Name: In situ Visualisatie van Axon-groei en groeikegeldynamiek in acute ex vivo embryonale hersenplakculturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Leer axon-groei en groeikegeldynamiek bestuderen in acute ex vivo embryonale hersenplakculturen van muizen. Deze methode maakt hoogresolutiebeeldvorming mogelijk voor inzicht in neurale ontwikkeling en plasticiteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Maria Eugenia Bernis bedanken voor het fotograferen van de procedures. We bedanken ook Emily Burnside, Emily Handley, Thorben Pietralla, Max Schelski en Sina Stern voor het lezen en bespreken van het manuscript. We zijn onze uitstekende technische assistenten, Jessica Gonyer, Blanca Randel en Anh-Tuan Pham dankbaar. We erkennen de waardevolle steun van de lichtmicroscoopfaciliteit en dierenfaciliteit van de DZNE. Dit werk werd ondersteund door Deutsche Forschungsgesellschaft (DFG), de International Foundation for Research in Paraplegia (IRP) en Wings for Life (tot F.B). F.B. is lid van de excellentiecluster ImmunoSensation2, de SFBs 1089 en 1158, en is ontvanger van de Roger De Spoelberchprijs.

<ol><li>Schelski, M., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+polarization%3A+From+spatiotemporal+signaling+to+cytoskeletal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Neuronal polarization: From spatiotemporal signaling to cytoskeletal dynamics.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 84, 11-28 (2017).</li>
<li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trip+of+the+tip%3A+understanding+the+growth+cone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The trip of the tip: understanding the growth cone machinery.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).</li>
<li>Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+axon+guidance%3A+are+we+nearly+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Understanding axon guidance: are we nearly there yet.</a> Development. 145 (10), (2018).</li>
<li>Bradke, F., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+local+actin+instability+in+axon+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The role of local actin instability in axon formation.</a> Science. 283 (5409), 1931-1934 (1999).</li>
<li>Neukirchen, D., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+linker+proteins+regulate+neuronal+polarization+through+microtubule+and+growth+cone+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic linker proteins regulate neuronal polarization through microtubule and growth cone dynamics.</a> Journal of Neuroscience. 31 (4), 1528-1538 (2011).</li>
<li>Witte, H., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+cytoskeleton+during+neuronal+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The role of the cytoskeleton during neuronal polarization.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18 (5), 479-487 (2008).</li>
<li>Witte, H., Neukirchen, D., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+stabilization+specifies+initial+neuronal+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule stabilization specifies initial neuronal polarization.</a> Journal of Cell Biology. 180 (3), 619-632 (2008).</li>
<li>Nichol, R. H., Catlett, T. S., Onesto, M. M., Hollender, D., Gomez, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+elasticity+regulates+cell-type+specific+RHOA+signaling+and+neuritogenesis+of+human+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Environmental elasticity regulates cell-type specific RHOA signaling and neuritogenesis of human neurons.</a> Stem Cell Reports. 13 (6), 1006-1021 (2019).</li>
<li>Santos, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+growth+of+CNS+neurons+in+three+dimensions+is+amoeboid+and+independent+of+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Axon growth of CNS neurons in three dimensions is amoeboid and independent of adhesions.</a> Cell Reports. 32 (3), 107907(2020).</li>
<li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+dynamics+and+nerve+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal dynamics and nerve growth.</a> Neuron. 1 (9), 761-772 (1988).</li>
<li>Lin, C. H., Thompson, C. A., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+reorganization+underlying+growth+cone+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal reorganization underlying growth cone motility.</a> Current Opinion in Neurobiology. 4 (5), 640-647 (1994).</li>
<li>Myers, J. P., Gomez, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+adhesion+kinase+promotes+integrin+adhesion+dynamics+necessary+for+chemotropic+turning+of+nerve+growth+cones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Focal adhesion kinase promotes integrin adhesion dynamics necessary for chemotropic turning of nerve growth cones.</a> Journal of Neuroscience. 31 (38), 13585-13595 (2011).</li>
<li>Turney, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor+stimulates+axon+outgrowth+through+negative+regulation+of+growth+cone+actomyosin+restraint+of+microtubule+advance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor stimulates axon outgrowth through negative regulation of growth cone actomyosin restraint of microtubule advance.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (3), 500-517 (2016).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+derived+from+radial+glial+cells+establish+radial+units+in+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex.</a> Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).</li>
<li>Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nature Neuroscience. 7 (2), 136-144 (2004).</li>
<li>Ferent, J., Zaidi, D., Francis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+control+of+radial+glia+proliferation+and+scaffolding+during+cortical+development+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular control of radial glia proliferation and scaffolding during cortical development and pathology.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 578341(2020).</li>
<li>Dent, E. W., Gupton, S. L., Gertler, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growth+cone+cytoskeleton+in+axon+outgrowth+and+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The growth cone cytoskeleton in axon outgrowth and guidance.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), (2011).</li>
<li>Dupraz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoA+controls+axon+extension+independent+of+specification+in+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">RhoA controls axon extension independent of specification in the developing brain.</a> Current Biology. 29 (22), 3874-3886 (2019).</li>
<li>Azzarelli, R., Oleari, R., Lettieri, A., Andre, V., Cariboni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro%2C+ex+vivo+and+in+vivo+techniques+to+study+neuronal+migration+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Sciences%22%5BJournal%5D)">In vitro, ex vivo and in vivo techniques to study neuronal migration in the developing cerebral cortex.</a> Brain Sciences. 7 (5), (2017).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Namba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pioneering+axons+regulate+neuronal+polarization+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pioneering axons regulate neuronal polarization in the developing cerebral cortex.</a> Neuron. 81 (4), 814-829 (2014).</li>
<li>Shah, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rap1+GTPases+are+master+regulators+of+neural+cell+polarity+in+the+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Rap1 GTPases are master regulators of neural cell polarity in the developing neocortex.</a> Cerebral Cortex. 27 (2), 1253-1269 (2017).</li>
<li>Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+confocal+imaging+of+migrating+neurons+in+organotypic+slice+culture+of+embryonic+mouse+brain+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Time-lapse confocal imaging of migrating neurons in organotypic slice culture of embryonic mouse brain using in utero electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), (2017).</li>
<li>de Anda, F. C., Meletis, K., Ge, X., Rei, D., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+motility+is+essential+for+initial+axon+formation+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Centrosome motility is essential for initial axon formation in the neocortex.</a> Journal of Neuroscience. 30 (31), 10391-10406 (2010).</li>
<li>Sakakibara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+centrosome+translocation+and+microtubule+organization+in+neocortical+neurons+during+distinct+modes+of+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Dynamics of centrosome translocation and microtubule organization in neocortical neurons during distinct modes of polarization.</a> Cerebral Cortex. 24 (5), 1301-1310 (2014).</li>
<li>Schatzle, P., Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+microtubule+dynamics+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Live imaging of microtubule dynamics in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Methods in Cell Biology. 131, 107-126 (2016).</li>
<li>Qu, X., Kumar, A., Bartolini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+microtubule+dynamics+at+excitatory+presynaptic+boutons+in+primary+hippocampal+neurons+and+acute+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Live imaging of microtubule dynamics at excitatory presynaptic boutons in primary hippocampal neurons and acute hippocampal slices.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100342(2021).</li>
<li>Tonnesen, J., Katona, G., Rozsa, B., Nagerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spine+neck+plasticity+regulates+compartmentalization+of+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spine neck plasticity regulates compartmentalization of synapses.</a> Nature Neuroscience. 17 (5), 678-685 (2014).</li>
<li>Buchsbaum, I. Y., Cappello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+migration+in+the+CNS+during+development+and+disease%3A+insights+from+in+vivo+and+in+vitro+models%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neuronal migration in the CNS during development and disease: insights from in vivo and in vitro models.</a> Development. 146 (1), (2019).</li>
<li>Rigby, M. J., Gomez, T. M., Puglielli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cell-axonal+growth+cone+interactions+in+neurodevelopment+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial cell-axonal growth cone interactions in neurodevelopment and regeneration.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 203(2020).</li>
<li>Barnes, A. P., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+axon-dendrite+polarity+in+developing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons.</a> Annual Review of Neuroscience. 32, 347-381 (2009).</li>
<li>Multiphoton Microscope Leica TCS SP8 MP. Microsystems. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/">http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/</a> (2021).</li>
<li>ZEISS Lattice Lightsheet 7. Zeiss. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.zeiss.com/microscopy/int/products/imaging-systems/lattice-lightsheet-7.html">http://www.zeiss.com/microscopy/int/products/imaging-systems/lattice-lightsheet-7.html</a> (2021).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hoe de groeikegels hun omgeving voelen en erop reageren om gelijktijdige axonuitbreiding en -geleiding te coördineren, is nog steeds een kwestie van discussie 3,18. Baanbrekende studies in 2D-substraten gaven een kijkje in de fundamentele moleculaire mechanismen die de krachten genereren die de groeikegeldynamiek aandrijven tijdens axonvorming, uitgroei en navigatie 2,10,11,12,19. Meer recent onthulden studies in 3D-matrices hoeveel invloed een derde dimensie heeft op het gedrag van de groeikegel en bijgevolg op axongroei 8,9. Niettemin moeten de ingewikkelde mechanismen die de dynamiek van de groeiconus in vivo instrueren, nog grondig worden onderzocht.
Bereiding van organotypische plakculturen uit IUE- of EUE-hersenen wordt op grote schaal gebruikt en goed gedocumenteerd. Het is een gouden standaard geworden waarmee wetenschappers inzicht kunnen krijgen in de ontwikkeling en het gedrag van neuronen in het levende hersenweefsel 20,21. Inderdaad, deze techniek is met succes gebruikt in combinatie met verschillende hoge resolutie beeldvormingstechnieken om specifieke moleculaire processen en morfologische gebeurtenissen in situ te visualiseren. Dergelijke studies omvatten, maar zijn niet beperkt tot axonvorming en -uitbreiding19,22, corticale neuronale migratie 19,22,23,24, centrosoomdynamica 25,26, microtubulidynamica27, evenals de functionele dynamica van pre- en postsynaptische compartimenten28,29.
Dit protocol pakt een kloof in de experimentele neurobiologie aan en visualiseert de groeikegeldynamiek van het ontwikkelen van corticale neuronen in situ, in ex vivo acute hersensegmentculturen en de hulpmiddelen om de verkregen gegevens te analyseren.
Acute brain slice culturen werden gebruikt om dit protocol vast te stellen omdat ze (1) met enige oefening, gemakkelijk te genereren zijn; (2) een toegankelijk systeem te presenteren voor het bestuderen van groeikegels die zijn ingebed in een quasi-volledig fysiologische omgeving, maar toch transparant genoeg om hoge-resolutie live-cell imaging mogelijk te maken; (3) kan worden uitgebreid voor het gebruik ervan met een groot aantal transgene muislijnen; (4) in combinatie met IUE of EUE bieden vrijwel onbeperkte mogelijkheden om moleculaire hulpmiddelen te leveren om de prestaties van groeikegels en axonen in vivo te evalueren onder verlies/ winst van functieregimes, samen met fluorescerende reporters en cytoskeletsondes.
Deze methodologie werd beschreven in de context van zowel EUE als IUE. Hoewel eue nog steeds een zeer betrouwbare methode is, resulteerde het in een verhoogde incidentie van hersenplakken met een ongeorganiseerd RG-netwerk in vergelijking met die verkregen met IUE als toedieningsmethode (figuur 4C). Verstoringen in de RG-array hebben een sterke invloed op neuronale migratie en het patroon van axon-elongatie30,31. Dit zijn belangrijke parameters die voorspellen waar axonen op een bepaald moment voor analyse kunnen worden gevonden en het type omgeving waarin ze navigeren. Hersenplakken met een aanzienlijk verstoord RG-netwerk hebben meestal een verminderde corticale neuronstratificatie. Dit produceert op zijn beurt axonen met chaotische trajecten. Daarom wordt sterk aanbevolen om de structurele integriteit van het RG-netwerk te controleren. Interessant is dat slechte structurele integriteit correleert met verhoogde leeftijd van de embryonale hersenen. Inderdaad, dergelijke effecten bij jongere E12.5-E13.5 embryo's werden meestal niet waargenomen19.
Het huidige protocol is grondig en eenvoudig. Toch zijn er een paar kritische stappen waarbij speciale zorg en aandacht moet worden besteed aan het verkrijgen van optimale resultaten. Deze zijn uitdrukkelijk vermeld in het protocol en omvatten (1) het afstemmen van de hoeveelheid DNA die in de elektroporatie wordt gebruikt om schaarse etikettering te krijgen; (2) het voorkomen van schade tijdens de extractie van hersenen; (3) het regelen van de temperatuur van de agarose tijdens het omhullen van de hersenen; (4) het oplossen van het ideale percentage agarose voor hersenen van een bepaalde leeftijd; en (5) selectie van fluoroforen, waarvan de ervaring volgt. Tijdens protocoloptimalisatie werden de prestaties van verschillende fluoroforen in live-cell in situ beeldvorming getest. Voor dit protocol is gekozen voor monomere GFP-varianten EGFP en NeonGreen voor de bereiding van de LifeAct- en Lyn-tagged plasmiden (figuur 5A,B). Daarnaast is de RFP-variant mScarlet getest en zeer geschikt bevonden voor deze opstelling (gegevens niet getoond). Multimeric tRFP (dimer) en ZsGreen (tetrameer) (Figuur 5C en Supplementary Video 1, rechts) werden ook getest. Deze snelvouwende superheldere fluoroforen worden aanbevolen wanneer de methode een snelle fluorescerende signaalgeneratie na DNA-afgifte vereist.
Een veel voorkomende praktijk bij het gebruik van plakculturen is om plakjes uit verschillende hersenen te gebruiken om controle en experimentele omstandigheden te testen. Dit is een inherente bron van ongewenste variabiliteit. Hier werd een expressiesysteem gebruikt dat onafhankelijke modificatie van naburige neuronen en de expressie van verslaggevers voor identificatie mogelijk maakt. Merk op dat er in deze demonstratie (figuur 5C) geen verschillen waren tussen neuronen die een van de fluoroforen tot expressie brachten. Een voorbeeld hiervan is echter dat een dergelijke plasmidemix in combinatie met een transgene muizenlijn met een Cre-gevoelig gen labelt met tRFP (Dre-gevoelige) neuronen die als wild type zijn gebleven. Daarentegen zal de ZsGreen (ook Cre-gevoelig) de gerecombineerde neuronen labelen. Vandaar dat groeikegels van de twee verschillende genotypen, en waarschijnlijk ook fenotypes, tegelijkertijd naast elkaar in hetzelfde hersensegment kunnen worden bestudeerd.
Lokalisatie van axonen en groeikegels voor analyse is een belangrijke overweging. Corticale neuronen polariseren terwijl ze radiaal migreren van de ventriculaire zone (VZ) naar de corticale plaat (CP). Tijdens dit proces vormen neuronen een leidend proces (een toekomstig dendriet) en een trailing-proces dat het axon zal worden, uiteindelijk samen met baanbrekende axonen in de tussenzone (IZ), waardoor axonkanalenworden gevormd 32. Daarom, om axonale groeikegels te vangen, werd beeldvorming gedaan op axonale vezels in de IZ, inclusief axonen die de CP verlaten en vroeg gegenereerde axonen die al geassocieerd zijn met axonale bundels; of uiteindelijk in vezels die de IZ doorkruisen en eronder uitstrekken (figuur 7).
Dit protocol maakt het mogelijk om superresolutiebeeldvorming uit te voeren van neuronen in organotypische plakjes. Historisch gezien was lichtverstrooiing een belangrijk probleem bij het afbeelden van dikke exemplaren. In de afgelopen twee decennia hebben uitgebreide ontwikkelingen in optische technologieën beeldvorming van dikke exemplaren mogelijk gemaakt. Hier werd een lange werkafstandsdoelstelling gebruikt om kleinere structuren beter te visualiseren, zoals groeikegels. Onvermijdelijk legt dit protocol geen meer gedetailleerde gebeurtenissen vast, zoals retrograde actinestroom of microtubulidynamica. De langeafstandsdoelstelling, die een lager numeriek diafragma (NA) vereist, bewaart informatie uit dikke plakken. Het was echter ook mogelijk om dit protocol aan te passen aan het gebruik met als doel een kortere werkafstand. Dit vereiste een soepele overdracht van plakjes naar een schaal met glazen bodem om de structurele integriteit te behouden. Het gebruik van deze methode resulteerde echter in een kortere overleving - ~ 15 uur - als gevolg van verlies van gasuitwisseling (gegevens niet weergegeven). In tegenstelling tot 2D-culturen bezetten groeikegels in 3D een groter volume en vereisen ze bewegingsartefactencompensatie in de z-as. Om de mogelijkheid om gedetailleerde gebeurtenissen in beeld te brengen te vergroten, moet moderne confocale technologie worden gebruikt. Daarom wordt aanbevolen om een snel scannende z-stack motor te gebruiken, zoals de z-Galvo die beschikbaar is op zeer gevoelige confocale microscopen33.
Van belang is dat dit protocol drie belangrijke beperkingen biedt. Ten eerste is het vaak een uitdaging om de expressieniveaus / het aantal tot expressie brengende cellen van een bepaald plasmide in vivo te controleren. Dit introduceert variabiliteit tussen alle plakjes, zelfs bij behoud van dezelfde plasmideconcentratie. Daarom moet de selectie van de regulerende elementen in de gebruikte expressievectoren met zorg worden bepaald. Ten tweede is het in beeld brengen van gedetailleerde gebeurtenissen met behulp van membraaninzetstukken momenteel niet haalbaar. Deze tweede beperking kan worden opgeheven met de methodologische actualiseringen die in de vorige alinea zijn voorgesteld. Ten slotte zijn groeikegels zeer lichtgevoelig en kunnen ze snel gefotobleekeerd raken. Daarom kan frequente beeldvorming van de groeikegels, gedurende slechts 5 minuten met behulp van laserscanmicroscopen, de groeikegels vaak instorten. In dit opzicht kunnen nieuwe ontwikkelingen in door lichtplaatmicroscopie gegenereerde apparaten worden aangepast voor langetermijnbeeldvorming van de hersenplakken34.
Protocollen van deze soort zijn bedoeld om nieuwe onderzoeksmogelijkheden te openen, waardoor een beter begrip mogelijk wordt van wat er nodig is voor een groeikegel om te lezen en te reageren op een complexe in vivo omgeving, en nog belangrijker, om de mechanica van dit geavanceerde samenspel te ontrafelen.

Neuronen zijn sterk gepolariseerde cellen die de basis computationele eenheid in het zenuwstelsel vertegenwoordigen. Ze ontvangen en zenden informatie uit die afhankelijk is van compartimentering van invoer- en uitvoerlocaties: dendrieten en axonen, respectievelijk1. Tijdens de ontwikkeling breiden axonen zich uit terwijl ze door een ongelooflijk complexe omgeving navigeren om hun bestemming te bereiken. Axonnavigatie wordt geleid door de groeikegel, een sensorische structuur aan de punt van het zich ontwikkelende axon. De groeikegel is verantwoordelijk voor het detecteren van omgevingssignalen en deze te vertalen in de dynamische ruimtelijke reorganisatie van zijn cytoskelet 2,3. De resulterende morfo-mechanische reacties instrueren de groeikegel om zich uit te breiden of terug te trekken van de triggering cue, wat leidt tot specifieke axonmanoeuvres.
Het huidige begrip van axonuitbreiding en groeikegeldynamica komt voort uit studies die axongroei evalueren over tweedimensionale (2D) substraten 2,4,5,6,7. Deze baanbrekende studies identificeerden een geavanceerd samenspel tussen groeikegels en groeisubstraten en onthulden opvallende verschillen afhankelijk van substraatkenmerken zoals kleefkracht en stijfheid 8,9. Onder leiding van deze inzichten werden extracellulaire omgevingssignalen verondersteld axongroei te dicteren, waarbij het cytoskelet van de groeikegel deze groei uitvoerde 2,10,11,12. Met name neuronen kunnen axonen uitbreiden in niet-klevende substraten (bijv. Poly-lysine, poly-ornithine)13. Bovendien kan substraatstijfheid de axongroeisnelheid beïnvloeden, onafhankelijk van cellijmcomplexen8. Daarom kan het bestuderen van groeikegeldynamica in 2D-substraten alleen niet nauwkeurig de balans van krachten modelleren die voortvloeien uit de interactie van axonale groeikegels met fysiologisch relevante driedimensionale (3D) omgevingen, zoals die in vivo worden gevonden.
Om de beperkingen van de 2D-assays te overwinnen, zijn axongroei en groeikegeldynamica bestudeerd in 3D-matrices 8,9. Deze matrices vormen een meer fysiologische context, maar maken het mogelijk om cel-intrinsieke mechanismen van axongroei te bestuderen. Het maakt groeikegelonderzoek op een eencellige manier mogelijk in verschillende omstandigheden en farmacologische behandelingen9. In dergelijke 3D-omgevingen vertoonden axonen een duidelijke cytoskeletdynamiek en groeiden ze sneller dan die waargenomen in 2D-gekweekte neuronen9. Deze elegante studies toonden de invloed aan van een extra dimensie op de reorganisatie van het groeikegelcytoskelet en bijgevolg op het gedrag ervan.
Ondanks de schijnbare voordelen van 3D-matrices ten opzichte van 2D-oppervlakken bij het ondersteunen van native-achtige neuronale ontwikkeling en axongroei, blijven ze een vereenvoudigde synthetische steiger die de complexiteit van de dynamiek die wordt waargenomen in weefsel van het centrale zenuwstelsel (CZS) niet kan weerspiegelen. Hier werd de levering van reporter plasmiden door ex utero en in utero elektroporatie gecombineerd met hersen organotypische slice cultuur en in situ live superresolutie beeldvorming om de dynamiek van de groeikegel binnen een fysiologische context te analyseren. Deze methodologie maakt visualisatie van ontwikkelende axonen mogelijk terwijl de 3-dimensionaliteit van in vivo omgevingen en de complexiteit van de fysisch-chemische samenstelling ervan worden ervaren. Ten slotte worden gebruiksvriendelijke procedures beschreven om axongroei en groeikegeldynamiek te meten met behulp van algemeen gelicentieerde en openbaar beschikbare software.

```html
<table>
<tbody>
<tr>
<td>Adson Forceps</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11006-12</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A21202</td>
<td>Geit Anti-Muis</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 647</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A21236</td>
<td>Geit Anti-Muis</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-Vimentin antibody</td>
<td>sigma-Aldrich</td>
<td>V2258-.2ML</td>
<td>Monoklonaal muis, clone LN-6, ascites vloeistof</td>
</tr>
<tr>
<td>B27 supplement</td>
<td>ThermoFisher Scientific</td>
<td>17504044</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Betadine</td>
<td>B. Braun</td>
<td>3864154</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Biozym Sieve GP Agarose</td>
<td>Biozyme</td>
<td>850080</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Braunol, Sprühflasche</td>
<td>B. Braun</td>
<td>3864073</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Buprenorphine (Temgesic)</td>
<td>GEHE Pharma</td>
<td>345928</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>DAPI</td>
<td>sigma-Aldrich</td>
<td>D9542</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>DMZ unevirsal electrode puller</td>
<td>Zeitz</td>
<td>NA</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Electric razor</td>
<td>Andes</td>
<td>NA</td>
<td>ProClip UltraEdge Super 2-Speed model</td>
</tr>
<tr>
<td>Enrofloxacin (Baytril)</td>
<td>Bayer</td>
<td>3543238</td>
<td>2,5% (wt/vol)</td>
</tr>
<tr>
<td>Eppendorf microloader pipette tips</td>
<td>FischerScientific</td>
<td>10289651</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Fast Green FCF</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F7252-5G</td>
<td>Kleurstofgehalte &ge; 85 %</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>ThermoFisher Scientific</td>
<td>10500064</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Fiji 2.1.0</td>
<td>NIH</td>
<td>NA</td>
<td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
</tr>
<tr>
<td>Fine Scissors</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14058-09</td>
<td>ToughCut/Straight/9cm</td>
</tr>
<tr>
<td>FluoroDish Cell Culture Dish</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>FD5040-100</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Fluoromount Aqueous Mounting Medium</td>
<td>sigma-Aldrich</td>
<td>F4680-25ML</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Glucose</td>
<td>MedPex</td>
<td>3705391</td>
<td>5%</td>
</tr>
<tr>
<td>GlutaMAX Supplement</td>
<td>ThermoFisher Scientific</td>
<td>35050061</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Glycine</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G8898</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>Life Technologies</td>
<td>14025092</td>
<td>calcium, magnesium, no phenol red</td>
</tr>
<tr>
<td>Horse serum</td>
<td>Pan-Biotech</td>
<td>P30-0711</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Imaris 9.7.2</td>
<td>Bitplane</td>
<td>NA</td>
<td>https://imaris.oxinst.com/products/imaris-for-neuroscientists</td>
</tr>
<tr>
<td>Isoflurane</td>
<td>Virbac</td>
<td>NA</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Isotonic saline solution</td>
<td>B. Braun</td>
<td>8609261</td>
<td>0.90%</td>
</tr>
<tr>
<td>Leica VT1200 S vibratome</td>
<td>Leica</td>
<td>14048142066</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>LSM 880 with Airyscan</td>
<td>Zeiss</td>
<td>NA</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Metacam</td>
<td>Venusberg Apotheke</td>
<td>8890217</td>
<td>5 mg/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Mice</td>
<td>Janvier Labs</td>
<td>NA</td>
<td>C57BL/6JRj</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro-Adson Forceps</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11018-12</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Micropipette Storage Jar</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>E210</td>
<td>&nbsp;16.16.27</td>
</tr>
<tr>
<td>Microsoft Excel</td>
<td>Microsoft</td>
<td>NA</td>
<td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/excel/cfq7ttc0k7dx?activetab=pivot:overviewtab</td>
</tr>
<tr>
<td>Millicell Cell Culture Insert</td>
<td>EMD Millipore</td>
<td>PICM0RG50</td>
<td>30&nbsp;mm, hydrofiel PTFE, 0.4&nbsp;&micro;m</td>
</tr>
<tr>
<td>Moria Perforated Spoons</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>10370-18</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Moria Spoon</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>10321-08</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Neurobasal Medium, minus phenol red</td>
<td>ThermoFisher Scientific</td>
<td>12348017</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Neuropan-2 supplement</td>
<td>Pan-Biotech</td>
<td>P07-11010</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Normal goat serum</td>
<td>Abcam</td>
<td>ab138478</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Olsen-Hegar Needle Holder with Scissors</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>12002-12</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>p-Tub-alpha-1-Dre</td>
<td>Addgene</td>
<td>133925</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>p-Tub-alpha-1-iCre</td>
<td>Addgene</td>
<td>133924</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP</td>
<td>Addgene</td>
<td>175437</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Parafilm</td>
<td>VWR</td>
<td>52858-000</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>sigma-Aldrich</td>
<td>P6148</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P3813-10PAK</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen</td>
<td>Addgene</td>
<td>175438</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen</td>
<td>Addgene</td>
<td>175257</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Penicillin-Streptomycin</td>
<td>ThermoFisher Scientific</td>
<td>15140122</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>PicoNozzle Kit v2</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>5430-ALL</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Platinum Tweezertrodes</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>45-0487</td>
<td>1 mm / 3 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>QIAGEN Maxi kit</td>
<td>QIAGEN</td>
<td>12162</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Reflex wound closure Clip</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>500344-10</td>
<td>7 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Sekundenkleber Pattex Mini Trio</td>
<td>Lyreco</td>
<td>4722659</td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>Square wave electroporation system ECM830</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>W3 45-0

in situ visualisatie van axon-groei en groeikegeldynamiek in acute ex vivo embryonale hersenplakculturen

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

Tijdens neuronale ontwikkeling navigeren axonen door de corticale omgeving om hun eindbestemming te bereiken en synaptische verbindingen tot stand te brengen. Groeikegels - de sensorische structuren aan de distale uiteinden van zich ontwikkelende axonen - voeren dit proces uit. Het bestuderen van de structuur en dynamiek van de groeikegel is cruciaal voor het begrijpen van axonale ontwikkeling en de interacties met het omliggende centrale zenuwstelsel (CZS) die het mogelijk maken om neurale circuits te vormen. Dit is essentieel bij het bedenken van methoden om axonen te re-integreren in neurale circuits na letsel in fundamenteel onderzoek en preklinische contexten. Tot nu toe is het algemene begrip van groeikegeldynamiek voornamelijk gebaseerd op studies van neuronen gekweekt in twee dimensies (2D). Hoewel ongetwijfeld fundamenteel voor de huidige kennis van de structurele dynamiek van de groeikegel en de reactie op stimuli, geven 2D-studies een verkeerde voorstelling van de fysiologische driedimensionale (3D) omgeving die neuronale groeikegels tegenkomen in intact CZS-weefsel. Meer recent werden collageengels gebruikt om enkele van deze beperkingen te overwinnen, waardoor het onderzoek naar neuronale ontwikkeling in 3D mogelijk werd. Zowel synthetische 2D- als 3D-omgevingen missen echter signaalsignalen in CNS-weefsel, die de uitbreiding en pathfinding van ontwikkelende axonen sturen. Dit protocol biedt een methode voor het bestuderen van axonen en groeikegels met behulp van organotypische hersenplakken, waar zich ontwikkelende axonen fysiologisch relevante fysische en chemische signalen tegenkomen. Door fijn afgestemde in utero en ex utero elektroporatie te combineren om fluorescerende reporters spaarzaam te leveren, samen met superresolutiemicroscopie, presenteert dit protocol een methodologische pijplijn voor de visualisatie van axon- en groeikegeldynamica in situ. Verder is een gedetailleerde toolkit-beschrijving van de analyse van langetermijn- en live-cell imaging-gegevens opgenomen.

Representatieve resultaten verkregen met de beschreven methodeworkflow worden weergegeven. E15.5-muizen werden gebruikt in de huidige demonstratie, hoewel dit protocol gemakkelijk kan worden aangepast aan vrijwel alle embryonale leeftijden, variërend van E11 tot eind E17. In dit protocol worden ofwel ex utero elektroporatie (EUE; Figuur 2A, 2C-I) of in utero-elektroporatie (IUE; Figuur 2B, C en 2J-Q) werden gebruikt om plasmiden af te leveren in de voorloperneuronen die de laterale ventrikels bekleden. Deze voorlopers zijn de bron van toekomstige corticale projecterende neuronen (CPN)15,16. Plasmidemixen werden bereid om schaarse neuronspecifieke expressie van membraangericht (Lyn)-mNeonGreen (figuur 1A) of LifeAct-enhanced (E)GFP (figuur 1B) te stimuleren om respectievelijk het algehele gedrag en de actinedynamiek in groeikegels te evalueren. Verder werd een plasmidemix opgenomen die gericht was op het labelen van individuele neuronen met turbo(t)-RFP of zoanthus sp. (Zs) groen fluorescerend eiwit (ZsGreen) (Figuur 1C). Dit vergemakkelijkt de monitoring van groeikegelgedrag van onafhankelijke naburige neuronen.
Hersendissectie van geëlektroporated embryo's is een cruciale stap die zorgvuldig moet worden uitgevoerd om plakjes van hoge kwaliteit te verkrijgen, met behoud van de inheemse hersenstructuur. Dissectie-instrumenten en vibratome werden vooraf bereid en zorgvuldig ethanol-gesteriliseerd (figuur 3A,B). Vervolgens werden de hoofden van geëlektroporated embryo's zorgvuldig ontleed en werden de hersenen geëxtraheerd. Hier wordt representatieve dissectie van hersenen van de embryo's die zijn onderworpen aan EUE op E15 (figuur 3C-F) en E12.5 (figuur 3G-J) weergegeven. Hersenen worden onmiddellijk ingepakt in een agarosematrix, gesneden en op PTFE-membraaninzetstukken in een onderste glazen schaal geplaatst voor incubatie (figuur 3K-M).
De gezondheidsstatus van hersenschijfjes is een belangrijk punt voor controle om betrouwbare resultaten te garanderen. Er werd dagelijks een visuele inspectie op eventuele verontreinigingen uitgevoerd. Bovendien, zodra de cultuur was voltooid, worden de hersenplakken gefixeerd en onderworpen aan immunohistochemie. Hier werd 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) gebruikt om de algehele cellulaire organisatie en vimentinekleuring te beheersen om gliale organisatie te onthullen; met name radiale glia (RG) steiger. Typisch, succesvol gekweekte hersenplakken afgeleid van IUE of EUE vertonen een normale cellulaire verdeling zoals onthuld door DAPI en een enigszins georganiseerde reeks RG met apicale georiënteerde pial-contactprocessen17 (figuur 4A, B respectievelijk). Af en toe worden duidelijke verstoringen in de RG-steigers in gekweekte hersenplakken waargenomen, vooral bij die afgeleid van EUE-elektroporatie (figuur 4C). Hersenplakken met extreem ongeorganiseerde RG-steiger vertonen een verminderde neuronale migratie en defecte axongroei (niet getoond). Daarom is het besturen van de RG-steiger een eenvoudige postkweekmethode om de gegevens te sorteren die zijn verkregen uit betrouwbare hersensegmenten.
Hersenplakken afgeleid van IUE of EUE met Lyn-mNeonGreen-expressing plasmidemix resulteren in vergelijkbare schaarse neuronetikettering. Een representatieve piramidale CPN die Lyn-mNeonGreen en het dynamische gedrag van zijn groeikegel uitdrukt, wordt als voorbeeld getoond (figuur 5A en aanvullende video 1, linksboven). Bovendien werden neuronen gelabeld met behulp van een plasmide dat een actinesonde tot expressie brengt om de actinedynamiek van axonale groeikegels in situ te analyseren (figuur 5B en aanvullende video 1, linksonder). In situ experimenten werden ook uitgevoerd met een dual-Cre/Dre fluorofoor-expresserend plasmide ontwerp (Figuur 1C en Aanvullende Video 1, rechts). tRFP of ZsGreen fluoroforen in dit plasmide kunnen specifiek en individueel worden geactiveerd door respectievelijk Dre- of Cre-recombinases in naburige neuronen (figuur 5C). Deze experimentele opstelling maakt zij-aan-zij analyse mogelijk van groeikegels van controleneuronen met naburige gemodificeerde neuronen (elk gegeven verlies of winst van functie). Dit omzeilt de variabiliteit die voortvloeit uit het gebruik van verschillende segmenten om controle- en experimentele omstandigheden te testen.
Kymografen gegenereerd uit de opgenomen film werden geanalyseerd, waaruit dynamische groeiparameters zoals uitstekende activiteit in de loop van de tijd en groeilengte gemakkelijk kunnen worden verkregen (figuur 6A). Merk op dat een eenvoudige aanpassing in de temporele resolutie van de time-lapse het mogelijk maakt om de axon-reksnelheid gedurende 2 uur te meten (figuur 6A). Bovendien kan de variatie van het volume van de groeikegel in de loop van de tijd - een maat voor de dynamische activiteit van de algemene groeikegel - gemakkelijk worden verkregen, in dit geval met gelicentieerde software (figuur 6B en figuur 6E, F). Dit kan worden gebruikt om de snelheid van actine loopband en de balans van filopodia / lamellipodia tijdens groeikegel verkennen activiteit te evalueren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig01.jpg"> Figuur 1: Schema's van de in het protocol gebruikte plasmiden. (A) pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen. (B) p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP. (C) pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-pA-lox-ZsGreen-pA. Relevante informatie over plasmidecomponenten en de oorsprong van fluorofoor is te vinden in de dozen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig02.jpg"> Figuur 2: Workflow van ex utero en in utero elektroporatie van E15.5 muizen. (A) Oprichting van een operatiepost voor ex utero-elektroporatie. (B) Opzetten van een operatiestation voor elektroporatie in utero. (C) Baarmoederhoorns getrokken buiten de buikholte van de verdoofde muis. D) Extractie van een embryo uit de baarmoederzak. E) embryooffer door volledige dwarslaesie van het ruggenmerg via een diagonale incisie; merk op dat onthoofding werd vermeden. (F) Plaatsing van het embryo in de houder en geïnjecteerd met DNA/Fast Green-mengsel in de linker laterale ventrikel. (G,H) Plaats het hoofd van het embryo tussen platina pincet elektroden met de kathode (rode pijl) over de cortex in een hoek van 60°. I) Plaatsing van de armen van het embryo (zwarte pijlen) buiten de houder om te voorkomen dat het embryo tijdens de procedure glijdt. (J) Rotatie van het embryo in de baarmoederzak om het hoofd bloot te leggen. (K,L) Injectie van DNA / Fast Green-mengsel in de laterale ventrikels van het embryo via de baarmoederwand. (M) Plaats het hoofd van het embryo tussen platina pincet elektroden met een kathode (rode pijl) over de cortex in een hoek van 60°. (N) Gehechte spierincisie via lopende vergrendelingsnaad. (O) Gehechte huidincisie via een onderbroken hechting. (P) Vastzetten van de wond met behulp van chirurgische wondclips en desinfectie met betadine. (Q) Plaatsing van de muis in de herstelkooi met ver-infrarood verwarmend licht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig03.jpg"> Figuur 3: Extractie van E15.5 en E12.5 hersenen en organotypische slice culture procedure. (A) Hulpmiddelen die worden gebruikt voor de hersenextractieprocedure. (B) Oprichting van een organotypisch kweekstation. (C-F) Extractie van E15.5 hersenen. (G-J) Extractie van E12.5 hersenen. Stippellijnen markeren de locatie van incisies. Rode pijlen wijzen de richting aan van het trekken met een tang. (K) Inbedding van de hersenen in een schaal van 3 cm met 3% laagsmolt agarose, waardoor een afstandsspleet van 1-2 mm onder de hersenen achterblijft. (L) Verzameling van 150 μm hersenschijf. (M) Plaatsing van hersenplakken op PTFE-membraaninzetstukken geïmmobiliseerd in een 35 mm schaal met behulp van paraffinefilm (blauwe pijl). Rode stermarkering duidt op een bepaalde verzameling hersenplakken van vibratome (L) en de overdracht ervan naar PTFE-membraan (M). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig04.jpg"> Figuur 4: Geconserveerde radiale gliacelstructuur in gezonde organotypische plakjes. Confocale beelden van E17.5 hersenplakken die RG-array (vimentine; groen) en algehele celorganisatie (DAPI; magenta) onthullen na IUE (A) en EUE (B, C). Let op de sterke verstoringen in de RG-array die af en toe het gevolg kunnen zijn van EUE (C). Vergrotingen komen overeen met de rode gestippelde kaders in de hoofdfiguur: schaalbalken, 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig05.jpg"> Figuur 5: In situ visualisatie van de groeikegeldynamiek in acute organotypische plakjes. (A,B) Neuronen en hun bijbehorende groeikegels gelabeld met respectievelijk Lyn-mNeonGreen en LifeAct-GFP. Rode ster markeert groeikegel van Lyn-mNeonGreen die neuron tot expressie brengt. Blauw sterretje dat de groeikegel van LifeAct-GFP markeert en neuron tot expressie brengt. (C) Naburige neuronen gelabeld met het dubbele plasmidesysteem dat tRFP (magenta) en ZsGreen (groen) en hun overeenkomstige groeikegels bevat. De afgebeelde groeikegels (rechts) bevonden zich buiten het vastgelegde kader (links), verkregen kort na het verkrijgen van de time-lapse van de groeikegel; schaalbalken, 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig6v2.jpg"> Figuur 6: Analyse van axongroeisnelheid en groeikegelvolume. (A) Axontracering op een neuron dat Lyn-mNeonGreen (boven) tot expressie brengt en de bijbehorende kymograaf (onder) gegenereerd met behulp van ImageJ. (B) Reconstructie van z-stack video van groeikegel met behulp van de beeldanalysesoftware (boven) en dezelfde groeikegel gemarkeerd met behulp van het meetinstrument voor oppervlakken (hieronder). (C) Grafieken die veranderingen in groeisnelheid in de loop van de tijd voor verschillende axonen laten zien. (D) De gemiddelde groeisnelheid van axonen wordt gekwantificeerd in (C). (E) Grafiek met de veranderingen in het volume van de groeikegel in de loop van de tijd. (F) Het gemiddelde volume van de groeikegels wordt gekwantificeerd in (E); schaalbalk, 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig6v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig07.jpg"> Figuur 7: Radiale migratie en neuronale polarisatie van piramidale corticale neuronen. Diagram ter illustratie van de ontwikkeling van piramidale corticale neuronen (roze) die radiaal migreren van de kiemventrikelzone (VZ) naar het pia-oppervlak. Geleid door radiale gliaprocessen (grijs), stellen migrerende gepolariseerde neuronen een leidend proces, toekomstig dendriet en trailingproces, toekomstig axon, vast dat zich naar beneden blijft uitbreiden naar de tussenzone (IZ). Onderbroken rode vakken vertegenwoordigen de corticale gebieden waar groeikegels werden afgebeeld. Specifiek in de IZ, subventriculaire zone (SVZ), of verbindende axonbundels (groen). De illustratie is gemaakt met een webgebaseerde tool, BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Plasmide</td>
			<td>Concentratie (μg/μL)</td>
			<td>Beoogd gebruik</td>
		</tr>
<tr>
<td>pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGroen</td>
			<td>0.25</td>
			<td rowspan="3">Etikettering van membraandoeleiwit (Lyn)</td>
		</tr>
<tr>
<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Tub-alfa-1-iCre</td>
			<td>0.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Tub-alfa-1-LifeAct-GFP</td>
			<td>0.125</td>
			<td>Etikettering van filamenteuze actine (F-actine) in groeikegels</td>
		</tr>
<tr>
<td>pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGroen</td>
			<td>1</td>
			<td rowspan="5">Onafhankelijke etikettering van twee populaties van naburige neuronen</td>
		</tr>
<tr>
<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Tub-alfa-1-iCre</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Tub-alfa-1-Dre</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Lijst van de in het protocol gebruikte plasmiden. Naam, concentratie en beoogd gebruik van elk gebruikt plasmide.
Aanvullende video 1: In situ visualisatie van de groeikegeldynamiek in acute organotypische plakjes. Dynamiek van groeikegels gelabeld met Lyn-mNeonGreen (linksboven) en LifeAct-GFP (linksonder). Naburige groeikegels zijn differentieel gelabeld met het dubbele plasmidesysteem met tRFP (magenta; rechtsboven) en ZsGreen (groen; rechtsonder). Beeldinterval, 2,5 s. Schaalbalken, 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/Supplementary_Video_1.mp4" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Dit protocol demonstreert een eenvoudige en robuuste methode om in situ axongroei en groeikegeldynamiek te bestuderen. Het beschrijft hoe ex vivo fysiologisch relevante acute hersenplakken kunnen worden bereid en biedt een gebruiksvriendelijke analysepijplijn.

In situ Visualisatie van Axon-groei en groeikegeldynamiek in acute ex vivo embryonale hersenplakculturen

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...

Hoe axonen navigeren door de complexe matrix van het centrale zenuwstelsel is een fundamentele vraag in de neurobiologie. Dit protocol maakt de studie van axongroei en groeikegeldynamiek in de fysiologische omgeving mogelijk met hoge resolutie beeldvorming. Dit protocol beschrijft een gebruiksvriendelijke end-to-end pijplijn voor de levering van DNA in het embryonale brein van muizen, preparaten voor hoogwaardige organotypische plakjes en een stapsgewijze handleiding voor beeldverwerving en -analyse.Hoewel oorspronkelijk ontworpen om axondynamica in het embryonale centrale zenuwstelsel te bestuderen, kon dit protocol worden aangepast om organotypische cultuur en visualisatie van axonplasticiteit na traumatische of pathologische omstandigheden mogelijk te maken. Het protocol zelf is relatief eenvoudig. Het bereiken van de eerste etikettering en het behoud van hersenstructuren zijn echter kritieke punten.Daarom vereisen de elektroporatie, hersendissectie en snijstappen extra zorg. Het demonstreren van de procedure zal nuttig zijn en de promovendus komt uit het laboratorium van Bracket. Na het verdoven van een zwangere vrouwelijke muis, maak een incisie om beide baarmoederhoorns eruit te trekken met behulp van een wattenstaaf gedrenkt in warme zoutoplossing of tang, waarbij zorgvuldig de ruimtes tussen de embryo's worden gegrepen.Plaats de embryo's vervolgens op nat gaas. Na het opensnijden van de baarmoederzak, verwijdert u elk embryo. Leg de embryo's in een schaal van 10 centimeter met HBSS aangevuld met glucose op ijs.Pak voor ex utero elektroporatie een embryo op en plaats het in de houder. Breng vervolgens voorzichtig het glazen capillair met het DNA-snelle groene mengsel door de embryoschedel in de laterale ventrikel en injecteer twee tot drie microliter van het DNA-plasmidemengsel in elke ventrikel. Houd vervolgens het hoofd van het embryo tussen platina pincetelektroden in de juiste hoek om het gewenste hersengebied te richten, waarbij de kathode naar het gebied is gericht waar de DNA-overdracht is bedoeld.Voor in utero-elektroporatie, na het uittrekken van de baarmoederhoorns en het plaatsen van de embryo's op een nat gaas zoals eerder aangetoond, gebruik vingertoppen om het embryo voorzichtig in de baarmoeder te draaien totdat de lambdoïdale en saggitale hechtingen zich bevinden. Breng vervolgens voorzichtig het glazen capillair met het DNA-snelle groene mengsel door de baarmoederwand en de embryoschedel in de laterale ventrikel in en injecteer twee tot drie microliter van het DNA-plasmidemengsel in een of beide ventrikels zoals gewenst met een maximum van twee microliter per ventrikel. Houd na de injectie het hoofd van het embryo tussen platina pincetelektroden in de juiste hoek om het gewenste hersengebied te richten met de kathode naar het gebied waar de DNA-overdracht is bedoeld.Zodra alle benodigde embryo's zijn geëlektropoteerd, gebruikt u een met zoutoplossing gedrenkt wattenstaafje om de baarmoederhoorns voorzichtig terug in de buikholte te plaatsen. Hecht de spier- en huidincisies met behulp van 5-0 hechtmateriaal, zet de wond vervolgens vast met hechtclips en desinfecteer de wond door deze te besproeien met betadine. Plaats de muis terug in de herstelkooi en houd de warmte vast met behulp van een ver-infrarood verwarmend licht gedurende ten minste 20 minuten na de procedure.Fixeer het hoofd van het embryo onder een dissectiemicroscoop. Verwijder vervolgens de huid in de schedel door langs de middellijn te snijden vanaf de basis van het hoofd naar de neus. Pel de huid in de schedel zijdelings af en maak een opening die groot genoeg is om de hersenen te kunnen wegsnijden.Om vervolgens de hersenen te verwijderen, plaatst u de gesloten punt van een steriele dissectieschaar die begint onder de reukbol en naar de hersenstam beweegt. Snijd vervolgens de hersenstam af en snijd veel losse stukjes hersenvliezen rond de hersenen af. Pak met een geperforeerde lepel de hersenen op en verwijder de overtollige vloeistof door de onderkant van de lepel tegen droog tissuepapier te deppen.Plaats vervolgens de hersenen in een agarose-schaal op ijs. Meng vervolgens met een kleinere lepel de agarose gedurende 10 seconden voor gelijkmatige afkoeling en manoeuvreer vervolgens de hersenen naar het midden van de schaal en plaats deze horizontaal met de dorsale kant naar boven en zorg ervoor dat deze volledig bedekt is met agarose vanuit alle richtingen. Pak het agaroseblok voorzichtig op van het Vibratome-werkstation en droog de bodem door tegen tissuepapier te deppen.Plaats het blok vervolgens op het gelijmde gebied van de monsterhouder met de rostrale kant van de hersenen naar boven gericht en zet de monsterhouder op ijs. Laat de lijm een minuut drogen. Snijd de hersenen in coronale plakjes onder een hoek van 15 graden.Gebruik vervolgens schone spatels, verzamel de hersenplakken en plaats ze op een PTFE-membraan geïmmobiliseerd in een 35 millimeter glazen bodemschaal met Parrafin. Verzamel tot vijf hersenschijfjes per membraan. Verwijder vervolgens met behulp van een pipet van 200 microliter de overtollige HBSS-glucoseoplossing rond de plakjes op het membraan en laat de plakjes halfdroog, voeg vervolgens 500 microliter voorgewarmde plakmedia rechtstreeks toe aan de ruimte onder het membraan en incubeer de plakjes bij 35 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.Voor het afbeelden van axongroei, lokaliseer een cortexgebied met een lage tot gemiddelde celdichtheid. Terwijl voor het afbeelden van de dynamiek van de groeikegel, een groeikegel in de onmiddellijke zone of subventriculaire zone van de cortex moet worden gelokaliseerd. Definieer vervolgens een Z-stapelgrootte.Stel voor axongroei in een grote Z-stack een stapgrootte van twee micrometer in en voor groeikegels in een kleinere Z-stack een stapgrootte van één micrometer. Voor gegevensanalyse opent u het afbeeldingsbestand in Fiji door op bestand te klikken, vervolgens te openen en de afbeelding te selecteren. Verkrijg de maximale intensiteitsprojectie van de timelapse door op de afbeelding te klikken, gevolgd door stapels, Z-projectie en maximale intensiteitsprojectie.Doorloop de timelapse en lokaliseer een groeiend axon. Eenmaal gelokaliseerd, trek je een lijn door het groeiende axon, beginnend vanaf de punt van het axon in het eerste frame en het axon volgend door de hele timelapse. Zing vervolgens de plug-in kymo re-slice wide.Stel de schaal van de kymograaf in door naar afbeelding en vervolgens naar eigenschappen te gaan. Nadat u de afstand in micrometers en pixelbreedte en de tijd in seconden of minuten en pixelhoogte hebt ingesteld, gaat u naar analyseren en klikken op meten. Om het volume van de groeikegel te meten, opent u het afbeeldingsbestand in de beeldanalysesoftware door op bestand te klikken, te openen en het gewenste bestand te selecteren.Selecteer vervolgens de wizard Nieuwe oppervlakken toevoegen in stap één, selecteer onder algoritme-instellingen alleen een interessant gebied segmenteren en in stap twee snijdt u het frame bij zodat het in alle frames op de volledige groeikegel past. Houd vervolgens in stap drie de drempel op absolute intensiteit en zorg er in stap vier voor dat het hele groeikegelgebied wordt gedrempeld. Selecteer vervolgens in stap vijf onder filtertype het aantal voxels LMG op één.Selecteer de knop Uitvoeren om alle aanmaakstappen uit te voeren en de wizard Nieuwe oppervlakken toevoegen te beëindigen. Selecteer ten slotte op het tabblad Statistieken boven aan het wizardvenster specifieke waarden en volume onder het gedetailleerde tabblad. Typisch, met succes gekweekte hersenplakken afgeleid van ofwel in utero of ex utero elektroporatie vertonen normale cellulaire distributie en een georganiseerde reeks radiale glia met apitisch georiënteerde pilo-contactprocessen.Af en toe wordt een ex utero elektroporatie waargenomen verstoringen in de radiale gliale steigers en gekweekte hersenplakken waardoor deze controlekleuring aan te bevelen is. Een representatief piramidaal corticale projecterend neuron dat Lyn-mNeonGreen en het dynamische gedrag van zijn groeikegel tot expressie brengt, wordt hier getoond. Bovendien werden neuronen gelabeld met behulp van een plasmide-expressie actinesonde om de actinedynamiek van axonale groeikegels in situ te analyseren.In situ experimenten werden ook uitgevoerd met een dual cre dre fluorofoor die plasmide-ontwerp tot expressie brengt, waarbij tRFP of ZsGreen fluoroforen specifiek en individueel kunnen worden geactiveerd door dre- of cre-recombinases, respectievelijk in naburige neuronen. Uit kymografen kunnen eenvoudig dynamische groeiparameters zoals groeisnelheid voor verschillende axonen en groeikegelvolume in de loop van de tijd worden verkregen. Dit kan worden gebruikt om de snelheid van actine loopband en de balans tussen filopodia en lamellapodia tijdens groeikegel verkennen activiteit te evalueren.Het is belangrijk om de hersenstructuur te behouden en plasmideconcentraties te verfijnen om schaarse etikettering te bereiken. Dit is cruciaal voor een nauwkeurige visualisatie van axonen en groeikegels in de cortex. Afhankelijk van de geselecteerde plasma's en genetische achtergrond, stelt dit protocol gebruikers in staat om neuronen of de omgeving waarin ze groeien te wijzigen, waardoor een breed scala aan studies mogelijk is.Door toegang met hoge resolutie tot neuronen in situ mogelijk te maken, stelt deze techniek neurowetenschappers in staat om de dynamische interactie tussen groeikegels en de metrieken van het centrale zenuwstelsel te ondervragen, zowel op morfologisch als moleculair niveau.

in-situ-visualization-axon-growth-growth-cone-dynamics-acute-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We presenteren een methode om organotypische plakjes van mid-dracht muis embryo's voor te bereiden op de teelt en de time-lapse imaging van perifere zenuwen uitgroei.

Organotypische Slice Cultuur van GFP-expressie muis embryo&#39;s voor real-time beeldvorming van perifere zenuwen uitgroei

Dit protocol beschrijft een organotypische slice assay geoptimaliseerd voor de postnatale hersenen en hoge-resolutie time-lapse beeldvorming van neuroblast migratie in de rostrale migratie stroom.

Een organotypische Slice Assay voor High-Resolution Time-Lapse Imaging van neuronale migratie in de postnatale Brain

This video demonstrates the ex vivo culture and imaging of oculomotor slices from transgenic mouse embryos. The embryos are isolated and embedded in agarose. Using a vibratome, slices containing the oculomotor nuclei and eyes are obtained. The slices are maintained in culture and imaged using a fluorescence microscope.

Ex Vivo Culture and Imaging of Oculomotor Slices from Transgenic Mouse Embryos

Source: Wiegreffe, C., et. al.,  Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (2017) This video demonstrates time-lapse confocal microscopy to observe cortical neuron radial migration from the subventricular zone to the cortical plate via radial glial scaffolds in transduced mouse embryonic brain slices.

Time-Lapse Imaging of Cortical Neuron Radial Migration in Transduced Mouse Embryonic Brain Slices

Neuroblast migratie is een fundamentele gebeurtenis in postnatale neurogenese. We beschrijven een protocol voor efficiëntie-etikettering van neuroblasts door in vivo postnatale elektroporatie en de daaropvolgende visualisatie van hun migratie met behulp van time-lapse imaging van acute hersenen plakjes. Wij beschikken over een beschrijving van de kwantitatieve analyse van neuroblast dynamiek door video-tracking.

In vivo Postnatale Elektroporatie en time-lapse imaging van neuroblast Migratie in Muis Acute Brain Slices

Progenitorceltransplanten mitose is een kritische parameter van neurogenese. Veel van onze kennis van neurale voorlopercellen mitose is gebaseerd op de analyse van vaste weefsel. Live-beeldvorming in de embryonale hersenen plakjes is een veelzijdige techniek om mitose te beoordelen met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie in een gecontroleerde omgeving.

Live-Imaging van mitose in het ontwikkelen van muis embryonale Cortex

Lichtmicroscooptechnieken gekoppeld aan biochemische analyses verduidelijken de betrokkenheid van SNARE-gemedieerde exocytose bij netrine-afhankelijke axonvertakking. Deze combinatie van technieken maakt identificatie mogelijk van moleculaire mechanismen die axonvertakking en celvormverandering controleren.

Gebruik makend van gecombineerde methoden om de rol van de plasmamembraan Delivery Tijdens Axon vertakking en neuronale Morphogenesis Definieer

Dit protocol geeft instructies voor directe observatie van radiaal migrerende corticale neuronen. Bij utero- elektroporatie, organotypische snijcultuur en tijdverlopen confocal beeldvorming worden gecombineerd om de effecten van overexpressie of downregulatie van genen die geïnteresseerd zijn in migrerende neuronen direct en dynamisch te bestuderen en hun differentiatie tijdens de ontwikkeling te analyseren.

Time-lapse Confocal Imaging van Migreren Neuronen in Organotypische Slice Cultuur van Embryonale Muishersenen Met behulp van<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporatie

Hier bieden we een goedkope en betrouwbare methode voor het genereren van electroporated brein organotypic segment culturen van muis embryo's geschikt voor confocale microscopie en live-imaging technieken.

Ex Utero Electroporation en Organotypic Slice culturen van muis embryonale hersenen voor Live-Imaging van GABAergic interneuronen migreren

Hier beschrijven we een protocol voor het visualiseren van motor neuron projectie en axon arborization in transgene Hb9::GFP muis embryo's. Na immunokleuring voor motorische neuronen, we gebruikten licht blad fluorescentie microscopie op afbeelding embryo's voor verdere kwantitatieve analyse. Dit protocol is van toepassing op andere neuron navigatie processen in het centrale zenuwstelsel.

Visualisatie van Motor Axon navigatie en kwantificering van Axon Arborization In muis embryo's met behulp van licht blad fluorescentie microscopie

Een ex vivo slice assay maakt het mogelijk om de zenuw uitgroei van de Oculomotor in real-time te laten afbeelen. Segmenten worden gegenereerd door het insluiten van E 10.5 ISLMN: GFP embryo's in agarose, snijden op een vibratome, en groeien in een podium-top incubator. De rol van Axon guidance trajecten wordt beoordeeld door remmers toe te voegen aan de cultuur media.

Ex vivo Oculomotor segment cultuur van embryonale GFP-uitdrukken van muizen voor timelapse-beeldvorming van Oculomotor zenuw uitgroei

Leer axon-groei en groeikegeldynamiek bestuderen in acute ex vivo embryonale hersenplakculturen van muizen. Deze methode maakt hoogresolutiebeeldvorming mogelijk voor inzicht in neurale ontwikkeling en plasticiteit.

In situ Visualisatie van Axon-groei en groeikegeldynamiek in acute ex vivo embryonale hersenplakculturen

Meer video's verkennen