor te draaien (figuur 2F) totdat de waarde van de O2-identiteit 1 is (figuur 2G-H). Klik op Volgende wanneer de stap is voltooid. OPMERKING: Als het kalibratieprogramma alle huidige stappen uitvoert, gaat de kalibratie automatisch door naar de volgende stap wanneer de voortgangsbalk is gevuld.</li>
		<li>Controleer de kalibratieresultaten wanneer alle stappen zijn voltooid en de resultaten zijn gepresenteerd.</li>
		<li>Schakel het kalibratiegas uit.</li>
		<li>Verander voedsel en voeg voldoende voedsel toe voor een periode van 48-72 uur. OPMERKING: Hoewel kooien kunnen worden geopend tijdens de metingen van het energieverbruik om het lichaamsgewicht te controleren en het voedsel dagelijks te veranderen, kunnen muizen door deze manipulaties worden gestrest en gaan metingen verloren wanneer de kooien worden geopend. Daarom wordt aanbevolen om manipulatie tijdens de meetperiode te vermijden.</li>
		<li>Klik in de software op Experimenteren en vervolgens op Uitvoeren om de zuurstof-, CO2 - en activiteitsmetingen te starten (figuur 3A). OPMERKING: De uitvoering van de metingen kan in realtime worden gevolgd in een vak linksonder in de software (rode rechthoek, figuur 3B). De rode rechthoek in figuur 3B laat zien dat het systeem kooi #1 meet met interval #3, namelijk de 3e meting. Eén meting in één kooi kan ongeveer 1 min duren. Met 12 aangesloten kooien kan het zuurstofverbruik dus ongeveer elke 12 minuten worden gemeten. Continue metingen gedurende minimaal 48 uur worden aanbevolen.</li>
		<li>Stop het experiment door op Experiment en vervolgens op Stoppen (afbeelding 3C) te klikken.</li>
		<li>Open de kooien, weeg de muizen en het voedsel. Verzamel de ontlasting om het aantal calorieën en lipiden te berekenen dat wordt uitgescheiden gedurende de meetperiode van 48-72 uur. OPMERKING: Uitwerpselen kunnen worden bewaard bij -20 °C voor latere analyses. Deze kooien kunnen niet effectief worden gebruikt om urine op te vangen.</li>
		<li>Klik op Experimenten, vervolgens op Exporteren en exporteer alle onderwerpen als CSV-bestand (afbeelding 3D). OPMERKING: Om ANCOVA-analyses te vergemakkelijken, is het essentieel om ruwe zuurstofverbruik (VO2) en CO2-productie (VCO2) waarden te exporteren zonder te worden genormaliseerd door het lichaamsgewicht.</li>
	</ol></li>
	<li>Data-analyse en kwaliteitscontrole<ol>
<li>Gebruik in het geëxporteerde CSV-blad (Figuur 3D) (vanaf stap 1.4.13) de ruwe waarden van het zuurstofverbruik (VO2) en de CO2-productie (VCO2) gemeten elke 12 minuten in de periode van 2-3 dagen die automatisch door de software worden vermeld en een tijdstempel bevatten, namelijk het uur en de datum waarop ze zijn gemeten. OPMERKING: VO2 - en VCO2-waarden worden automatisch gecorrigeerd als de waarden van het lichaamsgewicht of de vetvrije massa worden toegevoegd.</li>
		<li>Gebruik in het geëxporteerde CSV-blad de onbewerkte waarden van de ademhalingsuitwisselingsratio (RER: VCO2/VO2) die automatisch worden berekend en door de software worden vermeld op basis van hun tijdstempel. OPMERKING: Waarden dicht bij 1 laten zien dat de muis voornamelijk koolhydraten oxideert, terwijl waarden dichter bij 0,7 aangeven dat de muis voornamelijk vet oxideert. RER boven 1 kan optreden tijdens anaerobe oefening, omdat het lichaam meer CO2 uitdrijft om de acidose veroorzaakt door lactaat te compenseren. RER hoger dan 1 kan duiden op stress. Het geëxporteerde CSV-bestand bevat ook de ruwe waarden van energieverbruik (EE) of warmteproductie in calorieën per minuut per muis, gemeten om de 12 minuten in de 2-3 dagen. Hier bevatten alle vermelde waarden een tijdstempel.</li>
		<li>Omdat er voor een ANCOVA één EE-waarden per muis nodig zijn, worden de EE-waarden gemiddeld geregistreerd tussen 09:00-16:00 voor de lichte (dag)fase en 19:00-04:00 voor de donkere (nacht) fase per muis en dag. OPMERKING: Dit kan handmatig worden gedaan met Excel of Graph Pad. Als u deze twee vensters selecteert, worden de gemiddelde gemiddelde van de tussenliggende, geleidelijke en onstabiele EE-waarden vermeden die zijn gekoppeld aan de licht-donkerfaseovergang.</li>
		<li>Bereken voor een periode van 48 uur het gemiddelde van de twee daglichtwaarden en de twee donkere fasewaarden per muis met Excel of Graph Pad.</li>
		<li>Als u de totale fysieke activiteit wilt kwantificeren, gebruikt u Excel of Graph Pad om de x-, y- en z-bundelbreuktellingen op te tellen die zijn gemeten in de metabole kooien en die voor elke muis in het CSV-bestand worden vermeld. OPMERKING: De totale activiteit x,y,z wordt berekend door eerst de gemiddelde waarde van elke X, Y, Z per muis en cyclus uit te voeren. Vervolgens wordt de som van elke gemiddelde X-, Y-, Z-waarden per muis en cyclus bepaald om de gegevens uit te zetten zoals in figuur 5E (zijnde het gemiddelde van 2 dagen).</li>
		<li>U kunt ook de gegevens weergeven die elke meetwaarde in de loop van de tijd weergeven, die curven genereren die de veranderingen in EE illustreren tijdens de overgang van lichte naar donkere cycli. OPMERKING: Raadpleeg het discussiegedeelte over hoe en wanneer ANCOVA-analyses moeten worden uitgevoerd en de verschillende formules die worden gebruikt om VO2, VCO2 en EE te berekenen, worden verstrekt in aanvullend bestand 1.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Meting van het vermogen van thermogene adipocyten om energie te verbruiken
<ol><li>Stel de metingen en muisbehandelingen in. Zie stap 1 voor nadere bijzonderheden over de experimentele preparaten om het zuurstofverbruik te controleren, aangezien de thermogene capaciteit in adipocyten indirect wordt bepaald door het zuurstofverbruik volgens stap 2.1.1-2.2.2. OPMERKING: Dit protocol vereist muisanesthesie en acute behandeling met de bèta-3-receptoragonist CL-316,243 (zie Tabel met materialen), wat een snelle beoordeling van de thermogene capaciteit van BA geeft.<ol>
<li>Voer een analyse van de lichaamssamenstelling uit en weeg de muizen. Schakel de CLAMS in, stel de temperatuur in op 30 °C (thermoneutraliteit) en wacht 2 uur tot het hele systeem is opgewarmd.</li>
		<li>Stel de rest van de testomstandigheden in, inclusief licht, wijs muis-ID toe aan elke kooi en voeg de lichaamsgewichtswaarde van elke muis in de overeenkomstige kooi toe als er geen verschil in lichaamsgewicht tussen groepen wordt waargenomen.</li>
		<li>Kalibreer de zuurstof/CO2-detector zoals in stap 1.4.2-1.4.7.</li>
		<li>Start het experiment in de software.</li>
		<li>Injecteer elke muis met pentobarbital (60-120 mg/kg) en plaats elke muis in de toegewezen metabole kooi (stap 2.1.2). OPMERKING: De dosis pentobarbital die nodig is om muizen te laten slapen bij thermoneutraliteit (30 °C) varieert met de muizenstam en het genotype. Het wordt aanbevolen om verschillende pentobarbitale doses van 50 tot 120 mg / kg te testen en degene te kiezen die de muis gedurende 2-3 uur bij 30 °C verdoofd houdt. Efficiënte anesthesie is essentieel om de bijdrage van fysieke activiteit aan het energieverbruik te verwijderen.</li>
		<li>Om anesthesie te garanderen, observeer muizen na pentobarbital-injectie totdat ze volledig in slaap zijn en hun verminderde zuurstofverbruik stabiel wordt.</li>
		<li>Wacht met het verkrijgen van ten minste 3 stabiele opeenvolgende zuurstofverbruikssnelheden voordat u CL-316.243 injecteert. OPMERKING: Bereid in afwachting van de stabilisatie van het zuurstofverbruik de spuiten voor met CL-316.243 voor elke muis (1 mg/kg).</li>
		<li>Open kooi #1 en injecteer CL-316.243 subcutaan onmiddellijk nadat één VO2 - en VCO2-meting plaatsvond in kooi #1. Breng de muis onmiddellijk na injectie terug naar kooi #1. OPMERKING: Metingen worden in realtime aangegeven in het gedeelte linksonder in de software (figuur 3B, rode rechthoek).</li>
		<li>Wacht tot kooi #2 is gemeten (figuur 3B, rode rechthoek) en ga vervolgens verder zoals in stap 2.1.8 voor kooi #2. OPMERKING: Door CL-316.243 onmiddellijk na een meting te injecteren, blijft de tijd constant tussen de injecties. Als er bijvoorbeeld 12 muizen/kooien lopen, met metingen die achtereenvolgens in individuele kooien worden verzameld en de verzameling 55 s per kooi duurt, moet u elke minuut één muis injecteren. Met deze injectiesnelheden vindt de eerste meting plaats na 12 minuten na injectie in alle 12 kooien.</li>
		<li>Ga door met de metingen van het energieverbruik totdat de energieverbruikswaarden plateau voor 5-6 opeenvolgende metingen, meestal 90-180 min na injectie. OPMERKING: Muizen konden tijdens de experimenten wakker worden uit de anesthesie. Deze muizen moeten uit de analyse worden verwijderd. Daarom zal het vooraf testen van pentobarbitaldoses de efficiëntie van de studies verhogen.</li>
		<li>Stop met de metingen van het energieverbruik, maar houd muizen in hun kooien op 30 °C, totdat ze wakker worden.</li>
		<li>Nadat muizen volledig wakker zijn, inspecteer je de gezondheid van de muizen en breng je ze terug naar hun oorspronkelijke kooien.</li>
		<li>Exporteer de gegevens van elke muis als een CSV-bestand met behulp van de apparatuursoftware, zoals beschreven in paragraaf 1.4.13.</li>
	</ol></li>
	<li>Data-analyse OPMERKING: De gegevensanalyse is uitgevoerd door Excel of Graphpad<ol>
<li>Plot de 3-5 opeenvolgende waarden van VO2, VCO2 en EE die stabiel en constant zijn in de loop van de tijd, omdat dit de waarden zijn die de stofwisseling vertegenwoordigen wanneer muizen volledig worden verdoofd.</li>
		<li>Plot vervolgens de eerste en de volgende opeenvolgende VO2-, VCO2- en EE-metingen die na injectie zijn verkregen. OPMERKING: De absolute waarden van EE en de vouwtoename van EE geïnduceerd door injectie duiden op ba thermogene functie7.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Rolfe, D. F., Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+energy+utilization+and+molecular+origin+of+standard+metabolic+rate+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals.</a> Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).</li>
<li>Heymsfield, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+energy+expenditure%3A+advances+in+organ-tissue+prediction+models%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+Reviews%22%5BJournal%5D)">Human energy expenditure: advances in organ-tissue prediction models.</a> Obesity Reviews. 19 (9), 1177-1188 (2018).</li>
<li>Kummitha, C. M., Kalhan, S. C., Saidel, G. M., Lai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relating+tissue%2Forgan+energy+expenditure+to+metabolic+fluxes+in+mouse+and+human%3A+experimental+data+integrated+with+mathematical+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Relating tissue/organ energy expenditure to metabolic fluxes in mouse and human: experimental data integrated with mathematical modeling.</a> Physiological Reports. 2 (9), 12159(2014).</li>
<li>Tschop, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+analysis+of+mouse+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A guide to analysis of mouse energy metabolism.</a> Nature. 9 (1), 57-63 (2011).</li>
<li>Mina, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CalR%3A+A+Web-Based+Analysis+Tool+for+Indirect+Calorimetry+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">CalR: A Web-Based Analysis Tool for Indirect Calorimetry Experiments.</a> Cell Metabolism. 28 (4), 656-666 (2018).</li>
<li>Shum, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCB10+exports+mitochondrial+biliverdin%2C+driving+metabolic+maladaptation+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">ABCB10 exports mitochondrial biliverdin, driving metabolic maladaptation in obesity.</a> Science Translational Medicine. 13 (594), (2021).</li>
<li>Assali, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NCLX+prevents+cell+death+during+adrenergic+activation+of+the+brown+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">NCLX prevents cell death during adrenergic activation of the brown adipose tissue.</a> Nature Communication. 11 (1), 3347(2020).</li>
<li>Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Special+Report%3A+The+1996+Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.</a> ILAR Journal. 38 (1), 41-48 (1997).</li>
<li>Schena, G., Caplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Everything+You+Always+Wanted+to+Know+about+beta3-AR+%2A+%28%2A+But+were+afraid+to+ask%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Everything You Always Wanted to Know about beta3-AR * (* But were afraid to ask).</a> Cells. 8 (4), 357(2019).</li>
<li>Granneman, J. G., Burnazi, M., Zhu, Z., Schwamb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((White+adipose+tissue+contributes+to+UCP1-independent+thermogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">White adipose tissue contributes to UCP1-independent thermogenesis.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 285 (6), 1230-1236 (2003).</li>
<li>Szentirmai, E., Kapas, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+brown+adipose+tissue+in+beta3-adrenergic+receptor+activation-induced+sleep%2C+metabolic+and+feeding+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The role of the brown adipose tissue in beta3-adrenergic receptor activation-induced sleep, metabolic and feeding responses.</a> Scientific Reports. 7 (1), 958(2017).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling bij dit protocolstuk. M.L. is mede-oprichter en consultant voor Enspire Bio LLC.

Indirecte calorimetrie wordt al jaren gebruikt om het energieverbruik van het hele lichaam te beoordelen4. Dit protocol dat hierin wordt beschreven, biedt een eenvoudige methode voor het meten van de basale stofwisseling en het bepalen van de BA-thermogene capaciteit in vivo met behulp van metabole kooien.
De hier beschreven indirecte calorimetriemethode bevestigt dat het delen van energieverbruikswaarden door lichaamsgewichtswaarden misleidend kan zijn. Zo kan...

Metabolisme kan worden gedefinieerd als de integratie van de biochemische reacties die verantwoordelijk zijn voor de opname, opslag, transformatie en afbraak van voedingsstoffen die cellen gebruiken om te groeien en hun functies uit te voeren. Metabole reacties zetten de energie in voedingsstoffen om in een vorm die door cellen kan worden gebruikt om nieuwe moleculen te synthetiseren en werk uit te voeren. Deze biochemische reacties zijn inherent inefficiënt in het omzetten van deze energie in een bruikbare vorm om het leven in stand te houden1. Een dergelijke inefficiëntie resulteert in energiedissipatie in de vorm van warmte, waarbij deze warmteproductie wordt gebruikt om de standaard metabolische snelheid (SMR) van een organisme te kwantificeren1. De standaardconditie werd klassiek gedefinieerd als warmteproductie die optreedt bij een wakkere maar rustende volwassene, zonder voedsel in te nemen of te verteren, bij thermoneutraliteit en zonder enige stress1. De basale metabolische snelheid (BMR) of basaal energieverbruik bij muizen wordt de SMR genoemd, maar bij personen die voedsel innemen en verteren onder milde thermische stress (omgevingstemperaturen 21-22 ° C)1. De uitdagingen en moeilijkheden van het direct meten van warmteproductie maakten indirecte calorimetrie, namelijk het berekenen van warmteproductie uit zuurstofverbruiksmetingen, tot de meest populaire benadering om de BMR te bepalen. Het berekenen van de BMR uit zuurstofverbruik is mogelijk omdat de oxidatie van voedingsstoffen door mitochondriën om ATP te synthetiseren verantwoordelijk is voor 72% van de totale zuurstofconsumptie in een organisme, waarbij 8% van het totale zuurstofverbruik ook in mitochondriën voorkomt, maar zonder ATP (ontkoppelde ademhaling) te genereren1. De meerderheid van de resterende 20% van de verbruikte zuurstof kan worden toegeschreven aan oxidatie van voedingsstoffen op andere subcellulaire locaties (peroxisomale vetzuuroxidatie), anabole processen en de vorming van reactieve zuurstofsoorten1. Zo stelde Lusk in 1907 een vergelijking op, gebaseerd op empirische metingen, die op grote schaal werd gebruikt om zuurstofverbruik en CO2-productie om te zetten in energiedissipatie als warmte. Bij mensen zijn de hersenen goed voor ~ 25% van de BMR, het bewegingsapparaat voor ~ 18,4%, de lever voor ~ 20%, het hart voor ~ 10% en het vetweefsel voor ~ 3-7% 2. Bij muizen is de weefselbijdrage aan BMR iets anders, waarbij de hersenen ~ 6,5% vertegenwoordigen, de skeletspieren ~ 13%, de lever ~ 52%, het hart ~ 3,7% en vetweefsel ~ 5% 3.
Opmerkelijk is dat de biochemische reacties die de BMR definiëren niet vastliggen en veranderen als reactie op verschillende behoeften, zoals extern werk (fysieke activiteit), ontwikkeling (weefselgroei), interne stress (tegengaan van infecties, verwondingen, weefselvernieuwing) en veranderingen in omgevingstemperatuur (koude verdediging)1. Sommige organismen rekruteren actief processen om warmte te genereren bij blootstelling aan kou, wat impliceert dat warmte geproduceerd door het metabolisme niet alleen een toevallig bijproduct is. In plaats daarvan selecteerde de evolutie regulerende mechanismen die specifiek de warmteproductie konden opwaarderen door de snelheid van metabole reacties te veranderen1. Deze zelfde zuurstofverbruiksmetingen kunnen dus worden gebruikt om de capaciteit van een organisme te bepalen om warmte te genereren als reactie op kou.
Twee belangrijke processen dragen bij aan de warmteontwikkeling bij blootstelling aan koude. De eerste is rillen, die warmte genereert door mitochondriale oxidatieve fosforylering en glycolyse in spieren te verhogen om het fysieke werk te dekken dat wordt gedaan door onvrijwillige spiercontractie. Daarom zal blootstelling aan koude het zuurstofverbruik in de spieren verhogen1. De tweede is niet-rillende thermogenese, die optreedt door een toename van het zuurstofverbruik in bruine en beige adipocyten (BA). Dissipatie van energie in warmte in BA wordt gemedieerd door het mitochondriale ontkoppelingseiwit 1 (UCP1), waardoor protonen opnieuw in de mitochondriale matrix kunnen komen, waardoor de mitochondriale protongradiënt afneemt. De dissipatie van de mitochondriale protongradiënt door UCP1 verhoogt de warmteproductie door de verhoging van de elektronenoverdracht en het zuurstofverbruik en de energie die vrijkomt door protondissipatie op zich zonder ATP (ontkoppeld) te genereren. Bovendien kan thermogene BA extra mechanismen rekruteren die het zuurstofverbruik verhogen zonder een grote dissipatie in de protongradiënt te veroorzaken, door nutteloze oxidatieve ATP-synthese- en consumptiecycli te activeren. De hier beschreven metabole kooien, namelijk het CLAMS-Oxymax systeem van Columbus Instruments, bieden de mogelijkheid om het energieverbruik bij verschillende omgevingstemperaturen te meten. Om de thermogene capaciteit van BA te bepalen met behulp van metingen van het zuurstofverbruik van het hele lichaam, moet men echter: (1) de bijdrage van rillingen en andere niet-BA metabolische processen aan het energieverbruik elimineren en (2) specifiek BA thermogene activiteit in vivo activeren. Zo beschrijft een tweede protocol hoe BA selectief in vivo kan worden geactiveerd met behulp van farmacologie bij verdoofde muizen bij thermoneutraliteit (30 ° C), waarbij anesthesie en thermoneutraliteit andere niet-BA thermogene processen (d.w.z. fysieke activiteit) beperken. De farmacologische strategie om BA te activeren is het behandelen van muizen met de β3-adrenerge receptoragonist CL-316.246. De reden is dat blootstelling aan koude een sympathische reactie bevordert die noradrenaline vrijgeeft om β-adrenerge receptoren in BA te activeren, die UCP1 en vetoxidatie activeert. Bovendien is β3-adrenerge receptorexpressie sterk verrijkt in vetweefsel bij muizen.

<table><tbody><tr><td>CLAMS-Oxymax System</td><td>Columbus Instruments</td><td>CLAMS-center feeder-ENC</td><td>Inclusief milieubehuizing en zirkoniumzuurstofsensor</td></tr><tr><td>Desktop PC met Oxymax Software</td><td>HP/Columbus</td><td>N/A</td><td>PC moet apart worden aangeschaft</td></tr><tr><td>Drierite kan (calciumsulfaat met cobaltchloride-indicator)</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-116681</td><td>Nodig om het gas dat de zuurstofsensor binnenkomt te drogen, vocht kan de sensor beschadigen</td></tr><tr><td>NMR voor lichaamssamenstelling</td><td>Echo-MRI</td><td>Echo-MRI 100</td><td>Meet spiermassa en vetmassa bij levende muizen. Het is noodzakelijk voor ANCOVA-analyses.</td></tr><tr><td>CL-316-243</td><td>Sigma</td><td>C5976</td><td>Geïnjecteerd in de muizen onderhuids om thermogenese te activeren</td></tr><tr><td>Hoog vetdieet</td><td>Research Diets</td><td>D12266B</td><td>Geboden aan de muizen voor en tijdens metingen</td></tr><tr><td>Pentobarbital/Nembutal</td><td>Apotheek bij DLAM</td><td>N/A</td><td>Anesthesie voor de muizen</td></tr><tr><td>Primaire standaardgas (tank en regelaar)</td><td>Praxair</td><td>NI CD5000O6P-K/PRS 2012-2331-590</td><td>20,50% zuurstof, 0,50% CO2 gebalanceerd met stikstof gebruikt voor kalibratie</td></tr></tbody></table>

het bepalen van het basale energieverbruik en de capaciteit van thermogene adipocyten om energie te besteden aan zwaarlijvige muizen

Determining Basal Energy Expenditure and the Capacity of Thermogenic Adipocytes to Expend Energy in Obese Mice

Energieverbruiksmetingen zijn nodig om te begrijpen hoe veranderingen in het metabolisme kunnen leiden tot obesitas. Basaal energieverbruik kan bij muizen worden bepaald door het zuurstofverbruik van het hele lichaam, CO2-productie en fysieke activiteit te meten met behulp van metabole kooien. Thermogene bruine/beige adipocyten (BA) dragen aanzienlijk bij aan het energieverbruik van knaagdieren, vooral bij lage omgevingstemperaturen. Hier worden metingen van basaal energieverbruik en totale BA-capaciteit om energie te besteden bij zwaarlijvige muizen beschreven in twee gedetailleerde protocollen: de eerste legt uit hoe de test moet worden opgezet om het basale energieverbruik te meten met behulp van analyse van covariantie (ANCOVA), een noodzakelijke analyse gezien het feit dat het energieverbruik samen varieert met de lichaamsmassa. Het tweede protocol beschrijft hoe de BA-energieverbruikscapaciteit in vivo bij muizen kan worden gemeten. Deze procedure omvat anesthesie, nodig om de uitgaven veroorzaakt door fysieke activiteit te beperken, gevolgd door de injectie van bèta3-adrenerge agonist, CL-316,243, die het energieverbruik in BA activeert. Deze twee protocollen en hun beperkingen worden voldoende gedetailleerd beschreven om een succesvol eerste experiment mogelijk te maken.

Figuur 4 toont VO2, VCO2, warmteproductie/energieverbruik (EE), respiratoire uitwisselingsratio (RER) en X, Y, Z fysieke activiteitswaarden verkregen met behulp van de metabole kooien van het CLAMS-systeem. De VO2 en VCO2 van het CLAMS-systeem is het gasvolume (ml) per minuut en kan al worden gedeeld door het lichaamsgewicht of de vetvrije massawaarden door deze gewichtswaarden in de CLAMS-software in te voeren voordat de metingen worden gestart. L...

Dit manuscript beschrijft een protocol om de basale stofwisseling en de oxidatieve capaciteit van thermogene adipocyten bij zwaarlijvige muizen te meten.

Het bepalen van het basale energieverbruik en de capaciteit van thermogene adipocyten om energie te besteden aan zwaarlijvige muizen

Energy expenditure measurements are necessary to understand how changes in metabolism can lead to obesity. Basal energy expenditure can be determined in ...

Met dit protocol kan een onderzoeker bepalen of er verschillen zijn in de energetische balans van muizen, wat kan helpen bij het identificeren van de fysiologische processen die verantwoordelijk zijn voor een verandering in lichaamsgewicht. Het kan ook worden gebruikt om de capaciteit van bruin vet te bepalen om energie te verbruiken. Deze techniek kwantificeert de verbruikte zuurstof en de CO2 geproduceerd door een individuele muis in een gecontroleerde omgeving.Hiermee kunnen gebruikers het energieverbruik in deze individuele muis berekenen en bepalen of verschillende behandelingen of genetische manipulaties het energieverbruik kunnen veranderen. Open om te beginnen de software die de behuizing en de luchtstroom regelt en laat de software de communicatie van de computer met de apparatuur testen. Zodra de communicatie tot stand is gebracht, klikt u op bestand, opent u de experimentconfiguratie en selecteert u de experimentconfiguratie die vooraf is ontworpen door de leverancier of is ingesteld op basis van een eerdere test.Klik vervolgens op experiment en klik vervolgens op eigenschappen om het venster met experimenteigenschappen te openen. Stel in het eigenschappenvenster de parameters van de omgevingsbehuizing in, inclusief de omgevingstemperatuur en 12-uurs lichtcycli. Klik vervolgens op experiment, gevolgd door setup om het experiment setup-venster te openen waarin de parameters van elke metabole kooi zijn gedefinieerd.Voeg vervolgens een vooraf gewogen hoeveelheid voedsel toe aan de feeders in de metabole kooien met acht weken oude vrouwelijke muizen. Plaats ook de waterflessen en controleer of de flessen correct zijn afgesloten en niet lekken. Weeg na 24 uur het voedsel dat in de kooien achterblijft en weeg de muizen.Twee tot drie dagen nadat de muizen in het systeem zijn ondergebracht, start u met indirecte calorimetrie- en activiteitsmetingen. Kalibreer eerst de detector op basis van zuurstof en koolstofdioxide op basis van zirkonia van clams-systemen met behulp van een kalibratiegas van bekende samenstelling. Nadat u bent ingeschakeld en ervoor hebt gezorgd dat de uitvoerdruk van de tank tussen 5 en 10 pond per vierkante inch ligt, opent u de kalibratiesoftware voor het kalibreren en testen van de gassensoren.Klik op experiment, kalibreer en druk op start. Wacht tot de sensoren zijn getest en tot de software de gebruiker vraagt om aan de knoppen van de gassensor te draaien totdat de waarde van de zuurstofidentiteit één is. Klik op Volgende wanneer de stap is voltooid.Na het meten van het lichaamsgewicht en de samenstelling van de muizen, start u de zuurstof-, koolstofdioxide- en activiteitsmetingen door op experiment en run te klikken. Na minimaal 48 uur stopt u het experiment door op experiment te klikken en vervolgens te stoppen. Om de gegevens te exporteren, klikt u op bestand en exporteert en exporteert u vervolgens alle onderwerpen als een CSV-bestand.Tijdens de donkere fase hebben muizen een hoger zuurstofverbruik en koolstofdioxideproductie en hebben ze dus een hoger energieverbruik. Muizen op een regulier dieet en een gevoede toestand met voedselinname in de donkere cyclus worden gekenmerkt door ademhalingsuitwisselingsbereikverhoudingswaarden in de buurt van één, wat wijst op een voorkeur voor het gebruik van koolhydraten. Tijdens de lichte cyclus wanneer muizen meestal slapen en dus snel, is er een verschuiving naar vetoxidatie met RER-waarden die dichter bij 0,7 liggen.Dienovereenkomstig neemt de fysieke activiteit gemeten als XYZ-laserstraalbreuken toe tijdens de donkere fase en neemt af tijdens de lichtfase. Vetrijke dieetvoeding verhoogt het lichaamsgewicht en de vetmassa zonder de vetvrije massa te veranderen. Vetrijke dieetgevoede muizen aten meer kilocalorieën per dag, voornamelijk vanwege de hogere calorische dichtheid per gram voedsel.Fysieke activiteit is echter vergelijkbaar tussen de chow en vetrijke dieet gevoede muizen, zelfs tijdens de donkere periode. Lagere ademhalingscoëfficiëntverhoudingswaarden van vetrijke dieetgevoede muizen geven een voorkeur aan om vet te gebruiken als het primaire substraat voor oxidatie. Zuurstofverbruik, maar niet de productie van koolstofdioxide, neemt toe bij vetrijke dieetgevoede muizen, wat resulteert in een aanzienlijke toename van het energieverbruik per muis.Het energieverbruik wordt verhoogd door een bèta-3-agonistinjectie, voornamelijk als gevolg van de adrenerge activering van thermogene adipocyten, die het zuurstofverbruik, de kooldioxideproductie en dus het energieverbruik zelf verhoogt. Om het energieverbruik met de CLAMS te meten, moet de kalibratie worden voltooid en moet het lichaamsgewicht worden gemeten om de ANCOVA-analyse uit te voeren. Ook moet de voedselinname zowel in de aanpassingsperiode als tijdens de metingen worden gemeten.De aanpassingsperiode is voorbij wanneer muizen de initiële voedselinname en het lichaamsgewicht herstellen. Deze procedure kan ook worden gebruikt om de acute effecten van geneesmiddelen op de activiteit en het gedrag van muizen te testen. We gebruiken dit systeem ook in een gezamenlijke studie die aantoonde welke populatie neuronen gecontroleerd werd Deze techniek is essentieel voor het bestuderen van ziekten die verband houden met gewichtstoename en voor het identificeren van processen die de voorkeur voor voedingsstoffen regelen, evenals fysieke activiteit, thermogenese en energiebalans.

determining-basal-energy-expenditure-capacity-thermogenic-adipocytes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Werkwijze van functionele beeldvorming van muis bruin vetweefsel (BAT) beschreven waarin koud-gestimuleerde opname van 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG) in BAT niet-invasief gemeten met een gestandaardiseerd protocol micro-PET/CT. Deze methode is robuust en gevoelig zijn voor verschillen in BAT activiteiten in muismodellen detecteren.

Functionele Beeldvorming van bruin vet in Muizen met FDG micro-PET/CT

De hier gepresenteerde methode gebruikt 18F-Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) positron emissie tomografie / computertomografie (PET-CT) en vet-water gescheiden magnetische resonantie beeldvorming (MRI), elk afgetast na 2 uur blootstelling aan thermisch (24 ° C ) en koude omstandigheden (17 ° C) om bruin vetweefsel (BAT) bij volwassen proefpersonen kaart.

Human Brown VetWeefsel Depots automatisch gesegmenteerd op basis van Positron Emissie Tomografie / Computed Tomography en geregistreerde Magnetic Resonance Images

Dit protocol beschrijft de methode voor het bepalen van basale en forskolin gestimuleerde lipolyse in inguineuze vetkussens die worden verkregen uit normale Chow Diet (NCD) of met hoge vet dieet (HFD) ± capsaicine gevoed wild type muizen. Als een index voor lipolyse werd de glycerol-afgifte gemeten van ingewanden van adipose vetpads.

Meting van basale en forskolin-gestimuleerde lipolyse in buikvlies vetpads

Dit protocol beschrijft het gebruik van een lichaam samenstelling analyzer en metabole dierlijke controlesysteem te karakteriseren lichaamssamenstelling en metabole parameters in muizen. Een model van de obesitas geïnduceerd door vetrijke voeding wordt gebruikt als een voorbeeld voor de toepassing van deze technieken.

Lichaamssamenstelling en metabole kooien analyse in hoge vet Fed muizen

De differentiatie van wit en beige adipocytes uit vetweefsel vasculaire progenitoren beren mogelijkheden voor metabole verbetering in obesitas. We beschrijven protocollen voor een CD34 + CD31 + endothelial cel los van menselijk vet en voor een latere in vitro expansie en de differentiatie in wit en beige adipocytes. Verschillende downstream toepassingen worden besproken.

Isolatie, uitbreiding en Adipogenic inductie van CD34 + CD31 + endotheliale cellen van menselijke Omental en onderhuids vetweefsel

Dit artikel biedt drie eenvoudige en toegankelijke testen voor het beoordelen van het lipidemetabolisme bij muizen.

Beoordeling van de lipidenbehandelingscapaciteit van het hele lichaam bij muizen

Functionele beeldvorming en kwantificering van thermogene vetdepots bij muizen met behulp van een micro-PET / MR-beeldvormingsgebaseerde benadering.

Visualisatie en kwantificering van bruine en beige vetweefsels bij muizen met behulp van [18F] FDG Micro-PET / MR Imaging

Hier presenteren we een protocol om de fysiologische betekenis van de impact van bruin vetweefsel (BAT) activiteit op het menselijk metabolisme te kwantificeren. Dit wordt bereikt door koolhydraatbelasting en indirecte calorimetrie te combineren met metingen van supraclaviculaire temperatuurveranderingen. Deze nieuwe aanpak kan helpen bij het ontwikkelen van een farmacologisch doelwit voor BBT-thermogenese bij mensen.

Met behulp van een combinatie van indirecte calorimetrie, infraroodthermografie en bloedglucosespiegels om de thermogenese van bruin vetweefsel bij mensen te meten

Hier presenteren we een protocol voor het meten van bruine vetweefselactiviteit na een maaltijd bij mensen en proefdieren.

Infraroodthermografie voor de detectie van veranderingen in de activiteit van bruin vetweefsel

In dit protocol worden methoden geschetst die relevant zijn voor BAT-geoptimaliseerde arterioveneuze metabolomics met behulp van GC-MS in een muismodel. Deze methoden maken het mogelijk om waardevolle inzichten te verwerven in de uitwisseling van BBT-gemedieerde metabolieten op organismaal niveau.

Arterioveneuze metabolomics om in vivo metabolietuitwisseling in bruin vetweefsel te meten

Hier presenteren we een transplantatieprotocol voor wit en bruin vetweefsel dat een veelbelovende strategie biedt om subfertiliteit, obesitas en hyperglykemie om te keren en tegelijkertijd de nierfunctie bij diabetische en zwaarlijvige BTBR-muizen te verbeteren.

Witte en bruine vettransplantaten: een benadering om reproductieve, metabole en niertekorten te corrigeren bij zwarte en bruine brachyury (BTBR) zwaarlijvige muizen

Leer indirecte calorimetrie om het basale energieverbruik en de oxidatieve capaciteit van thermogene adipocyten in zwaarlijvige muizen te meten. Deze methode helpt onderzoekers obesitas en energiebalansmechanismen bestuderen.

Het bepalen van het basale energieverbruik en de capaciteit van thermogene adipocyten om energie te besteden aan zwaarlijvige muizen (Video) | JoVE Journal

Het bepalen van het basale energieverbruik en de capaciteit van thermogene adipocyten om energie te besteden aan zwaarlijvige muizen

Meer video's verkennen